丹皮有效組分、製劑及製備方法與用途的製作方法
2023-08-08 14:12:21
專利名稱：丹皮有效組分、製劑及製備方法與用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種治療心血管疾病的中藥提取物，具體地說涉及從丹皮中提取的有效組分，製劑及其製備方法與用途，該有效組分主要含有苯甲醯芍藥苷(Benzoylpaeoniflorin)。
背景技術：
冠心病和心絞痛是危害人類健康的「第一殺手」，近年來，隨著我國人口老年化以及人們工作、生活、飲食結構及環境等的變化，冠心病等心腦血管疾病的發生率也逐年增多，嚴重威脅著人民的身心健康。天然產物中許多活性物質具有抗心肌缺血、缺氧作用，其中一些已開發成治療冠心病和心絞痛的新藥，如治療冠心病的藥物地奧心血康，它是由從中藥中提取的8種甾體皂甙製成的純中藥製劑；心達康是以沙棘為原料提取加工而成的純天然藥物，其有效成分為沙棘總黃酮。因而從天然產物中尋找具有抗心肌缺血、缺氧生理活性的有效物質，是發現、開發新藥的有效途徑之一。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用於開發成治療冠心病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗心肌缺血，用於治療冠心病和心絞痛的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。
丹皮又名牡丹皮，系雙子葉植物藥毛茛科植物牡丹(Paeonia suffruticosa Andr.)的根皮。分布河北、河南、山東、四川、陝西、甘肅等地。全國各地均有栽培，藥材主產安徽、四川、甘肅、陝西、湖北、湖南、山東、貴州等地，此外，雲南、浙江亦產。其性微寒，味辛苦，涼，入心、肝、腎經，具有清熱，涼血，和血，消瘀的功效。丹皮炮製最早見於我國梁代陶宏景所撰《集注》中，認為「皆促破，去心。」《本草綱目》等醫書中記載「丹皮木心不入藥，需去之。」研究表明丹皮含丹皮酚(Paeonol)、芍藥甙(Paeoniflorin)、羥基芍藥甙、苯甲醯芍藥甙(Benzoylpaeoniflorin)、苯甲醯羥基芍藥甙、芍藥苷元(Paeoniflorigenone)、6-羥基香豆素(6-hydroxycoumarin)和沒食子酸(Gallic Acid)，以及苯甲酸、植物甾醇、蔗糖、葡萄糖、阿拉伯糖等。揮髮油中含有苯甲酸(Benzoic Acid)、十四烷烴(Tetradecane)、2-羥基-4-甲氧基-苯乙酮(2-hydroxy-4-methoxy acetophenone)、2，6-雙特丁基對苯醌(2，6-ditert-butyl-p-Benzoquinone)、鄰苯二甲酸二乙酯(Diethyl Phthalate)、十四酸異丙酯(Isopropyl Myristate)等化合物(陳悅嬌等，廣州食品工業科技，2002，18(4)36-37)。吳少華等人首次從丹皮中分離得到了以下五種化合物白樺脂酸(Betulinic Acid)、白樺脂醇(Betulin)，齊墩果酸(OleanolicAcid)、3β，23-dihydroxy-30-norolean-12，20(29)-dien-28-oic acid、3-O-methylpaeonisuffral(吳少華等，中草藥，2002，33(8)679-680)。
丹皮對實驗性心肌缺血有減輕損傷程度作用，並能夠降低心肌耗氧量，增加冠脈流量，認為丹皮有調節血行，疏通血脈之作用，因而對心肌缺血有保護作用(馬玉玲等，山西醫藥雜誌，1984，13(4)212-214)。
發明內容
本發明的目的在於提供一種丹皮有效組分。
本發明的另一目的在於提供該丹皮有效組分的製備方法及其用途。
本發明還提供了包含丹皮有效組分的製劑。
本發明以如下技術方案予以實施本發明的丹皮有效組分中，主要含有苯甲醯芍藥苷。其中，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為80～95％。
優選的，本發明的丹皮有效組分中，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為83～92％。
最佳的，本發明的丹皮有效組分中，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為88～90％。
本發明的丹皮有效組分的製備方法包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。
優選的，本發明的丹皮有效組分的製備方法包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(8～13∶1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。
最佳的，本發明的丹皮有效組分的製備方法包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(10∶1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為80％的水溶液、流動相B為20％的乙腈溶液；40分鐘時，流動相A為20％的水溶液、流動相B為80％的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5％的水溶液、流動相B為95％的乙腈溶液；流速為3ml/min，柱溫為室溫；樣品用100％乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段21.8～26.5min收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。
本發明的丹皮有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的輔料，按照藥劑學上記載的製劑的製備方法製成製劑。
本發明的丹皮有效組分還可以作為活性成分之一，加入藥劑學上接受的輔料，按照藥劑學上記載的製劑的製備方法製成製劑。
所述的製劑包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、衝劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。
本發明的丹皮有效組分及其製劑可在製備治療、預防心血管疾病藥物中進行應用。
本發明的有益效果為1.本發明的提取分離工藝中使用了正相矽膠柱，能有效地除去糖、蛋白質、胺基酸等雜質，提高有效成分的含量，同時採用了製備色譜，能快速準確的得到有效成分。
2.本發明提供的丹皮有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易於闡明其作用機制，在生產中更易於藥物的質量控制。
圖1為本發明丹皮有效組分的HPLC分析圖。
具體實施例方式
下面將結合實施例進一步詳細說明本發明的實質內容和有益效果，該實施例僅用於說明本發明而非對本發明的限制。
實施例一 丹皮有效組分的製備將200g丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏16.8g，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品3.9g；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100％乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段21.8～26.5min收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.33g。
實施例二 丹皮有效組分的製備將500g丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1∶0.8～1.2)，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏42g，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(47～53∶1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(8～13∶1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品11.8g；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。樣品用100％乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段21.8～26.5min收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.79g。
實施例三 丹皮有效組分的製備取丹皮藥材250g，將其粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1∶1)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合併得提取液。將提取液濃縮成浸膏得22g，將浸膏和矽膠拌樣，用正相矽膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50∶1)作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(10∶1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮乾燥後得6.2g樣品。用製備液相色譜繼續分離得到的樣品。製備色譜的分離條件色譜柱為漢邦半製備柱(Lichrospher C18；10.0mm×250mm，5μm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，洗脫梯度見表2，流速為3ml/min，柱溫為室溫。樣品用100％乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段21.8～26.5min收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.44g。
實施例四 丹皮有效組分的分析(1)丹皮提取物中苯甲醯芍藥苷的含量測定(高效液相色譜法)色譜條件色譜柱Agilent Zorbax SB-C18柱(4.6mm×150mm，5μm)；採用梯度洗脫，流動相A相為0.2％冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2％冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為90％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為10％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為50％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5％的0.2％冰醋酸水溶液、流動相B為95％的0.2％冰醋酸的乙腈溶液；流速0.5mL·min-1；檢測波長全波長；柱溫30℃；ELSD條件漂移管溫度100℃；氮氣流速1.4L/min。
供試品溶液的製備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。
測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，測定，即得。
(2)上述丹皮提取物HPLC-ELSD指紋圖譜測定方法參見(1)上述丹皮提取物中的苯甲醯芍藥苷含量測定(高效液相色譜法)。記錄色譜時間為30分鐘。
分析結果丹皮有效組分的HPLC-ELSD分析譜圖見圖1。圖1中的1號峰為苯甲醯芍藥苷。
本發明中，苯甲醯芍藥苷的結構式為 實施例五 滴丸的製備取實施例三的丹皮有效組分0.4g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料後移至滴丸滴灌中，藥液滴至6～8℃液體石蠟中，除油，製得滴丸400粒。
實施例六 凍乾粉針劑的製備取實施例三的丹皮有效組分0.4g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水1ml，上述組分混合均勻後，冷凍乾燥，分裝500支，即得。
實施例七 凍乾粉針劑的製備取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基β-環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾液低溫乾燥得降香油和羥丙基β-環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基β-環糊精的包合物粉末外，再取實施例三的丹皮提取物0.4g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻後，冷凍乾燥，分裝300支，即得。
實施例八 丹皮有效組分的藥理實驗1藥理模型乳鼠心肌細胞缺血缺氧模型原代心肌細胞培養出生1～3天SD乳鼠處死後，取心臟，經PBS液清洗後減成1mm3左右的碎塊。用0.125％胰蛋白酶(Sigma，USA)+0.05％膠原酶II(Gibco，USA)於37度消化3～4次。差速貼壁法分離成纖維細胞1.5小時後，細胞懸液轉移至48孔板中(每孔約4×105細胞)。經DMEM(Gibco，USA)加10％胎牛血清(Falcon，USA)培養3-6天的細胞供藥效篩選。篩選前1天替換為無血清培養液。培養3～6天的心肌細胞，PBS洗滌後加入含藥培養液。置於95％N2和5％CO2培養箱中缺氧6小時。然後在CO2培養箱中復氧3小時。取細胞上清液測定LDH含量。
給藥方案提取得到的丹皮有效組分用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定細胞培養液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30微升細胞上清液，加入50微升基質緩衝液及10微升乳酸脫氫酶輔酶，37度振蕩15分鐘，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50微升加入200微升0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘後，用酶標儀於450nm測定光度值。
藥效結果所有數據用均值±方差表示。採用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效結果見表1。根據心肌細胞乳酸脫氫酶(LDH)檢測結果，丹皮有效組分對降低LDH釋放有非常顯著效果。
表1
2藥理模型臍靜脈內皮細胞缺氧復氧模型原代臍靜脈內皮細胞培養取健康新生兒臍帶，用30～50mlHanks液洗淨靜脈血管內的殘留血跡。視臍帶長度加入相應量的0.1％膠原酶I，轉入培養箱消化15～20分鐘。隨後將臍帶內消化液小心收集到燒杯中，並用Hanks液將燒杯潤洗兩次，一併收集到燒杯中分裝於離心管，900rpm離心10分鐘。吸去上清液，用M199培養液(含10％胎牛血清，100U/ml雙抗，0.15mg/ml Heparin，10uM VC)充分溶解沉澱。將所得細胞懸液分裝於5cm2培養瓶，置於培養箱內培養。第二天換成採用含30ug/ml ECGS的M199培養液，之後每三天換一次培養液直至細胞鋪滿底面。所用細胞均為原代內皮細胞。造模前將培養瓶內細胞接種至96孔板並培養一天，所用細胞量為3.5～4萬/孔。造模時，吸棄舊的M199培養液，加入含藥無酚紅M199培養液，每孔總量為100ul。置於95％N2和5％CO2培養箱中缺氧12小時，然後在CO2培養箱中復氧2小時。取細胞上清液測定LDH含量和NO含量。
給藥方案提取得到的丹皮有效組分用無糖Hanks液配成10-4g/mL供試液，脂溶性成分可加入少量DMSO助溶(DMSO終濃度控制在0.2％以下)。各組分在無酚紅M199培養液中的終濃度控制在10-5g/mL。
乳酸脫氫酶含量測定細胞培養液中乳酸脫氫酶含量能夠表示細胞損傷程度。漏入上清液中的乳酸脫氫酶含量越高，表明細胞損傷也顯著。乳酸脫氫酶測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所。測定方法為取30微升細胞上清液，加入50微升基質緩衝液及10微升乳酸脫氫酶輔酶，37度振蕩15分鐘，再加入50微升2，4-二硝基苯肼，37度振蕩15分鐘。平行空白。取反應液50微升加入200微升0.4mol/L氫氧化鈉溶液，靜置3～4分鐘後，用酶標儀於450nm測定光度值。
藥效結果所有數據用均值±方差表示。採用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效結果見表2。根據內皮細胞乳酸脫氫酶檢測結果，丹皮有效組分對降低LDH釋放有非常顯著效果。
表2
NO含量測定採用Greiss試劑法測定，取90ul細胞上清液，加入等量Greiss試劑，室溫下靜置10分鐘，用酶標儀於550nm測定吸光度值。
藥效結果所有數據用均值±方差表示。採用單邊方差分析和T檢驗進行統計學分析。與模型組相比，P＜0.05認為顯著有效。藥效結果見表3。根據內皮細胞NO檢測結果，丹皮有效組分對提高NO釋放有非常顯著效果。
表3
權利要求
1.一種丹皮有效組分，其特徵在於，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為80～95％。
2.如權利要求1所述的丹皮有效組分，其特徵在於，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為83～92％。
3.如權利要求1所述的丹皮有效組分，其特徵在於，以重量百分比計，苯甲醯芍藥苷的含量為88～90％。
4.權利要求1-3任一權利要求所述丹皮有效組分的製備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。
5.如權利要求書4所述的丹皮有效組分的製備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.8～1.2小時，提取1～3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為2.8～3.2ml/min，柱溫為室溫。
6.如權利要求5所述的丹皮有效組分的製備方法，其中所述的乙酸乙酯和乙醇的體積比為1∶0.8～1.2，石油醚和乙酸乙酯的體積比為47～53∶1，氯仿和甲醇的體積比為8～13∶1。
7.如權利要求書4所述的丹皮有效組分的製備方法，包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱回流1小時，提取2次，合併濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為半製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為80％的水溶液、流動相B為20％的乙腈溶液；40分鐘時，流動相A為20％的水溶液、流動相B為80％的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5％的水溶液、流動相B為95％的乙腈溶液；流速為3ml/min，柱溫為室溫；樣品用100％乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段21.8～26.5min收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。
8.如權利要求7所述的丹皮有效組分的製備方法，其中所述的乙酸乙酯和乙醇的體積比為1∶1，石油醚和乙酸乙酯的體積比為50∶1，氯仿和甲醇的體積比為10∶1。
9.含有權利要求1-3任一權利要求所述的單皮有效組分的藥用製劑，其特徵是，按照藥劑學允許的製備方法製成藥劑學接受的任一藥用製劑。
10.權利要求1-3任一權利要求所述的丹皮有效組分在製備治療和預防心血管疾病藥物中的應用。
全文摘要
本發明涉及一種丹皮有效組分，製劑及其製備方法與用途。該有效組分中主要含有80～95％(w/w)的苯甲醯芍藥苷。本發明的丹皮有效組分的製備方法包括下列步驟將丹皮藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液，將洗脫液濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離，即得。本發明提供的丹皮有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易於闡明其作用機制，在生產中更易於藥物的質量控制。
文檔編號A61P9/10GK1981822SQ20051012235
公開日2007年6月20日 申請日期2005年12月14日 優先權日2005年12月14日
發明者程翼宇, 賀慶, 王毅, 王學偉, 李雲飛, 葛志偉, 胡興江 申請人:天津天士力現代中藥研究開發有限公司