一種松材線蟲m型和r型株系的pcr-rflp鑑別方法
2023-08-08 07:01:26 1
專利名稱：一種松材線蟲m型和r型株系的pcr-rflp鑑別方法
技術領域：
本發明涉及松材線蟲的PCR-RFLP鑑別技術；具體涉及一種松材線蟲M型和R型株系的PCR-RFLP鑑別方法。
背景技術：
松材線蟲Bursaphelenchus xylophilus是世界各國關注的重要危險性線蟲，是松林的「頭號殺手」，目前中國、韓國、歐盟、澳大利亞、紐西蘭等許多國家都將松材線蟲列為檢疫對象。擬松材線蟲B. mucronatus與松材線蟲十分相似，主要形態區別是一般認為雌蟲尾端指狀，尾尖突長達3.5μπι以上的為擬松材線蟲；雌蟲尾端寬圓，無尾尖突或尾端指狀， 尾尖突長Ιμπι左右(不超過2μπι)的為松材線蟲。1983年，Wingfield等報導從美國明尼蘇達和威斯康辛州的冷杉中發現松材線蟲M型株系(mucronate form of B. xylophilus), 其雌蟲有明顯的尾尖突，形態特徵更接近擬松材線蟲。目前研究表明松材線蟲種內可分為 M型株系和R型株系(round-tailed form of B. xylophilus) ；R型株系群體內總有一些雌蟲尾部鈍圓，無尾尖突；而M型株系群體內所有雌蟲均有明顯的尾尖突，與擬松材線蟲很難區分。如果單純使用形態學鑑定方法，松材線蟲M型株系很可能被鑑定為擬松材線蟲，導致漏檢，從而可能導致松材線蟲的傳播與擴散，對林業生產造成巨大威脅。PCR-RFLP(限制性片段長度多態性)鑑定技術是利用生物體內線粒體、核糖體等標記基因特徵進行分子生物學區分，如斑潛蠅和巨蠣屬牡蠣PCR-RFLP鑑別技術。而線蟲核糖體DNA內部轉錄間隔區 (ITS)序列進化速率較快，已用於線蟲種及種內分類鑑別研究，目前公開的松材線蟲及其近似種的PCR-RFLP鑑別，是選用Rsa I、Hae III、Msp I、HinfI和Alu I這5種限制性內切酶酶切，雖然能區分松材線蟲和擬松材線蟲，但不能區分松材線蟲M型和R型株系。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種能區分鑑別松材線蟲M型和R型株系的 PCR-RFLP鑑別方法，為檢疫鑑定及處理提供了保障。本發明解決上述技術問題所採用的技術方案為一種松材線蟲M型和R型株系的 PCR-RFLP鑑別方法，通過對大量不同來源松材線蟲和擬松材線蟲株系的ITS區序列測定， 通過DNAstar中的MapDraw軟體分析，通過大量的對比試驗，選取出區對松材線蟲株系區分明顯的限制性內切酶組合；隨後進行線蟲基因組DNA提取和目的片段的PCR擴增，最後利用選取的內切酶對PCR產物進行酶切和瓊脂糖凝膠電泳檢測，其特徵在於包括下述步驟a、DNA提取將單條松材線蟲挑入含有1 μ 1 10XPCR Buffer溶液(購自TaKaRa 公司)的PCR管中，先13000rpm離心lmin，再置於液氮中速冷lmin，取出後立即在85°C條件下恆溫2min，再立即將PCR管的溫度速降至56°C，恆溫30sec，在PCR管中加入濃度為Img/ mL的蛋白酶K溶液1 μ 1 (購自TaKaRa公司)，PCR管先在56°C下恆溫15min，再在95°C條件下恆溫lOmin，得到DNA提取液，-20°C保存備用；PCR Buffer溶液(Mg2+free)包括pH8. 3 的 Tris-HCl 溶液 lOOmM，KCl 溶液 500mM ；
b、PCR擴增PCR擴增為50 μ 1反應體系，包含10XPCR buffer溶液緩衝液5 μ 1、 濃度為50mmol/L的MgCl2溶液5 μ 1、濃度為10mmol/L的dNTP溶液4 μ 1 (購自TaKaRa公司)、濃度為40 μ mol/L的上遊引物3 μ 1、濃度為40 μ mol/L的下遊引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ l、ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6U (購自TaKafci公司)；擴增反應條件為94°C 預變性:3min ；94°C變性40S，55°C退火50S，72°C延伸2min，共35個循環；最後一個循環結束後，72°C延伸lOmin，得到PCR產物；所述上遊引物為通用引物5' -CGT AAC AAG GTAGCT GTA G-3'，下遊引物為通用引物5' -TTT CAC TCG CCG TTA CTAAGG-3'；C、酶切反應將上述PCR產物6μ 1U0XPCR Buffer溶液1 μ 1、去離子水2. 5 μ 1、 HhaI酶0. 5 μ 1 (購自TaKaRa公司)置於PCR管中，放入PCR儀，37°C保溫條件下酶切反應池，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察、拍照，獲得PCR-RFLP帶譜；d、帶譜鑑別上述PCR-RFLP帶譜中若最大條帶為467bp，則為松材線蟲M型株系 II，若最大條帶為357bp或35^ρ，則用Hpyl88I酶(購自TaKaRa公司)替換HhaI酶再重複上述酶切反應，若PCR-RFLP帶譜中最大條帶為492bp，則為松材線蟲M型株系I，帶譜中最大條帶為743bp或741bp，則為松材線蟲R型株系。與現有技術相比，本發明的優點在於一種松材線蟲M型和R型株系的PCR-RFLP鑑別方法，通過DNA提取、PCR擴增、HhaI酶或和Hpyl88I酶酶切反應及帶譜鑑別，若HhaI酶酶切反應獲得PCR-RFLP帶譜最大條帶為467bp，則為松材線蟲M型株系II，最大條帶為357bp 或358bp，則再用HpylSSI酶酶切反應，若帶譜最大條帶為492bp，則為松材線蟲M型株系I ； 若帶譜最大條帶為743bp或741bp，則為松材線蟲R型株系；這樣就能很明顯區分松材線蟲 M型株系和松材線蟲R型株系，為檢疫鑑定及處理提供了保障。
具體實施例方式以下結合實施例對本發明作進一步詳細描述。實施例1、DNA提取在滅菌的潔淨載玻片上加適量滅菌的雙蒸水，用滅菌的0號針將單條松材線蟲(分別為M型株系I、II和R型株系I、II)挑入水滴中，再將松材線蟲挑入內含 8μ1 雙蒸水和 Ιμ 10 X PCRBuffer 滅菌的 200 μ 1 PCR 管中，13000rpm 離心 lmin，然後置於液氮中速冷lmin，取出，立即在85°C下恆溫放置2min，迅速降溫至56°C ；然後向PCR 管中加入濃度為lmg/mL的蛋白酶K溶液1μ 1，PCR管在56°C下恆溫15min，再在95°C恆溫 lOmin，得到DNA提取液；2、PCR擴增採用50 μ 1反應體系，上遊引物為5' -CGT AAC AAG GTA GCT GTA G-3『，下遊引物為5 『 -TTT CAC TCG CCG TTACTAAGG-3 『(上下遊引物購自TaKaRa公司)， 擴增反應體系為10XPCR-buffer溶液5 μ 1、濃度為50mmol/L的MgCl2溶液5 μ 1、濃度為 IOmmol/L的dNTP溶液4 μ 1、濃度為40 μ mol/L的上遊引物3 μ 1、濃度為40 μ mol/L的下遊引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ 1、ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6U ；擴增反應條件為 94°C預變性:3min ；94°C變性40S，55°C退火50S，72°C延伸2min，共35個循環；最後一個循環結束後，72°C延伸IOmin ；獲得的PCR產物，松材線蟲的片段長度為920bp_930bp ；3、酶切反應將上述PCR產物6μ 1U0XPCR Buffer溶液1 μ 1、去離子水2. 5 μ 1 置於 PCR 管中共 7 管，分別用 0. 5μ 1 Rsa I、HaeIII、Msp I、HinfI、Alu I、HhaI 和 Hpyl88ICN 102229993 A
說明書
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酶酶切，放入PCR儀，37°C保溫條件下酶切反應池，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察、拍照，獲得PCR-RFLP帶譜，瓊脂糖凝膠電泳條件10μ 1酶解液與2 μ 1的6Χ上樣緩衝液混勻，上樣2. 5%瓊脂糖凝膠中，於75V穩壓下電泳，電泳緩衝液為1 ΧΤΑΕ，電泳時間約為2. 5h(2-3h)，電泳結束後，於0. 的EB溶液中染色10-15min，之後在紫外燈下觀察、拍照。4、帶譜鑑別如表1所示，若未知為松材線蟲或判斷不清，應首先觀察Rsa I、 HaeIIKMsp I、HinfI和Alu I的酶切帶譜，是否與表1中一致，以確定為松材線蟲。再看HhaI酶切帶譜和HpylSSI酶酶切帶譜，HhaI酶切帶譜若最大條帶為467bp，則為松材線蟲M型株系II ；若最大條帶為357bp或358bp，可以初步鑑別當200bp(201bp)與 357bp (358bp)之間有223bp或的條帶，則為R型株系(其中有的條帶為R型株系I，有22!3bp的條帶為R型株系II)；當200bp(201bp)與357bp (358bp)之間無任何條帶，則為M型株系I。為了準確鑑別，再觀察HpylSSI酶酶切帶譜，若最大條帶為492bp，則為松材線蟲M型株系I，其帶譜為492bp+252bp+l 10bp+72bp ；若最大條帶為743bp或741bp， 則為松材線蟲R型株系，其中帶譜為74;3bp+110bp+72bp是松材線蟲R型株系I，帶譜為 741bp+110bp+71bp是松材線蟲R型株系II，這樣松材線蟲M型株系與R型株系的最大條帶差異較大，區分明顯，不會出現混同現象，達到準確鑑別目的。而從表1中可以看出Rsa I、 Haelll.MspI,Hinfl.Alu I酶酶切帶譜中松材線蟲M型株系和松材線蟲R型株系之間差異極小，無法鑑別M型和R型株系，因此本發明的方法能準確鑑別松材線蟲M型株系和R型株系。表1松材線蟲M型和R型株系各限制性內切酶酶切帶譜對比表(bp)
Rsa IHaelllMsp IΗ ηΓ IAlu IHha IHpyl88iR型株系 I483+420+ 22728+197562+363263+232+ 142+139+ 125+24433-256+ 142-96357+262+ 200+106743+110+ 72R型株系 II483+417+ 22725+197562+360263+232+ 141+139+ 122+25432-238+ 143-96+13357+223+ 200+107+ 35741+110+ 71M型株系 I486+417+ 23728+198566+360266+232+ 142+138+ 123+25437-237+ 142-96+14358+200+ 140+121+ 107492+252+ 110+72M型株系 II484+420+ 22728+198563+363263+232+ 142+139+ 125+25433-241+ 143-96+13467+258+ 201744+110+ 72 總之在實際檢測中，若未知是松材線蟲還是擬松材線蟲等，就可以先用形態學或 RsaI,HaeIIKMsp I.Hinf I、Alu I等酶先鑑別是不是松材線蟲，再用本發明的方法鑑別是不是松材線蟲M型或R型株系，若已知是松材線蟲，就用本發明的方法直接鑑別株系。
權利要求
1. 一種松材線蟲M型和R型株系的PCR-RFLP鑑別方法，其特徵在於包括下述步驟 a、DNA提取將單條松材線蟲挑入含有1μ 1 10XPCR Buffer溶液的PCR管中，先13000 rpm離心1 min，再置於液氮中速冷1 min，取出後立即在85°C條件下恆溫2 min，再立即將 PCR管的溫度速降至56°C，恆溫30 sec，在PCR管中加入濃度為1 mg/mL的蛋白酶K溶液 1μ 1，PCR管先在56°C下恆溫15 min，再在95°C條件下恆溫10 min，得到DNA提取液，_20°C 保存備用；b、PCR擴增PCR擴增為50 μ 1反應體系，包含10XPCR buffer溶液緩衝液5 μ 1、 濃度為50 mmol/L的MgCl2溶液5μ 1、濃度為10 mmol/L的dNTP溶液4 μ 1、濃度為40 μ mol/L的上遊引物3 μ 1、濃度為40 μ mol/L的下遊引物3 μ 1、上述DNA提取液10 μ 1、 ddH2019. 4 μ 1和Taq聚合酶0. 6 U ；擴增反應條件為94°C預變性3 min ；94°C變性40 S， 55°C退火50 S，72°C延伸2 min，共；35個循環；最後一個循環結束後，72°C延伸10 min，得到PCR產物；所述上遊引物為通用引物5'- CGT AAC AAG GTA GCT GTA G _3'，下遊引物為通用引物5' - TTT CAC TCG CCG TTA CTA AGG -3，；c、酶切反應將上述PCR產物6μ 1、10XPCR Buffer溶液1 μ 1、去離子水2. 5 μ 1、貓aI 酶0. 5 μ 1置於PCR管中，放入PCR儀，37°C保溫條件下酶切反應3 h，然後進行瓊脂糖凝膠電泳，在紫外燈下觀察、拍照，獲得PCR-RFLP帶譜；d、帶譜鑑別上述PCR-RFLP帶譜中若最大條帶為467bp，則為松材線蟲M型株系II，若最大條帶為357bp或358bp，則用母y488I酶替換貓al酶再重複上述酶切反應，若PCR-RFLP 帶譜中最大條帶為492bp，則為松材線蟲M型株系I，若帶譜中最大條帶為743bp或741bp， 則為松材線蟲R型株系。
全文摘要
本發明公開了一種松材線蟲M型和R型株系的PCR-RFLP鑑別方法，通過DNA提取、PCR擴增、HhaI酶或和Hpy188I酶酶切反應及帶譜鑑別，若HhaI酶酶切反應獲得PCR-RFLP帶譜最大條帶為467bp，則為松材線蟲M型株系II，最大條帶為357bp或358bp，則再用Hpy188I酶酶切反應，若帶譜最大條帶為492bp，則為松材線蟲M型株系I；若帶譜最大條帶為743bp或741bp，則為松材線蟲R型株系；這樣就能很明顯區分松材線蟲M型株系和松材線蟲R型株系，為檢疫鑑定及處理提供了保障。
文檔編號C12Q1/68GK102229993SQ201110141018
公開日2011年11月2日 申請日期2011年5月27日 優先權日2011年5月27日
發明者王江嶺, 顧建鋒 申請人:寧波檢驗檢疫科學技術研究院