一種控制甘薯胚性愈傷組織增殖速度的方法與流程
2023-10-06 21:51:54
本發明屬於農業
技術領域：
，具體涉及一種控制甘薯胚性愈傷組織增殖速度的方法。
背景技術：
：甘薯是一種重要的糧食、飼料、工業原料和能源作物。近些年，隨著全球石油供給形勢的日益嚴重，生物質能源的開發和利用日益重要。甘薯單位面積澱粉產量高，被認為是生產燃料乙醇的理想原料。甘薯作為新型的能源用植物，其市場潛力巨大，它將在我國能源安全中扮演重要的角色。甘薯在遺傳上高度雜合，種內、種間雜交不親和以及遺傳資源匱乏，遺傳基礎狹窄，病蟲害、病毒病危害嚴重，制約了甘薯品種的遺傳改良。近年來，利用生物工程(甘薯轉基因、誘變育種等)改良甘薯的品質、抗病蟲性等性狀已引起廣泛的重視。能否成功將這一方法應用於甘薯改良，其關鍵是建立高效的甘薯再生系。劉慶昌(1996)在農業生物技術學報發表文章對甘薯胚性懸浮培養的研究表明：懸浮培養24周後得到的細胞團，其植株再生率在慄子香、高自1號和高系14號均達到100％。懸浮28周後，慄子香和高自1號的植株再生率仍為100％，高系14號再生率為85.7％。懸浮37周後，慄子香、高自1號和高系14號的植株再生率分別降至45.8％、83.3％和79.2％。從上面結果可以看出甘薯胚性愈傷的胚性保持時間隨著懸浮時間的延長再生率降低。這就需要每年都剝取莖尖誘導製備胚性愈傷，而胚性愈傷的增殖速度與實際需求也可能不完全符合。技術實現要素：本發明的一個目的是提供一種甘薯胚性細胞的懸浮培養方法。本發明的甘薯胚性細胞的懸浮培養方法為如下(1)或(2)：(1)將甘薯胚性愈傷組織在ms培養基中進行懸浮培養，得到甘薯胚性細胞；所述(1)中的懸浮培養條件為以小於100rpm的轉速進行振蕩培養；(2)將甘薯胚性愈傷組織在ms培養基中進行懸浮培養，得到甘薯胚性細胞；所述(2)中的懸浮培養條件為以100rpm的轉速進行振蕩培養。上述方法中，所述小於100rpm的轉速可以為95rpm、90rpm、85rpm、80rpm、75rpm、70rpm、65rpm或60rpm等小於100rpm的轉速。在本發明的具體實施例中，所述小於100rpm的轉速為70rpm。上述方法中，所述ms培養基是將2,4-d、蔗糖和ms基礎培養基混勻得到的液體培養基；所述2,4-d在所述ms培養基中的濃度為2.0mg/l；所述蔗糖在所述ms培養基中的質量分數均為3.0％。上述方法中，所述甘薯胚性愈傷組織是將甘薯莖尖組織進行誘導培養得到的。在本發明的具體實施例中，所述莖尖組織長約0.5mm。所述甘薯胚性愈傷組織是將甘薯莖尖組織在ms固體培養基中誘導培養得到的。所述ms固體培養基是將瓊脂與上述ms培養基混勻得到的培養基，所述瓊脂在所述ms固體培養基中的質量分數為0.8％。上述方法中，所述懸浮培養條件為27±1℃，每日13h、500lux光照。上述方法中，所述振蕩培養為水平振蕩培養。上述方法中，所述甘薯選自地方品種、選育品種、品系或國外引進品種；所述甘薯的品種具體為鄂薯6號。上述方法中，所述(1)中的懸浮培養方法，培養物約14天繼代1次，6-10周可以使胚性愈傷組織生長至生長旺盛、增殖迅速、色澤亮黃、表面結構緻密的胚性細胞懸浮狀態；所述(2)中的懸浮培養方法，培養物約7天繼代1次，4-8周可以使胚性愈傷組織生長至生長旺盛、增殖迅速、色澤亮黃、表面結構緻密的胚性細胞懸浮狀態。在實際應用中，實驗人員可根據需要選擇轉速條件，來控制胚性愈傷組織的增殖速度。本發明的另一個目的是提供上述方法製備得到的甘薯胚性細胞。本發明還有一個目的是提供上述方法的新用途。本發明提供了上述方法在控制甘薯胚性愈傷組織的增殖速度中的應用。本發明還提供了上述方法在控制甘薯胚性愈傷組織的植株再生率中的應用。上述方法或上述甘薯胚性細胞在甘薯植株再生中的應用也屬於本發明的保護範圍。本發明提供了一種控制甘薯胚性愈傷組織增殖速度的方法。本發明的方法包括植物材料的選取、胚性愈傷組織的誘導、胚性細胞懸浮培養系的建立和胚性細胞懸浮培養速度的控制。通過實驗證明：胚性愈傷組織在不同轉速條件下具有不同的增殖速度和植株再生率，可通過控制轉速大小來控制胚性愈傷組織的增殖速度和植株再生率。本發明的方法工藝流程簡單，且胚性愈傷增殖速度可以控制，不僅彌補胚性愈傷的增殖速度跟實際需求不符的技術難題，並且隨時可為甘薯的誘變育種和轉基因提供大量的胚性愈傷材料。具體實施方式下述實施例中所使用的實驗方法如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業途徑得到。下述實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。下述實施例中的甘薯品種「鄂薯6號」：記載於「蘇文瑾,王連軍,雷劍等.激素組合對甘薯鄂薯6號莖尖愈傷組織誘導及植株再生的影響.湖北農業科學.2012年第51卷第23期」一文，公眾可從申請人處獲得，僅可用於重複本發明實驗使用。下述實施例中的ms基礎培養基的配方如表1所示。表1、ms基礎培養基的配方(ph5.8)培養基組成含量mg/l藥品mg/母液ml稀釋倍數每升培養基加入量(ml)nh4no31650——————kno31900——————kh2po4170——————mgso4·7h2o370——————cacl2·2h2o440——————mnso4·4h2o22.355810010znso4·7h2o8.6215/25010010h3bo36.262010001ki0.838310001na2moo4·2h2o0.2525/10010001cuso4·5h2o0.02525100000.1cocl2·6h2o0.02525/100100000.1na2edta·2h2o37.237452005feso4·7h2o27.85557/1002005甘氨酸2.0100/5010001鹽酸硫胺素0.420/5010001鹽酸吡哆醇0.525/5010001尼克酸0.525/5010001肌醇1002500/25010010實施例1、一種控制甘薯胚性愈傷組織增殖速度和植株再生率的方法一、植物材料的獲取選取溫室健壯無病的甘薯品種鄂薯6號為實驗材料。二、胚性愈傷組織的誘導剝取長約0.5mm的甘薯品種鄂薯6號的莖尖組織，將其培養在ms-2固體培養基(ph5.8)上，培養條件為27±1℃，黑暗，培養6-10周後，莖尖分生組織陸續形成胚性愈傷組織。上述ms-2固體培養基(ph5.8)是將2,4-d、蔗糖、瓊脂和ms基礎培養基混勻得到的培養基，其中，2,4-d在ms-2固體培養基中的濃度為2.0mg/l，蔗糖在ms-2固體培養基中的質量分數為3.0％，瓊脂在ms-2固體培養基中的質量分數為0.8％。三、胚性細胞的懸浮培養1、不同轉速條件下的胚性細胞的懸浮培養將步驟二得到的胚性愈傷組織轉入添加30mlms-1液體培養基(ms-1液體培養基是將2,4-d、蔗糖和ms基礎培養基混勻得到的培養基，其中，2,4-d在ms-1液體培養基中的濃度為2.0mg/l，蔗糖在ms-1液體培養基中的質量分數為3.0％)的三角瓶(100ml)中，置於水平搖床進行水平振蕩培養，培養條件為27±1℃，每日13h、500lux光照。根據搖床轉速不同分為如下兩個實驗組：(1)低轉速組：置於水平搖床以70rpm的轉速進行水平振蕩培養；(2)高轉速組：置於水平搖床以100rpm的轉速進行水平振蕩培養。2、不同轉速條件下的胚性細胞的懸浮培養結果(1)增殖速度胚性愈傷組織在低轉速組的條件下進行懸浮培養，培養物約14天繼代1次，6-10周可以使胚性愈傷組織生長至生長旺盛、增殖迅速、色澤亮黃、表面結構緻密的胚性細胞懸浮狀態。胚性愈傷組織在高轉速組的條件下進行懸浮培養，培養物約7天繼代1次，4-8周可以使胚性愈傷組織生長至生長旺盛、增殖迅速、色澤亮黃、表面結構緻密的胚性細胞懸浮狀態。建立成功的胚性細胞懸浮在其生長過程中需要進行繼代培養，在高轉速組下需要7天繼代一次，在低轉速組下需要14天繼代一次。說明胚性愈傷組織在不同轉速條件下具有不同的增殖速度，可通過控制轉速大小來控制胚性愈傷組織的增殖速度。(2)植株再生率將胚性愈傷組織轉移到ms-3固體培養基(ms-3固體培養基是將aba、蔗糖、瓊脂和ms基礎培養基混勻得到的培養基，其中，aba在ms-3固體培養基中的濃度為1.0mg/l，蔗糖在ms-3固體培養基中的質量分數為3.0％，瓊脂在ms-3固體培養基中的質量分數為0.8％)上進行誘導培養，誘導培養為27±1℃，每日13h、3000lux的光照。誘導培養2-4周後，將變綠的成熟體細胞胚轉移至ms固體培養基(ms固體培養基是將蔗糖、瓊脂與ms基礎培養基混勻得到的培養基，蔗糖在ms固體培養基中的質量分數為3.0％，瓊脂在ms固體培養基中的質量分數為0.8％)，培養條件為27+1℃，每日13h、3000lux的光照。培養4-8周後，即可再生出完整植株，培養條件為27+1℃，每日13h、3000lux的光照。結果表明：鄂薯6號胚性愈傷組織在100rpm轉速下，37周再生率僅為80％，文獻中也提到甘薯胚性愈傷組織在100rpm轉速的條件下懸浮37周後，部分材料的植株再生率顯著降低。但鄂薯6號胚性愈傷組織在70rpm轉速的條件下懸浮培養，由於生長速度較慢，37周再生率仍能達到100％，說明降低懸浮培養的轉速有利於提高植株再生率。因此，可通過控制轉速大小來控制甘薯胚性愈傷組織的植株再生率。綜上所述，甘薯胚性愈傷組織在不同轉速條件下具有不同的增殖速度和植株再生率，可通過控制轉速大小來控制胚性愈傷組織的增殖速度和植株再生率。當前第1頁12