阿洛酮糖-差向異構酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向異構酶製備d-阿洛酮糖的方法

2023-08-08 05:25:21

專利名稱：阿洛酮糖-差向異構酶的固定化以及使用所述阿洛酮糖-差向異構酶製備d-阿洛酮糖的方法
技術領域：
本發明涉及一種通過使用來源於根癌農桿菌(Agrobacterium tumefaciens)且以食品安全形式表達的阿洛酮糖-差向異構酶(psicose-epimerase)而連續地由D-果糖或D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法。
背景技術：
D-阿洛酮糖已廣泛用作功能性甜味劑，其具有類似於糖的甜味，但卻是超低能量(ultralow-energy)單糖。具體來說，D-阿洛酮糖被稱為「稀有糖」，因為其在自然界中很少能找到，並且即使找到，也只有少量。D-阿洛酮糖是D-果糖的差向異構體Gpimer)，並且其甜味強度和種類完全類似於D-果糖。然而，與D-果糖相反，因為吸收到體內時，D-阿洛酮糖很少被代謝，因此其具有 幾乎零卡路裡。此外，由於其通過抑制關於脂質合成的酶活性而減輕腹部肥胖(abdominalobesity)的作用，因此D-阿洛酮糖可用作減肥食品(diet food)的有效成分。另外，廣泛用作糖替代品的糖醇在過量服用時具有引起諸如腹瀉等副作用的問題，但D-阿洛酮糖幾乎沒有副作用(T.松尾(Matsue7T.), Y.巴巴(Y. Baba), M.橋口 (M. Hashiguchi), K.竹下(K. Takeshita), K.伊珠莫裡(K. Izumori),以及 H.鈴木(H. Suzuki). 2001.膳食 D-阿洛酮糖，即D-果糖的C-3差向異構體,抑制小鼠體內肝脂肪生成酶的活性(Dietary D-psicose,a C-3 epimer of D-fructose,suppresses the activity of hepatic lipogenic enzymesin rats).亞太臨床營養學雜誌(Asia Pac. J. Clin. Nutr.) 10 :233-237. ；T.松尾，以及K.伊珠莫裡.2004. D-阿洛酮糖，一種不提供能量而提供用於臨床營養學的其它有益作用的稀有糖(D-psicose, a rare sugar that provides no energy and additionallybeneficial effects for clinical nutrition).亞太臨床營養學雜誌 13 :S127)。由於這些原因，D-阿洛酮糖作為膳食甜味劑而逐漸在食品工業領域中引起注意，並且因此，越來越需要開發一種有效製備D-阿洛酮糖的方法。通過使用阿洛酮糖-差向異構酶製備D-阿洛酮糖的常規方法，著重於開發一種通過使用在重組大腸桿菌(E.coli)中大規模表達的重組酶或包括所述重組酶的宿主細胞而使D-果糖差向異構化為D-阿洛酮糖的方法。然而，就食品安全性來說，使用所述重組大腸桿菌進行D-阿洛酮糖的生物技術製備並不適合用於製備作為食品材料的D-阿洛酮糖。為了製備適合用作食品材料的D-阿洛酮糖，需要開發一種使用在宿主細胞中表達的阿洛酮糖-差向異構酶或使用包括其的宿主的大規模生產方法，所述宿主細胞為公認安全(Generally RecognizedAs Safe ；GRAS)菌株以及能夠在工業上大規模生產的菌株。當物質在經通過科學訓練及經驗而具有資格的專家通過科學程序在其預期用途的條件下評估其安全性時一般被確認為安全，則授予GRAS。雖然GRAS是僅在美國實施的獨特系統，但其重要性以及必要性已在國際上以及在美國得到認可。因此，人們越來越關注GRAS的發展。
同時，對於D-阿洛酮糖的工業生產，需要開發一種由更廉價的底物(substrate)製備D-阿洛酮糖的方法。目前，由於阿洛酮糖-差向異構酶的高底物特異性，因此製備D-阿洛酮糖只能使用昂貴的D-果糖作為底物。

發明內容
技術問題本發明已對大規模生產可用作食品材料的D-阿洛酮糖進行了積極研究，並且發現由D-果糖或D-葡萄糖連續製備D-阿洛酮糖可通過使用固定化(immobilization)來對用於工業上大規模生產D-阿洛酮糖的酶促活化(enzymatic activation)提供穩定的環境，並使用D-葡萄糖異構酶以及阿洛酮糖-差向異構酶來達成。本發明的一目的在於提供一種呈食品安全形式的阿洛酮糖-差向異構酶，用於製備可用作食品材料的D-阿洛酮糖。本發明的另一目的在於提供一種通過使用呈固定的食品安全形式的阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶而由D-葡萄糖或D-果糖連續製備D-阿洛酮糖的方法。技術解決方案本發明提供一種通過使用來源於根癌農桿菌且在GRAS菌株中表達的阿洛酮糖-差向異構酶而由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法。本發明的方法包括以下步驟在GRAS菌株中表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶；以及通過使用所表達的阿洛酮糖-差向異構酶而由D-果糖製備D-阿洛酮糖。本發明的方法還可包括以下步驟自能夠表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物(culture)分離阿洛酮糖_差向異構酶；以及通過使用所分離的阿洛酮糖-差向異構酶而由D-果糖製備D-阿洛酮糖。表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株可為經過包含編碼上述酶的基因的重組表達載體轉化(transform)的菌株。根據本發明的用於製備D-阿洛酮糖的阿洛酮糖-差向異構酶可呈包含於GRAS菌株的培養物中或從所述培養物分離的形式，上述GRAS菌株表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶。GRAS菌株可為經過包含編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組表達載體轉化的菌株。GRAS菌株可為棒狀桿菌屬(Corynebacterium sp.),優選為穀氨酸棒狀桿菌(Corynebacterium glutamicum) KCCM 11046P。本發明的方法中使用的來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶優選具有SEQID NO 1的胺基酸序列。根據本發明的製備D-阿洛酮糖的方法可還包括將阿洛酮糖-差向異構酶固定於載體上的步驟。適合於本發明的載體可包含海藻酸鹽(alginate)，優選為海藻酸鈉，但不限於此。根據本發明的製備D-阿洛酮糖的方法可還包括用其上固定有阿洛酮糖-差向異構酶的載體填充管柱，並向填充床管柱(packed-bed column)供應D-果糖溶液的步驟。本發明還更提供一種由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶(isomerase)固定於載體上的步驟。適合於本發明的載體可包含海藻酸鹽，優選為海藻酸鈉，但不限於此。在如上文所述的方法中，阿洛酮糖-差向異構酶可包含於能夠表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物中或從所述培養物分離。GRAS菌株可為經過包含編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組表達載體轉化的菌株。此外，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬，優選為穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。本發明的方法中所用的來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶優選具有SEQID NO 1的胺基酸序列。另外，本發明更提供一種由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其包括以下步驟將阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶固定於載體上；用其上固定有阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶的所述載體填充管柱；以及向填充床管柱供應D-葡萄糖溶液。其上固定有阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶的載體可填充於同一管柱中，或分別填充於兩個各別管柱中。然而，優選將載體填充於各別管柱中，且在這種情況下，兩 個各別管柱互相連接。本發明提供一種適用於由D-果糖或D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的穀氨酸棒狀桿菌 KCCM 11046P 菌株。如本文中所使用，術語「食品安全形式」的意思是其安全性足以用作食品材料。因此，如本文中所使用，術語「以食品安全形式表達」的意思是目標基因在被認為安全且儘管用作食品材料卻不會引起有害作用的菌株(例如GRAS菌株)中表達。在本發明的一個實施例中，用重組載體轉化GRAS菌株的方法可包含電穿孔，但不限於此，並且可使用本發明所屬領域的技術人員已知的任何轉化方法來進行。在本發明的一個實施例中，包含編碼來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組載體可包含阿洛酮糖-差向異構酶編碼基因，其為可操作地連接於在棒狀桿菌屬細菌中具有活性的啟動子(promoter)。所述啟動子可具有序列SEQ ID NO :2到SEQ IDNO 8中的一個，已證實上述序列表達目標基因的有效性聞於棒狀桿菌屬細菌中的tac啟動子(韓國專利公開案第2006-0068505號)。如本文中所使用，術語「阿洛酮糖-差向異構酶」的意思是具有使D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化活性的D-阿洛酮糖-3-差向異構酶。在本發明的一個實施例中，來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶可具有SEQ ID NO : I的胺基酸序列或其功能性片段(functional fragment)。功能性片段的意思是在胺基酸序列SEQ ID NO :I中包含由一些胺基酸的取代、插入或缺失或其類似情況所產生的突變，但具有使D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化活性的片段。在本發明的一個實施例中，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬菌株。棒狀桿菌屬菌株是一種製備在動物飼料、藥物以及食品領域等中具有各種用途的化學物質的工業用微生物，所述化學物質包含L-賴氨酸、L-蘇氨酸以及各種核酸。所述棒狀桿菌屬菌株是GRAS (公認安全)菌株，並且具有容易進行基因操作以及大規模培養的性質。此外，棒狀桿菌屬菌株在各種處理條件下具有高穩定性，與其它細菌相比具有相對硬質的細胞壁結構，從而具有甚至在由高糖濃度引起的高滲透壓等下也存在呈穩定狀態的細胞團(cell mass)的生物性質。
在本發明的一個實施例中，棒狀桿菌屬菌株可為穀氨酸棒狀桿菌。在本發明的一個實施例中，表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株可為重組菌株穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。阿洛酮糖-差向異構酶可容易地通過所屬領域的技術人員通常已知的突變誘發(mutagenesis)(諸如定向進化(directed evolution)以及點突變(site-directedmutagenesis)等)來進行修飾。因此,應解釋為，與由SEQ ID NO :I表示的阿洛酮糖-差向異構酶的胺基酸序列具有一定程度的序列同源性(sequence homology)(諸如70%或高於70 %、優選80 %或高於80 %、更優選90 %或高於90 %的序列同源性)並且在GRAS菌株中以活性形式(active form)表達的重組酶，以及包括所述重組酶的宿主細胞都在本發明的範圍內。表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物可通過在 培養基中且在培養條件下培養經過轉化的細菌來獲得，所述培養條件容易由本發明所屬領域的技術人員根據菌株性質加以選擇。培養方法可包含所屬領域的技術人員已知的任何培養方法，諸如分批培養(batch culture)、連續培養(continuous culture)以及分批補料式培養(fed-batch culture),但不限於此。根據本發明的一個實施例製備D-阿洛酮糖的方法可包括從表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物分離阿洛酮糖-差向異構酶的步驟。在本發明的一個實施例中，通過離心、過濾等從表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的菌株的培養物分離的細胞；或通過使分離的細胞均質化(homogenize)並離心所獲得的上清液；或通過分級分離(fractionation)、層析(chromatography)等從所述上清液分離並純化的阿洛酮糖-差向異構酶可用作用於使D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的酶。在本發明的一個實施例中，阿洛酮糖-差向異構酶可呈在培養物中的細胞團的形式或從所述細胞團分離的阿洛酮糖-差向異構酶的形式。在本發明的一個實施例中，製備D-阿洛酮糖的步驟可還包括將阿洛酮糖-差向異構酶或表達阿洛酮糖-差向異構酶的細胞團固定於載體上的步驟。因為在將酶或細胞團固定於載體上的情況下，可提供用於長時間維持活性的環境，所以所述固定化已用於使用酶或微生物的工業生產方法中。可用於固定化的載體可包含海藻酸鹽，諸如海藻酸鈉，但不限於此。在本發明的一個實施例中，固定化可通過使用海藻酸鈉作為載體來進行。海藻酸鈉是一種天然膠態多糖，其在藻類的細胞壁中大量存在，由-D-甘露糖醛酸(-D-mannuronic acid)以及-L-古洛糖醒酸(_L-guluronic acid)組成,並且通過一定含量的隨機_1，4連接而形成，因此，對於將細胞團或酶穩定地固定於其上是有利的。在本發明的一個實施例中，固定化可通過使用I. 5%到4. 0%海藻酸鈉作為載體來進行。在本發明的一個實施例中，固定化可通過使用2%海藻酸鈉作為載體來進行。在本發明的一個實施例中，通過使用海藻酸鈉作為用於固定化的載體，所述固定化可通過將I到2倍體積的海藻酸鈉水溶液添加到含有酶或細胞團的樣品中，使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入0. I摩爾濃度鈣離子溶液中，以在珠粒中形成酶或細胞團-海藻酸鹽複合物來進行。在本發明的一個實施例中，將阿洛酮糖-差向異構酶固定於載體上的步驟可還包括用固定的酶填充管柱，並向所述填充管柱供應D-果糖溶液的步驟。待用其上固定有酶或細胞團的載體填充的管柱、以及用所述載體填充所述管柱的方法可適當地且容易由本發明所屬領域的技術人員根據所用的酶或細胞團、或用於固定化的載體進行選擇。在本發明的一個實施例中，有可能通過用固定酶填充管柱來製備填充床管柱。酶促反應(即，D-果糖轉化為D-阿洛酮糖)可通過向填充床管柱供應作為其底物的D-果糖溶液來進行。在本發明的一個實施例中，當向填充有包含阿洛酮糖-差向異構酶的細胞團的填充床管柱供應恆定濃度的D-果糖溶液時，差向異構化反應通過固定的細胞團進行，從而導致D-果糖轉化為D-阿洛酮糖。通過使用分離管柱進行分離並純化，然後可以純D-阿洛酮 糖的形式獲得轉化的D-阿洛酮糖。如本文中所使用，術語「固定化反應器」的意思是其中通過固定於載體上的細胞團或酶進行製備D-阿洛酮糖的反應的反應器，或填充有固定於載體上的細胞團或酶的管柱。即，固定化的意思是將提供生物活性的物質，在這種情況下是將阿洛酮糖-差向異構酶或D-葡萄糖差向異構酶或包含其的細胞團固定於載體上。如本文中所使用，術語「操作穩定性」的意思是可操作用於連續製備目標產物(諸如D-阿洛酮糖)的生物反應器，同時與其初始活性相比維持合適的生產力水平，且一般由操作期(operation period)表不。在本發明的一個實施例中，在50°C下向填充有其上固定有表達阿洛酮糖-差向異構酶的細胞的載體的管柱以O. I分鐘/毫升的流入速率供應300克/升D-果糖，這使得有可能確保25天或25天以上的操作穩定性。本發明更提供一種由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶固定於載體上的步驟。如上文所述，因為用作阿洛酮糖-差向異構酶的底物的D-果糖較昂貴，所以需要由廉價的底物(諸如D-葡萄糖)製備D-阿洛酮糖以用於D-阿洛酮糖的工業大規模生產。D-葡萄糖異構酶是使D-葡萄糖轉化為D-果糖的酶，且因此，可通過使D-葡萄糖轉化為D-果糖來提供阿洛酮糖-差向異構酶的底物。因此，有可能通過使用這兩種酶由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖。在本發明的一個實施例中，阿洛酮糖-差向異構酶可為表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物，或從所述培養物分離的細胞團或阿洛酮糖-差向異構酶。在本發明的一個實施例中，D-葡萄糖異構酶可為表達D-葡萄糖異構酶的GRAS菌株的培養物，或從所述培養物分離的細胞團或D-葡萄糖異構酶。在本發明的一個實施例中，阿洛酮糖-差向異構酶可具有SEQ ID NO 1的胺基酸序列。在本發明的一個實施例中，D-葡萄糖異構酶可購得。舉例來說，可使用購自諾維信公司(Novozymes A/S)(丹麥鮑斯韋(Bagsvaerd, Denmark))的D-葡萄糖異構酶或固定D-葡萄糖異構酶。D-葡萄糖異構酶是一種使D-葡萄糖轉化為D-果糖的代表性酶，並且當前用於製備果寡糖(fructo-oligosaccharides)。在當前用於工業生產的酶中，D-葡萄糖異構酶是活性以及機制已得到清楚鑑別的酶之一。
在本發明的一個實施例中，GRAS菌株可為經過包含編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因以及編碼D-葡萄糖異構酶的基因的重組載體轉化的菌株，或經過包含上述基因每一個的重組載體共轉化(co-transform)的菌株。在本發明的一個實施例中，GRAS菌株可為棒狀桿菌屬細菌。在本發明的一個實施例中，表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株可為重組菌株穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。在本發明的一個實施例中，用於固定化的載體可為海藻酸鈉。在本發明的一個實施例中，固定化可通過使用I. 5%到4. 0%海藻酸鈉作為載體來進行。在本發明的一個實施例中，固定化可通過使用2%海藻酸鈉作為載體來進行。在本發明的一個實施例中，通過使用海藻酸鈉作為用於固定化的載體，所述固定化可通過將I到2倍體積的海藻酸鈉水溶液添加到含有酶或細胞團的樣品中，使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入0. I摩爾濃度的鈣離子溶液中而以在珠粒中形成酶或細胞團-海藻酸鹽複合物來進行。在本發明的一個實施例中，編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因以及編碼D-葡萄糖異構酶的基因可在相同的GRAS菌株中表達或分別在不同的兩種GRAS菌株中表達，並且固定化步驟可通過將所培養GRAS菌株的細胞或從所述細胞分離的兩種酶的混合物固定於載體上來進行。在本發明的一個實施例中，可分別將表達阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物或從培養物分離的細胞團塊或阿洛酮糖-差向異構酶，以及D-葡萄糖異構酶固定於載體上。在本發明的一個實施例中，本發明的方法可還包括用其上固定有細胞或酶的載體填充管柱的步驟。根據本發明由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法可還包括用固定的阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶填充管柱，並向所述填充的管柱供應D-葡萄糖溶液的步驟。
在本發明的一個實施例中，填充床管柱可通過用固定酶填充管柱來製備。酶促反應(即D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖)可通過向填充床管柱供應作為其底物的D-葡萄糖溶液來進行。在本發明的一個實施例中，固定的阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶可分別填充於各別管柱中。待用其上固定有酶或細胞的載體填充的管柱以及用所述載體填充所述管柱的方法可適當地且容易地由本發明所屬領域的技術人員根據所用的酶或細胞團或用於固定化的載體進行選擇。在本發明的一個實施例中，有可能分別用固定阿洛酮糖-差向異構酶的載體以及固定D-葡萄糖異構酶的載體填充兩個各別管柱，彼此連通而連接這兩個管柱，以將D-果糖作為異構化產物而從填充有D-葡萄糖異構酶的管柱轉移到填充有阿洛酮糖-差向異構酶的管柱，並誘導D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化反應。當向由所述兩個連通的管柱組成的固定化反應器供應作為底物的D-葡萄糖溶液時，D-葡萄糖在填充有D-葡萄糖異構酶的管柱中轉化為D-果糖，並且轉移到填充有阿洛酮糖-差向異構酶的管柱的D-果糖轉化為D-阿洛酮糖。因此，有可能由D-葡萄糖獲得D-阿洛酮糖而作為最終產物。有利作用根據本發明製備D-阿洛酮糖的方法可由D-葡萄糖或D-果糖大規模且連續地製備可用作食品材料的呈食品安全形式的D-阿洛酮糖。



圖I示意性說明構築包含編碼來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組表達載體pCJ-1-ATPE的方法。圖2說明對於根據本發明的一個實施例的方法，通過HPLC測量來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的活性的結果，其中圖2a顯示各糖的參考標準(referencestandard),且圖2b顯示通過反應進行的轉化。圖3說明對於根據本發明的一個實施例的方法，通過使用重組菌株在100克/升(3a)、300克/升(3b)或500克/升(3c)的D-果糖與40°C、45°C或50°C反應溫度的組合條件下得到的D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化％。圖4說明對於根據本發明的一個實施例的方法，取決於作為底物的D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產力。圖5說明對於根據本發明的一個實施例的方法，在50°C的反應溫度下固定化反應器的操作穩定性。相對活性)的意思是相對於操作起始時的活性的活性。圖6說明對於根據本發明的一個實施例的方法，通過使用表達阿洛酮糖-差向異構酶的固定重組菌株以及固定D-葡萄糖異構酶在100克/升(6a)、300克/升(6b)或500克/升(6c) D-葡萄糖與40°C、45°C或50°C反應溫度的組合條件下得到的D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化％。圖7說明對於根據本發明的一個實施例的方法，取決於D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產力。
具體實施例方式下文通過以下特定實例更詳細地說明本發明。然而，這些實例是用於說明並且本發明的範圍不限於所述實例。阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶活性的測量阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶的活性是通過分別使用D-果糖以及D-葡萄糖作為底物進行測量。將酶或含有所述酶的樣品添加到含有100克/升底物的50毫摩爾濃度的PIPES(哌嗪-N，N'-雙(2-乙烷磺酸))緩衝液(pH 8.0)中，隨後在50°C下反應I小時，並接著通過在100°C下加熱反應5分鐘來終止反應。通過裝備有折射率(Refractive Index ；RI)檢測器的HPLC測量D-果糖、D-葡萄糖以及D-阿洛酮糖的濃度。通過將樣品注射到設定為80°C的Supelcogel Pb (商品名)管柱中，並接著使蒸懼水作為移動相以O. 5毫升/分鐘的速率通過所述管柱來進行HPLC分析。在約32分鐘的滯留時間分離出D-阿洛酮糖，且基於D-阿洛酮糖參考標準定量的量來計算其轉化％以及生產力。對於酶活性的比較分析，將酶的一個單位定義為在PH 8.0以及50°C下每分鐘產生I摩爾的D-阿洛酮糖的酶的量。實例I :表達阿洛酮糖-差向異構酶的重組菌株(I)重組菌株的製備通過使用根癌農桿菌ATCC 33970的基因組DNA作為模板並分別引入了 PstI以及XbaI限制酶識別位點的SEQ ID NO 9以及SEQ ID NO 10的寡核苷酸作為引物來進行聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction ;PCR),以擴增編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因。PCR條件如下在95°C下變性30秒後，26個循環由在95°C下30秒、在55°C下30秒以及在68°C下I分鐘組成，接著在68°C下延伸10分鐘。對於由擴增基因編碼的阿洛酮糖-差向異 構酶的大規模表達，用限制酶PstI以及XbaI消化擴增的PCR產物，並插入來源於棒狀桿菌屬細菌(在2004年11月6日以保藏編號KCCM-10611保藏於韓國菌種保藏中心(KoreanCulture Center of Microorganisms ;KCCM),其為國際保藏機構)的穿梭載體(shuttlevector) pCJ-1中，以構築重組表達載體pCJ_l_ATPE。圖I示意性顯示製備包含編碼來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組表達載體pCJ-1-ATPE的方法。通過使用電穿孔進行轉化將重組表達載體pCJ-1-ATPE引入穀氨酸棒狀桿菌ATCC13032中，以製備表達編碼來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組菌株。所述重組菌株被定名為穀氨酸棒狀桿菌ATPE,且根據布達佩斯條約(Budapest Treaty)而在2009年10月26日以保藏編號KCCM11046P保藏於韓國菌種保藏中心(KCCM，韓國首爾西大門區弘濟 I 洞(Hongje-l-dong, Seodaemum-gu, Seoul, Korea))。(2)阿洛酮糖-差向異構酶的表達在0D600 = 0. I的初始濃度下分別對包含10微克/毫升卡那黴素(kanamycin)的MB培養基(巴克託-胰蛋白腖(Bacto-tryptonUO克/升、巴克託-酵母提取物(Bacto-yeast extract) 5克/升、NaCl 5克/升、大豆腖(Soytone) 5克/升)接種由上述(I)中所獲得的重組菌株，隨後在30°C下培育24小時，以誘導重組阿洛酮糖-差向異構酶的表達。在0D600 = 0.6下對含有3升改良培養基(D-葡萄糖80克/升、大豆腖20克/升、(NH4)2SO4 10克/升、KH2PO4 I. 2克/升、MgSO4 I. 4克/升)並包含10微克/毫升卡那黴素的5升搖瓶發酵罐接種以由上述獲得的培養物，隨後在30°C下培育20小時。為了測量所表達的阿洛酮糖-差向異構酶的活性，在8000 X g下對培養物進行離心10分鐘以收集細胞。接著將所收集的細胞再懸浮於50毫摩爾濃度EPPS的緩衝液(pH 8.0)中(西格瑪奧德裡奇公司(Sigma-Aldrich))並且對所得懸浮液進行超聲波處理，導致細胞裂解(lysis)。對細胞裂解產物進行離心以獲得含有阿洛酮糖-差向異構酶的上清液，並且通過使用所述上清液作為酶進行D-果糖的差向異構化反應。在差向異構化反應中使用如上文所述測量阿洛酮糖-差向異構酶的活性。圖2b示出差向異構化反應的HPLC分析結果。實例2 :重組菌株的固定化以及D-阿洛酮糖的製備(I)重組菌株的固定化對於D-阿洛酮糖的大規模生產，在這一實例中將表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶且在以上實例I中製備的穀氨酸棒狀桿菌ATPE(KCCM 11046P)固定於載體上。對於重組菌株的固定化，首先在0D600 = 0.6的初始濃度下對實例I中所用的用於棒狀桿菌屬的改良培養基接種重組菌株，隨後在30°C下培育20小時。培育完成後，對所得培養物進行離心以回收細胞，將其於50毫摩爾濃度的EPPS緩衝液(pH 8.0)中再懸浮至20%。將再懸浮的重組菌株細胞添加到2% (v/v)海藻酸鈉水溶液中。通過使用注射泵以及真空泵將所得混合物滴入100毫摩爾濃度的CaCl2溶液中，以形成細胞-海藻酸鹽複合物，其中細胞被截留於海藻酸鈉珠粒中。(2)通過使用固定重組菌株製備D-阿洛酮糖用上述(I)中的固定於海藻酸鈉上的重組菌株來填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米,安瑪西亞公司(Amersham pharmacia)),隨後測量D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化包％ (% conversion pack)。為了確定固定化反應器的最佳反應溫度以及D-果糖的底物濃度，在40°C、45°C以及50°C的反應溫度與100克/升、300克/升以及500克/升D-果糖濃度的組合條件下進行D-果糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化反應。根據圖3a到圖3c，發現在50°C的溫度以及100克/升D-果糖濃度下達成最佳轉化，並且300克/升以及500克/升D-果糖濃度也產生高轉化率。此外，不同於其它D-葡萄糖轉化反應，D-阿洛酮 糖的差向異構化反應對溫度顯示出低依賴性(low dependency)。(2-1)取決於D-果糖的流入速率的生產力用如上文所述的固定重組菌株來填充XK16填充床管柱，隨後測量取決於D-果糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產力。此時，基於上述(2)的結果，分別將D-果糖的濃度以及反應溫度設定為300克/升以及50°C。通過將D-果糖(底物)的流入速率調整為O. 4、1、2、4以及8小時―1的空間速度(I/小時)來測量生產力。結果展示於下表I以及圖4中。表I[表 I][表]取決於D-果糖的流入速率的生產力以及轉化％
I 流入速率 ^D-果糖^ D-阿洛酮糖生產力 ^轉化率^I
(毫升/分鐘) (克/井) (克/升) (克/升/小時) (％)
3^281.388 — 3.693331.30
2289.215 — 3.309201.13
I^291.268 — 7.579 — 232.54
0.5............................................. 284.639—— 12.055184.06
0.25286.463 — 20.579 — 156.70
1..........................................................................................0.1260.096 38.041I!12.76 I(2-2)操作穩定性在50°C下分別通過使用填充於XK16填充床管柱中的固定重組菌株進行操作直到其比活性(specific activity)變成50%，以測量填充入管柱中的固定重組菌株的操作穩定性。此時，D-果糖的底物濃度是300克/升且其流入速率是O. I分鐘/毫升(空間速度是O. 4小時―1)。發現在這些反應條件下可維持25天或長於25天的操作穩定性。圖5顯示在50°C的反應溫度下固定重組菌株的操作穩定性。實例3 :通過使用固定的重組菌株/酶而由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖
(I)取決於反應溫度以及D-葡萄糖濃度的生產力分別用以上實例2中固定於海藻酸鈉上的重組菌株以及10克固定的D-葡萄糖異構酶(丹麥諾維信公司)來填充XK16填充床管柱(16毫米X 20毫米，安瑪西亞公司)，隨後測量D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化％。為了確定用於兩種混合酶的最佳反應條件，在40°C、45°C或50°C的反應溫度與100克/升、300克/升或500克/升的D-葡萄糖濃度的組合條件下進行D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化反應。圖6顯示D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化％，其取決於反應溫度以及底物濃度的變化。根據圖6a到圖6c，不同於D-阿洛酮糖的差向異構化反應，D-葡萄糖的異構化反應是溫度依賴性反應(temperature-dependent reaction)。S卩，反應溫度越高,D-葡萄糖轉化為D-阿洛酮糖的轉化速率越快。發現這最終對D-阿洛酮糖的生產力具有影響。在50°C的溫度下達成D-葡萄糖轉化為D-果糖的最佳轉化率，並且當底物濃度增加到較高時，反應速率不存在顯著差異。這些結果證明有可能在較高底物濃度條件下操作固定化反應器，並且增加從D-葡萄糖到D-阿洛酮糖的生產力。

(2)取決於D-葡萄糖的流入速率的生產力分別用包含阿洛酮糖-差向異構酶的固定重組菌株以及固定的D-葡萄糖異構酶填充兩個填充床管柱，並且測量取決於D-葡萄糖的流入速率的D-阿洛酮糖的生產力。基於以上實例的結果，分別將D-葡萄糖的濃度以及反應溫度設定為300克/升以及50°C。通過將D-果糖(底物)的流入速率調整為0.4、1、2、4以及8小時―1空間速度(I/小時)來測量生產力。結果展示於下表2以及圖7中。表2[表2][表]取決於D-葡萄糖的流入速率的生產力以及轉化％
I 流入速 D-葡萄糖^D-果糖^ 生產力 ^轉化率 II (毫升/分鐘) (克/升) (克/升) (克/升/小時) (％) II4281.465 31.1363749,96 I
3278.849 ~40.042360 — 12.56
2^67.061 50.196301 — 15.82
I138.615 78.854237 — 24.84
0.5........................................................................................^Τθ7.168 ^113.081 — 17035.31 |
1............................................0:1172.826 155.85047———47:42■■■■■■——■I

權利要求
1.一種由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其通過使用來源於根癌農桿菌並且在GRAS (公認安全)菌株中表達的阿洛酮糖-差向異構酶，其包括下述步驟 在所述GRAS菌株中表達來源於根癌農桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構酶；以及 通過使用所表達的所述阿洛酮糖-差向異構酶而由D-果糖製備D-阿洛酮糖。
2.根據權利要求I所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，用於製備D-阿洛酮糖的所述阿洛酮糖-差向異構酶是包含於所述GRAS菌株的培養物中或是從所述培養物分離。
3.根據權利要求I所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述GRAS菌株是棒狀桿菌屬。
4.根據權利要求3所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述GRAS菌株是穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。
5.根據權利要求I到4中任一權利要求所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，來源於根癌農桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構酶具有SEQ ID NO :1的胺基酸序列。
6.根據權利要求I到4中任一權利要求所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，製備D-阿洛酮糖的所述步驟包括將所述阿洛酮糖-差向異構酶固定於載體上的步驟。
7.根據權利要求6所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述載體是海藻酸鈉。
8.根據權利要求6所述由D-果糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述方法還包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構酶的所述載體來填充管柱，並且向所填充的所述管柱供應D-果糖溶液的步驟。
9.一種由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其包括將阿洛酮糖-差向異構酶以及D-葡萄糖異構酶固定於載體上的步驟。
10.根據權利要求9所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述阿洛酮糖-差向異構酶是包含於表達來源於根癌農桿菌的阿洛酮糖-差向異構酶的GRAS菌株的培養物中或是從所述培養物分離。
11.根據權利要求10所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述GRAS菌株是經過包含編碼阿洛酮糖-差向異構酶的基因的重組載體轉化的菌株。
12.根據權利要求10所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述GRAS菌株是棒狀桿菌屬。
13.根據權利要求12所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述GRAS菌株是穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P。
14.根據權利要求10到13中任一權利要求所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，來源於根癌農桿菌的所述阿洛酮糖-差向異構酶具有SEQ ID NO :1的胺基酸序列。
15.根據權利要求9所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述載體是海藻酸鈉。
16.根據權利要求9到13中任一權利要求所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，所述方法還包括用其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構酶以及所述D-葡萄糖異構酶的所述載體來填充管柱，並且向經過所述載體填充的所述管柱供應D-果糖溶液的步驟。
17.根據權利要求16所述由D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法，其特徵在於，將其上固定有所述阿洛酮糖-差向異構酶以及所述D-葡萄糖異構酶的所述載體各自分別填充於各別管柱中，並且使所述兩個管柱彼此連通連接。
18.一種穀氨酸棒狀桿菌KCCM 11046P菌株，其適用於由D-果糖或D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖。
全文摘要
本發明涉及一種通過使用來源於根癌農桿菌且以食品安全形式表達的阿洛酮糖-差向異構酶而連續地由D-果糖或D-葡萄糖製備D-阿洛酮糖的方法。
文檔編號C12R1/15GK102869783SQ201080044027
公開日2013年1月9日 申請日期2010年9月1日 優先權日2009年9月30日
發明者洪暎鎬, 金鎮夏, 金成俌, 金政勳, 李英美, 樸承源 申請人:Cj第一製糖株式會社