一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法
2023-07-18 02:15:01 2
一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法
【專利摘要】本發明研究了一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增值、懸浮細胞的培養等步驟，本發明方法所製備的馬錢懸浮細胞品質優良，增值率高，短期內可以獲得大量的懸浮細胞，為馬錢藥用成分的開發和利用提供技術支持。
【專利說明】 一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及組培條件下馬錢懸浮細胞的培養，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]馬致，Strychnos nux~vomica L.,別名:番木鰵、苦實把豆兒等,馬錢科,喬木,枝條幼時被微毛，老枝被毛脫落。葉片紙質，近圓形、寬橢圓形至卵形，性味苦，寒。有毒。分布於東南亞我國的福建、臺灣、廣東、廣西、雲南地區。興奮健胃，消腫毒，涼血。主治四肢麻木，癱瘓，食欲不振，痞塊，癰瘡腫毒，咽喉腫痛。生於海拔600m以下的較炎熱的半山坡凹地、山谷溼處或雜木林、樹叢中。生深山老林中，喜熱帶溼潤性氣候，怕霜凍，而以石灰質壤土或微酸性粘壤土生長較好。種子極毒，含有生物鹼，主要為番木鱉鹼(士的寧)及馬錢子鹼，並含有微量的番木鱉次鹼，偽番木鱉鹼，偽馬錢子鹼，奴伐新鹼，士屈新鹼以及脂肪油，蛋白質，綠原酸等，性寒，味苦，有通絡散結，消腫止痛之效。西醫學上用種子提取物，作中樞神經興奮劑，目前尚無馬錢繁殖技術的研究報導。
【發明內容】
[0003]本發明所要解決的技術問題是提供馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法，本發明方法所製備的馬錢懸浮細胞品質優良，增值率高，短期內可以獲得大量的懸浮細胞，為馬錢藥用成分的開發和利用提供技術支持。
[0004]為解決上述技術問題，本發明採用下列技術方案:
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水衝洗為35min，超淨工作檯上過氧化氫處理Ilmin,無菌水衝洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養基配方為BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，PH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構鬆散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，採用水平震蕩培養，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養液。
[0005]採用本發明製備的馬錢懸浮細胞生長速度快，操作簡單，能耗小，汙染小。
[0006]下面將結合【具體實施方式】對本發明作進一步闡述，但本發明要求保護的範圍並不局限於下列實施方式。
【具體實施方式】
[0007]實施例1
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水衝洗為35min，超淨工作檯上過氧化氫處理Ilmin,無菌水衝洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構鬆散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養基MS+NAA0.lmg/L+ZTlmg/L+200mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，採用水平震蕩培養，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養液，細胞增長率為67%。
[0008]實施例2
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水衝洗為35min，超淨工作檯上過氧化氫處理Ilmin,無菌水衝洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構鬆散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養基MS+NAA0.2mg/L+ZTl.5mg/L+350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖45g/L，pH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，採用水平震蕩培養，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養液，細胞增長率78%。
[0009]實施例3
取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水衝洗為35min，超淨工作檯上過氧化氫處理Ilmin,無菌水衝洗5遍，消毒處理過的馬錢葉片用強度為100_300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養基配方為BL+KT 2mg/L+ZT2mg/l的培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照強度4001x，光照時間6h/d，溫度24°C，誘導出來的愈傷組織放入培養基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間10h/d，溫度24°C，增值出來結構鬆散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養基MS+NAA0.2mg/L+ZTlmg/L+300mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖45g/L，PH5.8，光照25001x，光照時間12h/d，溫度24°C，採用水平震蕩培養，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養液，細胞增長率80%。
【權利要求】
1.本發明研究了一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法，包括無菌葉片的獲得、愈傷組織的誘導、愈傷組織的增值、懸浮細胞的培養等，主要步驟如下: (1)取馬錢幼嫩的葉片，按照常規的消毒方法對其進行消毒處理； (2)將步驟(I)消毒處理過的馬錢葉片用強度為100-300mT的均勻磁場預處理30min，接入培養基配方為BL+KT2mg/L+ZT2mg/l的培養基中進行愈傷組織誘導，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L, ρΗ5.8，光照強度4001χ，光照時間6h/d，溫度24°C ； (3 )取步驟(2 )誘導出來的愈傷組織放入培養基BL+NAA0.15mg/L+TDZ0.02mg/L+KT2mg/L進行愈傷組織增值培養，附加蔗糖30g/L，瓊脂7g/L，pH5.8，光照ΙΟΟΟΙχ，光照時間 I Oh/d，溫度 24 0C ； (4)取步驟(3)增值出來結構鬆散，顏色淡綠色的愈傷組織放入培養基MS+NAA0.1-0.2mg/L+ZTl-l.5mg/L+200-350mg/L麥芽提取物中進行懸浮細胞培養，附加蔗糖 45g/L，ρΗ5.8，光照 25001χ，光照時間 12h/d，溫度 24。。。
2.按照權利要求1所述的一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法，其特徵在於:步驟(I)中所述馬錢無菌葉片的獲得為，取馬錢的葉片，在洗潔精中浸泡3min，流水衝洗為35min,超淨工作檯上過氧化氫處理Ilmin,無菌水衝洗5遍。
3.按照權利要求1所述的一種馬錢懸浮細胞培養的快速繁殖方法，其特徵在於:步驟(4)中馬錢懸浮細胞的培養採用水平震蕩培養，頻率為120r/min，振幅3cm，每200ml三角瓶放入45ml培養液。
【文檔編號】A01H4/00GK104221880SQ201410540655
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年10月14日 優先權日:2014年10月14日
【發明者】劉東鋒, 楊成東 申請人:南京帝道農業科技有限公司