用於預防大腸桿菌病的禽類大腸桿菌疫苗的製作方法
2023-08-08 19:28:31 1
專利名稱：用於預防大腸桿菌病的禽類大腸桿菌疫苗的製作方法
技術領域：
本發明涉及針對大腸桿菌感染的禽類疫苗。特別地，本發明涉及對家禽和特別是對雞有用的突變株大腸桿菌疫苗。本發明還涉及一種新型的aroA基因缺失的大腸桿菌微生物免疫原，其作為通過噴霧或飲用水來對抗大腸桿菌誘導的大腸桿菌病-一種毀滅性的家禽疾病的疫苗是有用和有效的。
背景技術：
大腸桿菌病是一種對於家禽有經濟上的重要性和在世界範圍內發生的常見全身性疾病。大腸桿菌(Escherichia coli)(E.coli)感染發生的形式是急性致死性敗血症或亞急性心包炎和氣囊炎(airsacculitis)，以及肝周炎、關節炎、還有蜂窩織炎。在細菌性感染之中，大腸桿菌病常常是家禽發病和死亡的第一原因。由於糞便汙染，在雞舍中存在大量的大腸桿菌。當大量的致病大腸桿菌通過呼吸道或腸道進入血液時，會發生全身感染。菌血症發展為敗血症和死亡，或感染蔓延到漿膜表面、心包膜、關節和其他器官。
文獻表明，與大腸桿菌病相關的大腸桿菌的血清型O1、O2和O78是在雞和火雞中存在的最常見的血清型。許多分離的菌株也是無法分型的，被認為是特别致命的。
治療策略包括對易感染或環境因素的控制，和抗生素的早期使用。遺憾的是，已經觀察到對四環素、卡那黴素、新黴素、頭孢噻酚、鏈黴素和紅黴素的抗性的高發。許多菌株還對幾種抗生素有抗性。也觀察到對氨苄青黴素和氯黴素的廣泛的敏感性。
儘管可獲得用於火雞的針對與大腸桿菌O78感染有關的大腸桿菌病的商售活大腸桿菌疫苗，但似乎沒有完全安全和有效的大腸桿菌疫苗供雞使用。特別地，似乎沒有任何用於家禽的活的、減毒的、突變的aroA基因缺失的大腸桿菌疫苗是市場上可買到的。似乎也沒有適合於大規模施用，例如通過氣溶膠噴霧或飲用水施用的特別有效的大腸桿菌疫苗。
因此，本發明的一個目的是提供一種適合用於雞的安全和有效的活大腸桿菌疫苗。
本發明的另一個目的是提供一種在用於雞時是安全和有效的、用於預防或改善家禽的大腸桿菌病的方法。
本發明的一個特徵是該大腸桿菌疫苗適合於大規模使用。
本發明的一個優點是，該活疫苗同時提供了在宿主體內的良好的細胞免疫反應和良好的體液免疫反應。
發明概述本發明提供了基因缺失的大腸桿菌突變株，即具有在美國模式培養物保藏所保藏的、保藏號為PTA-5094的菌株的鑑定特徵的大腸桿菌aroA-微生物。
本發明還提供了包含致免疫有效量的所述大腸桿菌aroA-微生物和藥理學上可接受的載體的禽類疫苗組合物。
本發明更進一步提供用於預防或改善家禽的大腸桿菌病的方法，包括向所述家禽施用致免疫有效量的所述大腸桿菌aroA-微生物。
本發明的一部分更進一步提供的是一種用於雞和其它家禽的針對大腸桿菌病的疫苗，其包含在藥理學上可接受的載體中的致免疫有效量的大腸桿菌aroA缺失突變株。
根據以下的詳細說明，本發明的其他特點將更為顯而易見。
發明的詳細說明馴養的家禽中的禽類大腸桿菌病通常與大腸桿菌(E.coli)血清型O78有關。感染一般經由呼吸道，通常在暴露於其他家禽共患疾病、或被其它家禽共患疾病感染之後發生，其它家禽共患疾病例如支原體病、傳染性支氣管炎、新城疫、出血性腸炎或火雞波氏桿菌病(bordetellosis)。在雞中，大腸桿菌病一般影響3到10周齡之間的子雞，並伴隨高發病率和死亡率。禽類大腸桿菌病最嚴重的表現形式是敗血症，其特徵在於心包炎、肝周炎和氣囊炎。蜂窩織炎是也一個可怕的問題。來自家禽的大腸桿菌分離物經常對藥物，例如氨苄青黴素、氯黴素、土黴素、新黴素、慶大黴素、硝基呋喃、萘啶酮酸、多粘茵素B、磺胺等有抗性。此外，目前，似乎沒有商業上可獲得的用於雞的大腸桿菌疫苗。
令人驚訝地，現已發現大腸桿菌aroA缺失突變株，於2003年3月27日在美國模式培養物保藏所(ATCC)保藏的、ATCC號為PTA-5094的大腸桿菌aroA-，用於對抗雞的禽類大腸桿菌病是安全和有效的。有利地，當向雞施用時，本發明的大腸桿菌aroA-PTA-5094提供了良好的細胞免疫反應和體液免疫反應，所述大腸桿菌aroA-PTA-5094可以很容易地生產和通過大規模使用來施用，例如通過粗略的噴霧或飲用水來施用。
在說明書和權利要求書中使用時，術語大腸桿菌aroA-PTA-5094是指大腸桿菌aroA缺失突變株微生物，其於2003年3月27日保藏在ATCC，指定的ATCC號為PTA-5094。這個術語也將包括按與在此闡述的基本上相同的方法製備的、具有其基本上相同的免疫原性特徵的大腸杆茵aroA-基因缺失突變株的其它菌株。
本發明的aroA基因缺失的大腸桿菌突變株可進一步利用本領域技術人員可用的培養基和技術進行連續傳代。連續傳代可以進一步的將菌株減毒，使其更適合作為疫苗免疫原。在此，多至約10次的連續傳代是可以的，約3到5次的連續傳代是優選的。
本發明的大腸桿菌aroA缺失突變株具有獨特的優點，被證明是對禽類大腸桿菌病的發病機理很重要的表面附屬物，例如1型纖毛和鞭毛仍被表達。(LaRagione，R.M.；Sayus，A.R.；和Woodward，M.J.，Epidemiology and Infection，2000，124351-363和LaRagione，R.M.；Cooly，W.A.；和Woodward，M.J.，Joumal of Medical Microbiology，2000，49327-338)。完全定義的遺傳缺失疫苗作為活疫苗的候選物是優選的，提供了在宿主中的組合的安全性和高度效力的可能性。特別可取的是那些不能回復為野生型表型的缺失突變株。在實際操作中，在致病性大腸桿菌菌株中構建有芳香族胺基酸生物合成缺陷的定義的大腸桿菌aroA-突變株，來產生本發明的大腸桿菌aroA-PTA-5094。所述大腸桿菌aroA-PTA-5094在雞中對抗野生型大腸桿菌攻擊是安全和有效的。因此，本發明還提供用於預防或改善家禽的禽類大腸桿菌病的方法，包括向所述家禽施用致免疫有效量的大腸桿菌aroA-PTA-5094。
根據宿主的年齡和大小、感染的嚴重度、病原體的繁殖力、施用的方法等，致免疫有效量可以變化。一般地，每劑量單位適合的有效量可以是約102至1014菌落形成單位(cfu)，優選的約5.0×102到5.0×1010cfu，更優選的約3.0×106cfu至6.0×106cfu，再更優選的約5.0×106cfu至6.0×106cfu。一個或兩個劑量單位是本領域技術人員可預期的。如果選擇兩個劑量單位，則優選的在孵化後1天進行疫苗接種，在約一周到兩周齡再次接種。劑量單位理想的是每隻禽鳥約0.5到1mL，但可以優化這一數量以送遞上文所述的致免疫有效量的微生物免疫原。
適用本發明的方法的家禽包括雞、鴨、火雞、鵝、矮腳雞、鵪鶉、野雞、鴿子等等，優選的是商業上重要的家禽例如雞、鴨、鵝和火雞，更優選的是雞和火雞，特別優選的是雞。
本發明的大腸桿菌aroA-PTA-5094可以通過任何傳統的方法施用，優選的是對於家禽業經濟上可行的方法，例如通過噴霧或飲用水來大規模施用。完全預料不到的是，大腸桿菌，一種呼吸黏膜的天然病原體，可以通過噴霧(優選的氣溶膠)途徑應用，並仍然是安全和有效的。通常的預期是，針對這種強力致命的病原體，特別是細菌的疫苗只能通過注射或其他途徑來提供。本發明的aroA-突變株對於噴霧施用是安全的。在實際操作中，將大腸桿菌aroA-PTA-5094與液體載體混合，作為噴霧或作為飲用水添加劑施用。因此，本發明進一步提供一種禽類疫苗組合物，其包含致免疫有效量的大腸桿菌aroA-PTA-5094和藥理學上可接受的載體。
適合於在本發明的疫苗組合物中使用的藥理學上可接受的載體可以是任何常規的、適合於獸醫藥物組合物的液體載體，優選的是適合於組織或細胞培養基的平衡鹽溶液，例如無菌的磷酸鹽緩衝鹽水，更優選的是蒸餾水。其他適合的基質可以包括乳劑。本發明的疫苗也可由本領域技術人員添加佐劑。當通過飲用水應用該疫苗時，可以使用脫脂奶粉作為載體。脫脂奶粉似乎能穩定疫苗，有可能中和了可影響活力的某些痕量礦物質的作用。
除了大腸桿菌aroA-PTA-5094微生物作為活性成分之外，期望本發明的疫苗組合物還可含有其他的活性組分，例如針對禽白血病、網狀內皮組織增殖、傳染性支氣管炎、傳染性囊病、新城疫、禽類腺病毒病、禽類呼吸道腸病毒病、禽痘病、傳染性喉氣管炎、禽流感、雞流感、雞傷寒、球蟲病、隱孢子蟲病(cryptosporidiosis)、雞霍亂、等等的禽類免疫原性抗病原體化合物。
在本發明的一個實施方案中，可以利用已知的技術，例如在Nature，1974，252252-254或Journal of Immunology，1978，1201109-1113中描述的技術，將本發明的大腸桿菌aroA-PTA-5094微生物包含到脂質體中。在本發明的另一個實施方案中，可以利用本領域技術人員可用的方案使本發明的大腸桿菌aroA-PTA-5094微生物與適合的生物學化合物，例如多糖、肽、蛋白等等，或它們的組合綴合。
根據此處描述的實施方案的本發明的疫苗被認為是對所有血清型的大腸桿菌的大腸桿菌病的是有效的，包括血清型O1、O2和O78，以及特別是致命的未分型的血清型。在此描述的疫苗對於敗血症、心包炎、氣囊炎、肝周炎、關節炎和特別是蜂窩織炎是有效的。後者通常與大腸桿菌病相關，但本身也可能是重要的問題。
為了更清楚地了解本發明，以下給出下列實施例。這些實施例僅僅是舉例說明性的，無論如何不能被理解為是限制本發明的範圍或是本發明的基礎。實際上，除那些顯示出的和在此描述的之外，根據下文中闡述的實施例和以上的說明書，對本發明的各種修改對於本領域技術人員是顯而易見的。這種修改也將落在附隨的權利要求的範圍之中。
實施例1aroA基因缺失的大腸桿菌突變株的構建I)受體親本生物體是1995年從提交給獸醫實驗室機構(VLA)，Addlestone，Surrey，UK，並在VLA血清分型的禽類大腸桿菌病臨床病例中分離的大腸桿菌禽類分離物。根據在一天齡SPF雞中的群集現象、侵入、持久性和病原性，和通過其抗生素敏感性模式的體外特徵選擇親本菌株。通過轉化的供體(大腸桿菌K12 S17 λ pir，其帶有具有aroA的PNG101，aroA帶有100bp的缺失)和野生型親本菌株(野生型大腸桿菌分離物EC34195)之間的接合，產生受體菌株。
II)缺失的表徵aroA基因位於serC-aroA操縱子中，鄰近於serC並位於serC的啟動子遠端，編碼3-磷酸烯醇丙酮醯基莽草酸-5-磷酸合成酶，一種普通芳香生物合成途徑的酶。在受體中aroA基因功能的喪失產生了對芳香代謝產物的需求，包括酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、對氨基苯甲酸(PABA)和2，3-二羥基苯甲酸。PABA是一種在脊椎動物組織中不存在的代謝產物，對於PABA的需求導致體內生長的減弱。
III)aroA缺失的大腸桿菌突變株的構建a)設計包括SrfI和BglII限制性位點和終止密碼子的PCR引物，從如上所述的家禽大腸桿菌O78分離物中擴增aroA基因的5′和3′末端的、約650bp的兩個獨立的PCR產物。
b)用BglII將兩個PCR產物消化2小時，在100伏特下進行電泳1小時，切下條帶，用SephaGlas條帶製備試劑盒純化各個條帶。
c)混和等量的每個純化的PCR產物，並連接到pCR2.1中。
d)將攜帶aroA的連接的質粒轉化到DH5α最大感受態細胞中，通過限制性內切酶圖譜和PCR確認克隆。
e)用EcorV和SpeI將帶有缺失的完全aroA基因從pCR2.1切下，然後純化並連接到預先消化(SpeI)的自殺載體(SacB，pKNG101)上，轉化到感受態大腸杆茵K12 S17 λ pir內，通過限制性內切酶圖譜和PCR確認克隆。
f)在供體(大腸桿菌S17 λ pir，其帶有具有aroA的PNG101，aroA帶有100bp的缺失)和野生型大腸桿菌分離物之間進行接合。
g)在37℃孵化48小時之後出現菌落，在補充有慶大黴素和鏈黴素和芳香族胺基酸(DL色氨酸、DL苯丙氨酸和DL酪氨酸每種20mg/l)的基本培養基上傳代培養。通過PCR測試單個菌落。保留產生野生型PCR產物和小了100bp的突變PCR產物的菌落用於進一步的研究。
h)將單交換體在補充有10％蔗糖的LB-G肉湯中，於37℃，緩和攪動培養16小時。將連續稀釋的過夜培養物置於補充有10％蔗糖的LB-G平板上，在37℃孵化16小時。
i)將在10％蔗糖LB-G平板上生長的菌落在LB-G、LB-G+慶大黴素和鏈黴素和基本培養基的每個上進行傳代培養，在37℃孵化16小時。將僅在LB-G平板上生長(雙交換體)的菌落在5％綿羊血瓊脂上傳代培養，維持在4℃。
IV)中間克隆載體自殺載體(SacB，PNG101)是中間克隆載體。在供體(S17，其帶有具有aroA的PNG101，aroA帶有100bp的缺失)和野生型大腸桿菌分離物之間進行接合。
實施例2主種的製備大腸桿菌aroA-菌株(在實施例1中構建)在胰蛋白酶大豆瓊脂平板上生長一次，在胰蛋白酶大豆肉湯中傳代3次。將培養物分置在玻璃瓶中，密封並凍幹。
實施例3大腸桿菌aroA活疫苗一次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸桿菌病的效力的評估在這個評估中，將96隻SPF白色來亨(leghorn)雞分成三組，每組32隻。挑選禽鳥，放入任意分配的隔離裝置中。每個測試組放在2個隔離裝置中，每個包含16隻禽鳥。
利用手持噴霧器粗略的噴霧來對1天齡的組A接種。在一天齡時，將測試組A中的禽鳥集中在小容器中，向禽鳥的頭部噴出疫苗，直到給予了校準的劑量。用無菌磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)將實施例2的大腸桿菌aroA-微生物稀釋到每劑(1mL每隻禽鳥)5.0×106cfu的滴度。
在6周齡時，用1.0mL劑量的1.0×109cfu大腸桿菌O78氣管內地(IT)攻擊組A和組B(未接種)。
測試組C未接種和未攻擊(陰性對照組)。接種的和對照禽鳥在獨立的隔離裝置中飼養，直到完成研究。
對所有禽鳥進行獸醫級照料，隨意取用飼料和水。攻擊後7天每天觀察禽鳥。在攻擊後7天時間的結尾，所有存活的禽鳥進行屍檢和檢查典型大腸桿菌病病變的存在。非存活禽鳥和展現了任何非常明顯的病變，例如肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎的禽鳥認為是大腸桿菌病陽性。
結果在表I中顯示。
表I
a一隻禽鳥在疫苗接種後一天死亡。原因不能確定，但可能非特異性的早期小雞死亡常常與卵黃囊或臍感染有關。
b肝周炎c心包炎d氣囊炎e蜂窩織炎f關節炎從表I的數據可以看出，當在一天齡時施用所述疫苗，本發明的大腸桿菌aroA-疫苗對於在雞中預防由大腸桿菌O78導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例4大腸桿菌aroA-活疫苗兩次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸桿菌病的效力的評估在這個評估中，將96隻SPF白色來亨雞分成三組，每組32隻。挑選禽鳥，放入任意分配的隔離裝置中。每個測試組放在2個隔離裝置中，每個包含16隻禽鳥。
組A(接種)在一天齡如實施例B中描述的通過粗略的噴霧接種，在一周齡通過飲用水途徑再次接種。在一周齡，使禽鳥禁止飲水3小時。稀釋實施例2的大腸桿菌aroA-疫苗，與測定量的涼蒸餾水混和到最終滴度為5.0×106cfu。蒸餾水的測定量是先前確定的一小時中消耗的量。
在6周齡時，用1.0mL劑量的1.0×109cfu大腸桿菌O78氣管內地(IT)攻擊組A(接種)和組B(未接種)。
測試組C未接種和未攻擊(陰性對照組)。接種的和對照禽鳥在獨立的隔離裝置中飼養，直到完成研究。
對所有禽鳥進行獸醫級照料，隨意取用飼料和水。攻擊後7天，每天觀察禽鳥。在攻擊後7天時間的結尾，所有存活的禽鳥進行屍檢和檢查典型大腸桿菌病病變的存在。非存活禽鳥和展現了任何非常明顯的病變，例如肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎的禽鳥認為是大腸桿菌病陽性。
結果在表II中顯示。
表II
a兩隻禽鳥在通過粗略噴霧途徑疫苗接種後2天死亡。原因不能確定，但可能非特異性的早期小雞死亡常常與卵黃囊或臍感染有關。
b肝周炎c心包炎d氣囊炎e蜂窩織炎f關節炎從表II的數據可以看出，當在一天齡時通過粗略的噴霧施用疫苗、在一周齡通過飲用水再次施用，本發明的大腸桿菌aroA-疫苗對於在雞中預防由大腸桿菌O78導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例5大腸桿菌aroA-活疫苗兩次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸桿菌病(血清型O78)的效力的進一步評估這項研究考察了用大腸桿菌血清型O78的強毒株進行氣管內攻擊，大腸桿菌aroA-活疫苗在預防雞的大腸桿菌病方面的效力。在測試組#1(32隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在一周齡用一隻禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗在飲用水中再次接種。在測試組#2(32隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#3(32隻禽鳥)中的禽鳥沒有接種，並未受攻擊。組#1和組#2中的所有禽鳥在六周齡氣管內地用每劑1.5×109cfu的大腸桿菌O78攻擊。在攻擊後7天，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查非常明顯的典型大腸桿菌病病變的存在(肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎)。
不存在可歸因於施用FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗的不利反應(死亡或其他臨床病徵)，這是其對於大規模施用的安全性的表現。
大腸桿菌O78強毒株在未接種的受攻擊對照(組#2)中，在攻擊後7天期間導致了28.1％的死亡率(32隻禽鳥中9隻死亡)。大腸桿菌O78強毒株在FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗接種的禽鳥中，在攻擊後7天期間導致的死亡率是0％(32隻禽鳥中0隻死亡)。
統計學地分析在接種的受攻擊禽鳥和未接種的受攻擊對照禽鳥之間的大腸桿菌病比率。在接種的和未接種的受攻擊禽鳥之間典型的大腸桿菌病顯著病變存在著顯著差異(p＜0.0001)。預防分數為72.4％(95％ Cl 53.7，83.6)。
根據當前的研究可以斷定，當在一天齡時通過粗略的噴霧施用和在一周齡通過飲用水再次施用，每劑3.2×106cfu滴度的FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗對於在雞中預防由大腸桿菌O78導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例6大腸桿菌aroA-活疫苗一次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸桿菌病(血清型O78)的效力的進一步評估這項研究考察了用大腸桿菌血清型O78的強毒株進行氣管內攻擊，大腸桿菌aroA-活疫苗在預防雞的大腸桿菌病方面的效力。在測試組#1(32隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡用一隻禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗通過粗略的噴霧進行接種。在測試組#2(32隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#3(32隻禽鳥)中的禽鳥沒有接種，並未受攻擊。組#1和組#2中的所有禽鳥在六周齡氣管內地用每劑1.5×109cfu的大腸桿菌O78攻擊。在攻擊後7天，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查非常明顯的典型大腸桿菌病病變的存在(肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎)。
不存在可歸因於施用FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗的不利反應(死亡或其他臨床病徵)，這是其對於大規模施用的安全性的表現。
大腸桿菌O78強毒株在未接種的受攻擊對照中在攻擊後7天期間導致了28.1％的死亡率(32隻禽鳥中9隻死亡)。大腸桿菌O78強毒株在FDAH大腸桿菌aroA活疫苗接種的禽鳥中，在攻擊後7天期間導致的死亡率是0％(32隻禽鳥中0隻死亡)。
統計學地分析在接種的受攻擊禽鳥和未接種的受攻擊對照禽鳥之間的大腸桿菌病比率。在接種的和未接種的受攻擊禽鳥之間典型的大腸桿菌病顯著病變存在著顯著差異(p＜0.0001)。預防分數為76.5％(95 ％Cl 57.9，86.9)。
根據當前的研究可以斷定，當在一天齡時通過粗略的噴霧施用，含每劑3.2×106cfu的FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗對於在雞中預防由大腸桿菌O78導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例7大腸桿菌aroA活疫苗兩次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸杆茵病(致命的未分型血清型)的效力的進一步評估這項研究考察了用致命的未分型大腸桿菌進行氣管內攻擊，大腸桿菌aroA-活疫苗在預防雞的大腸桿菌病方面的效力。在測試組#1(32隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在一周齡用一隻禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗在飲用水中再次接種。在測試組#2(32隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#3(32隻禽鳥)中的禽鳥沒有接種，並未受攻擊。組#1和組#2中的所有禽鳥在六周齡氣管內地用每劑2.5×1010cfu的致命的大腸桿菌攻擊。在攻擊後7天，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查非常明顯的典型大腸桿菌病病變的存在(肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎)。
不存在可歸因於施用FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗的不利反應(死亡或其他臨床病徵)，這是其對於大規模施用的安全性的表現。
致命的大腸桿菌在未接種的受攻擊對照中或在FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗接種的禽鳥中在攻擊後7天期間沒有導致死亡。
統計學地分析在接種的受攻擊禽鳥和未接種的受攻擊對照禽鳥之間的大腸桿菌病比率。在接種的和未接種的受攻擊禽鳥之間典型的大腸桿菌病顯著病變存在著顯著差異(p＜0.0001)。預防分數為87.1％(95％ Cl 61.9，95.6)。
根據當前的研究可以斷定，當在一天齡時通過粗略的噴霧施用和在一周齡通過飲用水再次施用，每劑3.2×106cfu滴度的FDAH大腸桿菌aroA活疫苗對於在雞中預防由致命的大腸桿菌導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例8大腸桿菌aroA-活疫苗一次疫苗接種後在雞中對抗禽類大腸桿菌病(致命的未分型血清型)的效力的進一步評估這項研究考察了用致命的未分型大腸桿菌進行氣管內攻擊，大腸桿菌aroA-活疫苗在預防雞的大腸桿菌病方面的效力。在測試組#1(32隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡用一隻禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗通過粗略的噴霧進行接種。在測試組#2(32隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#3中的禽鳥未接種並未受攻擊。組#1和組#2中的所有禽鳥在六周齡氣管內地用每劑2.5×1010cfu的致命的大腸桿菌攻擊。在攻擊後7天，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查非常明顯的典型大腸桿菌病病變的存在(肝周炎、心包炎、氣囊炎、蜂窩織炎或關節炎)。
不存在可歸因於施用FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗的不利反應(死亡或其他臨床病徵)，這是其對於大規模施用的安全性的表現。
致命的大腸桿菌在未接種的受攻擊對照中或在FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗接種的禽鳥中在攻擊後7天期間沒有導致死亡。
統計學地分析在接種的受攻擊禽鳥和未接種的受攻擊對照禽鳥之間的大腸桿菌病比率。在接種的和未接種的受攻擊禽鳥之間典型的大腸桿菌病顯著病變存在著顯著差異(p＜0.0001)。預防分數為66.6％(95％ Cl 39.8，81.5)。
根據當前的研究可以斷定，當在一天齡時通過粗略的噴霧施用，每劑3.2×106cfu滴度的FDAH大腸桿菌aroA-活疫苗對於在雞中預防由致命的大腸桿菌導致的大腸桿菌病是安全和有效的。
實施例9比較試驗A在這項研究中，本發明的疫苗與商售的GARAVAX-T疫苗進行比較，這是競爭者的產品，是含有大腸桿菌的致命的溫度敏感突變株，被推薦用於火雞，目的在於預防與大腸桿菌血清型O78感染有關的大腸桿菌病。
根據本發明的一個實施方案，在測試組#1(30隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在2周齡用一隻禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗在飲用水中再次接種(傳代水平X+5；5.0×106cfu每1mL劑量)。根據推薦的標籤指示，在測試組#2(30隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在2周齡用一隻禽鳥劑量的GARAVAX-T疫苗在飲用水中再次接種。在測試組#3(30隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#4(30隻禽鳥)中的禽鳥沒有接種並且未受攻擊。在組#1、#2和#3中的所有禽鳥在6周齡用每劑(1.0mL/劑)5×109cfu的目標劑量的致命的大腸桿菌O78進行氣管內的攻擊。在攻擊後7天，記錄死亡禽鳥的數目，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查典型大腸桿菌病的顯著可見病變的存在。
結果在以下的表III中列出，確定患有特定氣囊炎和整體大腸桿菌病病變的雞的百分比，其中
表III活大腸桿菌aroA-疫苗在雞中對抗大腸桿菌O78攻擊在預防氣囊炎方面的效力
表III(續)GARAVAX-T疫苗在雞中對抗大腸桿菌O78攻擊在預防氣囊炎方面的效力
1氣囊炎陽性％＝患有氣囊炎的禽鳥總數/禽鳥總數2大腸桿菌病陽性％＝有大腸桿菌病病變的禽鳥和死亡禽鳥總數/禽鳥總數CS＝粗略的噴霧DW＝飲用水同一欄中不同字母之前的數值顯著不同(χ2測驗法p＜0.05)實施例10比較試驗B在這項研究中，本發明的疫苗與商售的GARAVAX-T疫苗進行比較，這是競爭者的產品，是含有大腸桿菌的致命的溫度敏感突變株，被推薦用於火雞，目的在於預防與大腸桿菌血清型O78感染有關的大腸桿菌病。
根據本發明的一個實施方案，在測試組#1(31隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在2周齡用-只禽鳥劑量的大腸桿菌aroA-疫苗在飲用水中再次接種(傳代水平X+5；5.0×106cfu每1mL劑量)。根據推薦的標籤指示，在測試組#2(29隻禽鳥)中的每隻禽鳥在一天齡通過粗略的噴霧進行接種，在2周齡用一隻禽鳥劑量的GARAVAX-T疫苗在飲用水中再次接種。在測試組#3(31隻禽鳥)中的禽鳥作為未接種的受攻擊對照。在測試組#4(30隻禽鳥)中的禽鳥沒有接種並未受攻擊，這些當中沒有死亡。在組#1、#2和#3中的所有禽鳥在6周齡用每劑(1.0mL/劑)5.0×109cfu的目標劑量的致命的大腸桿菌624(未分型的血清型)進行氣管內的攻擊。在攻擊後7天，記錄死亡禽鳥的數目，對所有存活禽鳥進行屍檢和檢查典型大腸桿菌病的顯著可見病變的存在。
結果在以下的表IV中列出，確定患有特定蜂窩織炎的雞的百分比，其中表IV活大腸桿菌aroA-疫苗在雞中對抗大腸桿菌624(未分型的血清型)攻擊在預防蜂窩織炎方面的效力
表IV(續)GARAVAX-T疫苗在雞中對抗大腸桿菌624(未分型的血清型)攻擊在預防蜂窩織炎方面的效力
1蜂窩織炎陽性％＝患有蜂窩織炎的禽鳥和死亡禽鳥的總數/禽鳥總數CS＝粗略的噴霧DW＝飲用水同一欄中不同字母之前的數值顯著不同(χ2測驗法p＜0.05)
權利要求
1.一種大腸桿菌aroA-微生物，其具有在美國模式培養物保藏所以保藏號PTA-5094保藏的菌株的鑑定特徵。
2.一種疫苗組合物，其包含致免疫有效量的、具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑑定特徵的突變大腸桿菌菌株和藥理學上可接受的載體。
3.根據權利要求2的組合物，其中所述載體是適合於在組織或細胞培養基中使用的平衡鹽溶液。
4.根據權利要求2的組合物，其中所述載體是蒸餾水。
5.根據權利要求2的組合物，其中所述致免疫有效量是足以提供約5.0×102cfu至5.0×1010cfu的量。
6.根據權利要求5的組合物，其中所述有效量是約5.0×106cfu至6.0×106cfu。
7.一種用於預防或改善家禽的大腸桿菌病的方法，包括向所述家禽施用致免疫有效量的、具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑑定特徵的菌株。
8.根據權利要求7的方法，其中所述家禽選自由雞、鴨、鵝、火雞、矮腳雞、鵪鶉、野雞和鴿子。
9.根據權利要求7的方法，其中所述大腸桿菌通過大規模使用來施用。
10.根據權利要求7的方法，其中所述有效量是約5.0×102cfu至5.0×1010cfu。
11.根據權利要求8的方法，其中所述家禽是雞或火雞。
12.根據權利要求9的方法，其中所述大腸桿菌通過噴霧應用來施用。
13.根據權利要求9的方法，其中所述大腸桿菌在飲用水中施用。
14.根據權利要求11的方法，其中所述家禽是雞。
15.根據權利要求14的方法，其中所述有效量是約5.0×106cfu至6.0×106cfu。
16.一種用於預防或改善家禽的蜂窩織炎的方法，所述方法包括向所述家禽施用致免疫有效量的、具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑑定特徵的菌株。
17.一種疫苗組合物，其包含致免疫有效量的、具有大腸桿菌aroA-PTA-5094的鑑定特徵的突變大腸桿菌菌株和藥理學上可接受的載體，其中所述疫苗對於通過氣溶膠噴霧或飲用水大規模使用是安全和有效的，進一步的其中所述致免疫有效量足以提供約3.0×106cfu至6.0×106cfu。
全文摘要
提供了適合於向家禽，包括雞，大規模使用的一種遺傳缺失突變活大腸桿菌疫苗。還提供了一種安全和有效的方法來保護家禽免於遭受大腸桿菌桿菌病感染和疾病，其中通過大規模使用途徑，例如粗略的噴霧和飲用水，向雞、火雞等使用活的、突變的、aroA基因缺失的大腸桿菌免疫原。
文檔編號A61K39/108GK1822855SQ200480020275
公開日2006年8月23日 申請日期2004年5月12日 優先權日2003年5月14日
發明者H·H·范, M·庫馬, R·M·拉拉焦內, M·J·武德沃德 申請人:惠氏公司