永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備組織缺血損傷修復生物製劑中的應用的製作方法
2023-08-07 23:20:06
永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備組織缺血損傷修復生物製劑中的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提供了永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備修復組織皮膚全層缺損生物製劑和製備治療缺血缺氧性組織損傷生物製劑中的應用，所述的複合細胞因子為低氧培養永生化人肺微血管內皮細胞所分泌的細胞因子，所述的複合細胞因子不含有遺傳物質（DNA或RNA）。用低氧培養的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子局部應用，促進局部血管的形成，具有明顯的效果。並且對於皮膚組織缺損等損傷疾病具有明顯的組織再生作用。複合細胞因子具有多種促進血管生成的有效成分，能夠促進血管再生，並對損傷組織進行修復，促進損傷組織的生長癒合，調節免疫反應等等。
【專利說明】永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備組織缺血損傷修復生物製劑中的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種含有永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的生物製劑，用於治療皮膚全層損傷的治療製劑，以及組織缺氧損傷修復的生物製劑。
【背景技術】
[0002]永生化人肺微血管內皮細胞是一種來自於人體肺組織微血管內皮的細胞，具有永生化特性、並且可以分泌大量與血管生長相關的細胞因子。該細胞同時轉入了含有端粒酶催化組分和類人猿病毒40大T抗原的質粒。這種細胞可以在體外培養超過24個月，具有非常強的生存能力。另外，這種細胞在裸鼠移植試驗中不會產生致瘤性。(Generat1nofHuman Pulmonary Microvascular Endothelial Cell Lines)
人肺微血管內皮細胞來源於血管內皮組織,表達有內皮細胞表面標誌物,如血小板內皮細胞粘附分子(PECAM-1，⑶31)、血管性血友病因子(vWF)、細胞內粘附分子(ICAM-1)、血管粘附因子(VCAM-1)、E選擇素等等。另外，其細胞外基質具有非常強的形成血管能力。正是具有這種特點，這種細胞分泌物可以用於外傷、缺血性疾病等等的臨床應用。
[0003]體外應用物理的方法對人肺微血管內皮細胞進行幹預可以進一步增強該細胞所分泌細胞因子的血管形成能力。通過低氧1%的方法培養細胞24-48小時可以使細胞大量表達Gremlin-1和分泌血管內皮生長因子(VEGF)。Gremlin-1的高表達與缺血缺氧器官組織的血管生成以 及抑制凋亡作用有著密切的關係。(Generat1n of Human PulmonaryMicrovascular Endothelial Cell Lines)
局部缺血性疾病包括心肌缺血、梗塞性腦中風、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸壞死、難治性皮膚潰瘍、糖尿病足等等。
[0004]目前尚未有將永生化人肺微血管內皮細胞應用於組織缺血損傷的報導。
【發明內容】
[0005]本發明的目的是彌補現有技術的空白，提供一種永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備修復組織皮膚全層缺損生物製劑和製備治療缺血缺氧性組織損傷生物製劑中的應用，所述的複合細胞因子為低氧培養永生化人肺微血管內皮細胞所分泌的細胞因子，所述的複合細胞因子不含有遺傳物質(DNA或RNA)，所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子通過以下步驟製備而得:1)將永生化人肺微血管內皮細胞在體外進行擴增培養；2)永生化人肺微血管內皮細胞用無血清的條件培養基進行培養，並且將培養基進行收集；3)將條件培養基進行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質；4)將離心後培養基(含>3.5kDa分子)進行透析濃縮，得到濃縮液；5)將濃縮液進行凍幹處理，得到人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子凍乾粉。
[0006]優選地，
所述的低氧培養的氧氣濃度為1%、5%或10%。[0007]所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子通過以下方法製備而成:
1)永生化人肺微血管內皮細胞的擴增培養:永生化人肺微血管內皮細胞為 貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進行傳代培養；
2)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的收集:在低氧下培養細胞至第
三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清內皮細胞培養基進行細胞培養後，將無血清培養基進行收集，檢測培養基中是否含有遺傳物質，如有則應用電泳方法去除；
3)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的離心純化
將所收集的條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa 的分子濾膜，
4)濃縮
將離心後的條件培養基(含>3.5kDa分子)通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2_20倍,得到濃縮液，
5)凍幹
將濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，得到凍乾粉。
[0008]含有永生化 人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的修復材料，所述的修復材料包括永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子和透明質酸或生理鹽水，每1ml修復材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子。
[0009]所述的修復材料的製備方法包括以下步驟:將複合細胞因子濃縮液或凍乾粉按照一定比例加入透明質酸或生理鹽水中，配置成每1ml修復材料中含有0.1ng-1OOmg複合細胞因子的修復材料。
[0010]所述的修復材料為膠狀修復材料、面膜修復材料或膏狀修復材料。
[0011]含有永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的皮膚護理產品。
[0012]本發明具有如下技術效果:
I)用低氧培養的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子局部應用，促進局部血管的形成，具有明顯的效果。並且對於皮膚組織缺損等損傷疾病具有明顯的組織再生作用。複合細胞因子具有多種促進血管生成的有效成分，能夠促進血管再生，並對損傷組織進行修復，促進損傷組織的生長癒合，調節免疫反應等等。
[0013]2)透明質酸材料為一種酸性粘多糖，溶解後比例為0.1_10%，理想濃度為1%，是人體的一種成分，富含水分，具有特殊的保水作用，並且在人體內可以自然分解吸收，對皮膚創面以及其他理化損傷創面保持溼潤環境。
[0014]3)所述缺氧損傷為一種因缺血缺氧造成的組織壞死，本複合細胞因子可以，但不限於皮膚難治性潰瘍創面治療，其還可用於心肌缺血、梗塞性腦中風、股骨頭缺血性壞死、缺血性腸壞死、難治性皮膚潰瘍、糖尿病足的治療。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0015]圖1為永生化人肺微血管內皮細胞的形態圖
圖2為缺氧培養與正常培養24小時對VEGF分泌量的影響對照 圖3為永生化人肺微血管內皮細胞Gremlin-1在不同氧濃度條件下的表達變化對照圖4為永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在皮膚全層缺損模型中的治療結果
圖
圖5A為永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在中風模型中的治療作用，大鼠腦部切片。
[0016]圖5B為永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在中風模型中的治療作用，大鼠腦部切片紅色螢光圖片。
[0017]圖5C為5A和5B的重疊圖片。
【具體實施方式】
[0018]實施例1製備含有永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子
永生化人肺微血管內皮細胞分離於人正常肺部組織的血管內皮組織，並共轉染含端粒酶催化成分(hTERT)及SV40LTag的質粒製備成為永生化人肺微血管內皮細胞系(HPMEC，PromoCell, Germany)。將細胞復甦後接種於內皮細胞生長培養基(Lonza, Swiss)中培養，細胞密度達到80-90%時傳代，待細胞養至第3代時開始收集細胞因子。圖1為第三代永生化人肺微血管內皮細胞收集細胞因子時形態，細胞密度達到100%。
[0019]永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的製備方法如下:
1)永生化人肺微血管內皮細胞的擴增培養
永生化人肺微血管內皮細胞為貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進行傳代
培養；
2)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的收集
在低氧(1%氧濃度)下培養細胞至第三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清內皮細胞培養基進行細胞培養後，將無血清培養基進行收集，檢測培養基中是否含有遺傳物質，如有則應用電泳方法去除；
3)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的離心過濾，濃縮及凍幹
將所收集的條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa的分子濾膜，將離心後的條件培養基通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2-20倍，得到濃縮液，將最終的濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，製備成凍乾粉。
[0020]實施例2檢測常氧及低氧環境對人肺微血管內皮細胞細胞因子表達的影響 在培養過程中，將細胞分為三份。一份按照正常氧濃度進行細胞培養；一份應用厭氧培
養罐(三菱，日本)進行細胞培養24小時；一份應用厭氧培養罐(三菱，日本)進行細胞培養48小時。厭氧培養罐中氧氣濃度為1%。
[0021]上述三份細胞分別收集細胞因子後進行雙抗體夾心法酶聯免疫吸附測定(ELISA)檢測樣本中血管內皮生長因子(VEGF)的濃度，並採用親和素-生物素-辣根過氧化物酶系統進行顯色，最後通過酶標儀檢測不同樣本間VEGF含量。多次重複測量後低氧48小時VEGF濃度明顯高於24小時及常氧培養，低氧24小時也明顯高於常氧培養(圖2)。ELISA詳細步驟見《精編分子生物學實驗指南》。
[0022]Gremlinl是骨形態形成蛋白拮抗劑家族成員之一，具有促進血管形成的作用。上述三份細胞分別收集細胞因子後測量Gremlinl的表達。採用免疫印跡(Western-blot)法進行檢測，將蛋白樣品加入凝膠泳道後進行電泳分離。隨後將含有蛋白樣品的凝膠進行轉膜，並加入抗人Germlinl抗體(LifeSpan B1science)進行結合後顯色。如圖3所示，Germlinl在缺氧48小時培養狀態下分泌數量最多，缺氧培養24小時分泌量要多餘常氧狀態下培養(圖3)
結論:缺氧培養條件會影響人肺微血管內皮細胞所分泌的細胞因子，主要影響為增加了促血管形成細胞因子的分泌，如VEGF、Gremlinl等。
[0023]實施例3檢測永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在皮膚全層缺損模型中的治療作用
應用Sprague Dawley大鼠製備皮膚全程缺損模型，即(圖4)中al,應用製備好的永生化人肺微血管內皮細胞細胞因子和透明質酸混合後敷於創口表面，並用敷貼防止膠狀液流失。對照組僅用透明質酸敷於創面。術後14天照相觀察，從圖4可以看出，實驗組明顯優於對照組。
[0024]結論:對照研究顯示永生化人肺微血管內皮細胞細胞因子具有促進傷口癒合恢復的作用。
[0025]實施例4檢測永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子對缺氧性中風模型的治療作用
應用Sprague Dawley大鼠製備中風(MCAO)模型,大鼠麻醉後將鈍頭尼龍線延頸內動脈深入18mm，I小時後撤出尼龍線。模型製備成功後,大鼠腦缺血對側前肢蜷縮,行走偏向對偵U。術後8小時，將10mg細胞因子稀釋至1ml生理鹽水中，進行大鼠尾靜脈注射。48小時後，尾靜脈注射Br du (5-溴脫氧尿嘧啶核苷)，並取大鼠腦組織做抗Brdu免疫組織螢光染色。如圖5A、5B、5C所示，注射細胞因子後，大鼠腦內Brdu陽性細胞數量眾多，說明細胞因子的注射可以促進腦內細胞的增殖分裂，圖5C為5A和5B的重疊圖片，紅色螢光顯示增殖細胞位置。
[0026]結論:細胞因子可以促進腦內受損細胞的增殖。
[0027]實施例5製備含有永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的細胞因子注射液 將細胞因子混合入生理鹽水等液體中，濃度為100mg/10ml，通過介入、靜脈輸注等方法
將細胞因子液注射到損傷區域。可以抑制半損傷細胞的凋亡和新生細胞的增殖。
[0028]實施例6製備含有永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的細胞因子皮膚損傷修復液
將細胞因子混入透明質酸中，濃度為100 μ g/10ml，將膠狀液直接敷於清潔創面，可以促進表皮的細胞的生長，縮短恢復時間。隨著皮膚損傷逐漸的修復，可以降低細胞因子濃度，在創面未完全癒合前最低可用0.lng/10ml混合細胞因子的透明質酸液進行創面的修復。
[0029]實施例7將永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子與皮膚護理產品聯合使用 可以將永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子加入皮膚日常應用的潤膚霜、面膜
中。可以促進面部損傷細胞的修復，如紫外線細胞損傷，也可以起到增加皮膚活性的作用。具體成分如下:
潤膚霜:三乙醇胺 0.2%
甘油3.5%丙二醇 2.5%
永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子0.002% 防腐劑、香精適量 加純水至100%。
[0030]其中每50ml潤膚霜含有細胞因子約lng。
[0031]剝離型面膜:聚乙烯比咯烷酮1.5%
聚醋酸乙烯酯4.0%
橄欖油2.0%
羊毛脂1.5%
山梨醇5.0%
十二烷基硫酸酷納鹽 0.2%
吐溫-200.8%
永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子 0.002% 香精、防腐劑適量 加純化水至100%.其中每20ml含細胞因子約0.1ngo
【權利要求】
1.永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子在製備修復組織皮膚全層缺損生物製劑和製備治療缺血缺氧性組織損傷生物製劑中的應用，其特徵在於，所述的複合細胞因子為低氧培養永生化人肺微血管內皮細胞所分泌的細胞因子，所述的複合細胞因子不含有遺傳物質(DNA或RNA)， 所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子通過以下步驟製備而得: 1)將永生化人肺微血管內皮細胞在體外進行擴增培養； 2)永生化人肺微血管內皮細胞用無血清的條件培養基進行培養，並且將培養基進行收集; 3)將條件培養基進行離心純化，截留分子量3.5kDa的物質； 4)將離心後培養基(含>3.5kDa分子)進行透析濃縮，得到濃縮液； 5)將濃縮液進行凍幹處理，得到人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子凍乾粉。
2.根據權利要求1所述的應用，其特徵在於，低氧培養的氧氣濃度為1%、5%或10%。
3.根據權利要求1或2所述的應用，其特徵在於，所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子通過以下方法製備而成: 1)永生化人肺微血管內皮細胞的擴增培養:永生化人肺微血管內皮細胞為 貼壁培養細胞，待細胞生長至80-90%融合時進行傳代培養； 2)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的收集:在低氧下培養細胞至第 三代，融合率達到80-90%進行細胞因子的收集，應用無血清內皮細胞培養基進行細胞培養後，將無血清培養基進行收集，檢測培養基中是否含有遺傳物質，如有則應用電泳方法去除； 3)永生化人肺微血管內皮細胞條件培養基的離心純化 將所收集的條件培養基進行過濾離心，所用離心濾膜為截留分子量為3.5kDa 的分子濾膜； 4)濃縮 將離心後的條件培養基(含>3.5kDa分子)通過超濾的方式進行進一步的濃縮，通過Slide-A-Lyzer透析膜濃縮2_20倍,得到濃縮液， 5)凍幹 將濃縮液放置於容器中進行最終凍幹，得到凍乾粉。
4.含有如權利要求1所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的修復材料，其特徵在於，所述的修復材料包括永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子和透明質酸或生理鹽水，每1ml修復材料中含有0.1ng-1OOmg人臍帶間充質幹細胞複合細胞因子。
5.根據權利要求4所述的修復材料，其特徵在於，所述的修復材料為膠狀修復材料、面膜修復材料或膏狀修復材料。
6.含有如權利要求1所述的永生化人肺微血管內皮細胞複合細胞因子的皮膚護理產品O
【文檔編號】A61P17/02GK104027358SQ201410273880
【公開日】2014年9月10日 申請日期:2014年6月19日 優先權日:2014年6月19日
【發明者】徐妍, 郭世磊, 周炳榮 申請人:徐妍