基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法及其產品的製作方法

2023-08-13 01:54:46

基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法及其產品的製作方法
【專利摘要】本發明公開了基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法及其產品，具體方法是將丙烯醯胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯醯胺溶解於PBS溶液或水中，超聲，得混合液A；再用烯鍵修飾二氧化矽脂質體，然後將蛋白分子分散於烯鍵修飾的二氧化矽脂質體溶液中攪拌，真空脫氣得混液B；氮氣保護下將混合溶液A滴加入混合溶液B中，吹氮氣，攪拌預聚合，然後氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發聚合，繼續攪拌，透析，得基於蛋白分子印跡的靶向脂質體；製得的基於蛋白分子印跡的靶向脂質體由二氧化矽修飾的脂質體作為核，丙烯醯胺類化合物和N，N』-亞甲基雙丙烯醯胺作為殼，能主動識別病灶部位的靶蛋白，能用於介導主動靶向遞藥。
【專利說明】基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法及其產品

【技術領域】
[0001]本發明屬於化學領域，具體涉及基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法，還涉及由該方法製得的產品。

【背景技術】
[0002]分子印跡技術(molecular imprinting technique，MIT)，亦稱分子印記技術、分子烙印技術或分子模板技術，是一種新興的分子識別技術，其目的是製備對模板分子具有特異選擇性識別能力的聚合物，即分子印跡聚合物(MIPs)。分子印跡技術發展至今，相較於小分子印跡技術的日趨成熟，蛋白質等生物大分子印跡技術還相對滯後。分子印跡材料與模板蛋白的結合類似「抗原一抗體」的特異性結合，印跡材料在高溫、高壓、極端PH條件和有機試劑中可保持穩定，便於儲存，所以研發可以在生理條件下識別蛋白質、從而模擬自然過程的分子印跡「人造抗體」具有很大的潛在應用價值。
[0003]與傳統印跡技術相比，表面分子印跡因製備所得聚合物的識別位點處於材料表面，能有效改善傳統方法導致的模板分子過度包埋、不易脫除等問題，這對於蛋白質等大分子印跡有著重要意義。為使所得印跡聚合物粒子化、均一化(微球、納米粒等)，研宄者們往往採用核-殼結構材料來實現表面印跡的目標，即:用預先製備好的微球或納米粒作為支撐基質(「核」)，其上形成的印跡聚合物覆蓋表面為「殼」。這種核-殼結構的印跡策略在通常印跡所需的功能單體之外又引入了一類新的材料，即支撐基質材料。二氧化矽材料具有表面易於修飾、穩定性強、化學/生物惰性、粒徑和分散性可控等特點且其早已被應用於生物醫藥領域，因此，二氧化矽是一類較為理想的支撐基質材料，依託二氧化矽粒子開展表面印跡有望實現對模板蛋白的有效識別並具有較好的潛在應用價值。
[0004]通過在藥物載體表面修飾針對特定疾病組織靶分子(多為蛋白質)的配體來介導並提高載藥系統對靶區的識別是實現主動靶向遞藥的重要途徑。由於生物類分子(如多肽、抗體、核酸適配體等)往往面臨體內穩定性的問題，而表面分子印跡具有「人工抗體」/ 「人工配體」的潛力且印跡位點穩定性強，因此，針對疾病相關靶蛋白開展表面印跡有可能為主動靶向遞藥提供新的手段。


【發明內容】

[0005]有鑑於此，本發明的目的之一在於提供基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法，該製備方法簡單、快捷、成本低；本發明的目的之二在於提供由上述方法製得的基於蛋白分子印跡的靶向脂質體。
[0006]為實現上述發明目的，本發明提供如下技術方案:
[0007]基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法，包括如下步驟:取丙烯醯胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯醯胺按質量比為I?5:1溶解至pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M的PBS溶液或水中，超聲，得混合液A ;再用烯鍵修飾二氧化矽脂質體，然後將蛋白分子分散於烯鍵修飾的二氧化矽脂質體溶液中攪拌，真空脫氣得混合液B ;氮氣保護下將混合液A按體積比為1:1?1:10滴加入混合液B中，吹氮氣，攪拌預聚合，然後氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發聚合，繼續攪拌，透析，得基於蛋白分子印跡的靶向脂質體。
[0008]本發明中丙烯醯胺類化合物優選為N-異丙基丙烯醯胺或丙烯醯胺，丙烯醯胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯醯胺質量比優選為2:1 ；PBS溶液優選為pH 7.4、濃度為0.02M的PBS溶液。
[0009]優選的，所述二氧化矽脂質體的製備方法為:先採用薄膜分散超聲法製備脂質體，然後向脂質體中加入經乙醇溶液分散的正矽酸乙酯，攪拌下用氫氧化鈉溶液調節PH至8?10.4，攪拌過夜，透析，得二氧化矽脂質體。
[0010]更優選的，所述正矽酸乙酯的加入量按磷脂:正矽酸乙酯:H20的摩爾比為1:8:344。
[0011]更優選的，所述乙醇溶液的體積分數為5%?25%。
[0012]優選的，所述薄膜分散超聲法製備脂質體的方法是將磷脂和膽固醇溶於體積比為1:1的氯仿與甲醇的混合溶液中，減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成透明脂質薄膜，加水水化，超聲，得脂質體。
[0013]更優選的，所述磷脂和膽固醇的質量比為7:3，在此比例下形成的脂質體更利於後續修飾。
[0014]本發明中磷脂優選為大豆卵磷脂或蛋黃卵磷脂。
[0015]優選的，所述超聲的條件為在800W條件下超聲50次，每次超聲10s，間隔1s後繼續超聲。
[0016]優選的，所述水化的條件是在37°C條件下水化I小時。
[0017]更優選的，所述蛋白分子為金黃色葡萄球菌蛋白A或基質金屬蛋白MMPs。
[0018]2、由所述的製備方法製得的基於蛋白分子印跡的靶向脂質體。
[0019]本發明的有益效果在於:本發明公開了基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法，製備方法簡單，成本低，快捷，製得的蛋白分子印跡聚合物以脂質體作為中心支撐物，利用脂質體原有的載藥與遞藥優勢，且粒徑易控制；由於在脂質體的外周修飾了一層二氧化矽薄膜，能夠提高藥物的穩定性，減少酸度、溫度及酶等不利因素的影響並具有藥物緩釋能力，此外在矽材料表面通過引入烯鍵，能使蛋白與單體材料共聚交聯於殼表面，使投入的單體材料量低，還能避免聚合後分散體易出現的凝膠化，而使未團聚的印跡顆粒更易收集，以更好的實現表面印跡，將印跡後的脂質體用於載藥，能夠提高脂質體的靶向性。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]為了使本發明的目的、技術方案和有益效果更加清楚，本發明提供如下附圖:
[0021]圖1為紅外光譜測定二氧化矽修飾的脂質體(S-LIP)、烯鍵修飾後的二氧化矽脂質體(MS-LIP)及金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)的結構特徵峰(a為SPA-MIPs, b 為 MS-LIP，c 為 S-LIP)。
[0022]圖2為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)及非印跡聚合物(NIPs)動態吸附實驗結果圖。
[0023]圖3為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)及非印跡聚合物(NIPs)等溫吸附實驗結果圖。
[0024]圖4為金黃色葡萄球菌印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)的非特異性吸附實驗結果圖。
[0025]圖5為金黃色葡萄球菌對包載6-氨基螢光素的SPA印跡聚合物(FAM_SPA_MIPs)、包載6-氨基螢光素非印跡聚合物(FAM-NIPs)和6-氨基螢光素出-FAM)的攝取實驗結果圖。
[0026]圖6為金黃色葡萄球菌對包載6-氨基螢光素的SPA印跡聚合物(FAM_SPA_MIPs)、包載6-氨基螢光素非印跡聚合物(FAM-NIPs)和6-氨基螢光素出-FAM)對金黃色葡萄球菌的抑菌實驗結果圖。
[0027]圖7為基質金屬蛋白酶印跡的靶向脂質體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的動態吸附實驗結果圖。
[0028]圖8為基質金屬蛋白酶印跡的靶向脂質體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的等溫吸附實驗結果圖。
[0029]圖9為基質金屬蛋白酶印跡的靶向脂質體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的特異性吸附實驗結果圖。
[0030]圖10為U937細胞對包載阿黴素的基質金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物(DOX-MMP-2-MIPs)與包載阿黴素的非印跡聚合物(DOX-NIPs)的攝取實驗螢光顯微鏡結果圖。

【具體實施方式】
[0031]下面將結合附圖，對本發明優選實施例進行詳細的描述。實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件或按照製造廠商所建議的條件。
[0032]實施例1、金黃色葡萄球菌蛋白A(SPA)印跡的靶向脂質體的製備及其評價
[0033]SPA印跡的靶向脂質體的製備方法，包括如下步驟:
[0034](I)採用薄膜分散超聲法製備脂質體，具體方法為:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用體積比為1:1的氯仿與甲醇混合溶液ImL溶解，然後在37°C條件下減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質薄膜，加純水ImL於37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀在800W超聲50次，每次超聲1s後間隔1s繼續超聲，得脂質體(LIP)；
[0035](2)採用溶膠法製備表面修飾二氧化矽的脂質體，具體方法為:按磷脂:正矽酸乙酯(TEOS):H20摩爾比為1:8:344 (mol/mol)向脂質體中緩慢加入經體積分數為10%乙醇分散的TE0S，然後在攪拌條件下用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8?10.4，室溫(18-25? )攪拌過夜，將混合物透析除去體系中未沉積的二氧化矽前驅體，得表面修飾二氧化矽的脂質體，命名為二氧化矽脂質體(S-LIP);
[0036](3)烯鍵修飾二氧化矽脂質體，具體方法為:將50 μ L的3-巰基_1_丙烷磺酸鈉(MPS)緩慢滴加到250 μ L的乙醇中分散半小時後，然後取10 μ L分散液滴加到2ml 二氧化矽的脂質體中室溫(18-25? )攪拌過夜，即得烯鍵修飾的二氧化矽脂質體(MS-LIP);
[0037]⑷SPA印跡的靶向脂質體的製備，具體方法為:取丙烯醯胺(AAM) 4mg和N-N亞甲基雙丙烯醯胺(MAA) 2mg溶解到20ml pH為7.4、濃度為0.02M的PBS中，超聲溶解，得混合溶液A，然後將2mg SPA分散在ImL烯鍵修飾的二氧化矽脂質體溶液中並放置於室溫攪拌0.5h，再將混合物進行真空脫氣lOmin，得混合溶液B，在氮氣保護下取200 μ L混合溶液A滴加入混合溶液B中，並吹氮氣lOmin，室溫(18_25°C )攪拌下預聚合lh，氮氣保護下滴加7 UL過硫酸銨(APS，10%，ff/ff)和4.5 yL四甲基乙二胺(TEMED，5%，W/V)於混合物中引發聚合，然後再放置於室溫(18-25? )攪拌24h，用純水透析一周，除去模板分子及未反應的試劑，凍幹至恆重即金葡菌表面蛋白SPA印跡聚合物(簡稱為SPA-MIPs)。
[0038]本實施例中丙烯醯胺可以直接替換為N-異丙基丙烯醯胺，並且N-異丙基丙烯醯胺與N-N亞甲基雙丙烯醯胺的質量比在I?5:1，並使混合溶液A中N-異丙基丙烯醯胺和N-N亞甲基雙丙烯醯胺的總濃度為I?5mg/ml ;分散TEOS時乙醇的體積分數為5%?25%;PBS溶液為pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M範圍內均能實現發明目的。
[0039]非印跡聚合物(NIPs)的合成除不加入模板蛋白分子外，其他製備方法同上。
[0040]對本發明所構建的靶向製劑進行了初步表徵:稱取製備好的S-LIP和SPA-MIPs在25°C下，採用馬爾文雷射粒度儀測定其粒徑大小及分布情況，並重複測定三次。結果顯示，S-LIP的平均粒徑為147.9 + 40.5nm，PI值為0.214±0.015，其分散性比較好，經印跡聚合後SPA-MIPs的平均粒徑為200.5±60.5nm，PI值為0.22±0.018，表明SPA-MIPs製劑粒徑較小，分布均勻。另外，採用紅外光譜測定S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs的結構特徵峰，具體為:首先將S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs分別經冷凍乾燥處理，然後將KBr分別與S-LIP、MS-LIP、SPA-MIPs按質量比為100:1置於瑪瑙研缽中混合均勻，最後碾壓，壓片後採用傅立葉紅外光譜儀進行測定，測定結果如圖1所示。結果顯示，S-LIP(圖1中c)在1087CHT1處出現了
S1-O-Si鍵的特徵吸收峰；MS-LIP (圖1中b)在1712CHT1處的出現了是S1-C = C特徵吸收峰，表明二氧化矽的表面成功地接枝了烯鍵。SPA-MIPs(圖1中a)經印跡聚合後，1712CHT1處的吸收峰消失，表明印跡型脂質體SPA-MIPs製備成功。
[0041]SPA印跡的靶向脂質體的吸附實驗:為考察製備得到的SPA-MIPs對SPA的特異性吸附能力，採用以下方法對其進行驗證。
[0042]動態吸附實驗:先對SPA進行FITC螢光標記，具體是取4mg SPA溶於0.2M Na2PO4溶液中，另取0.16mg FITC溶於0.2M Na2PO4溶液中，使FITC與SPA的摩爾比為1.2:1，磁力攪拌下，將含SPA的溶液滴加入含FITC的溶液中，避光反應1.5h ;反應結束後，在8000r/min條件下離心1min以除去沉澱SPA，取上清液用Sephadex G-50凝膠柱進行分離純化，凍幹，即得 FITC-SPAo 然後將 5mg SPA-MIPs 和 NIPs 分別與 5ml 的 0.2mg/ml FITC-SPA 溶液於37°C振蕩孵育，分別於0.25h、0.5h、lh、2h和4h取出lmL，以4500r/min離心1min,?!定上清液的螢光強度，結果如圖2所示。結果顯示，SPA-MIPs及NIPs對FITC-SPA的吸附隨著時間的增加而增加，在2h達到動態平衡。並且，動態吸附平衡時，SPA-MIPs對FITC-SPA的吸附量為NIPs的5倍左右，說明本發明構建的分子印跡靶向聚合物載體對蛋白具有很好的重吸附能力。
[0043]等溫吸附實驗:精確稱取Img SPA-MIPs和NIPs分別置於離心管中，分別與Iml的0.05mg/ml、0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml 的 FITC-SPA 溶液在 37°C條件下振蕩孵育2h，孵育後以4500r/min離心lOmin，吸取上清液測定螢光強度，結果如圖3所示。結果表明，聚合物對模板分子的吸附比例與FITC-SPA濃度成正比，當FITC-SPA的濃度達到0.4mg/ml時，吸附比例達到平衡；與NIPs相比，SPA-MIPs對FITC-SPA有較高的吸附容量和較好的選擇性。
[0044]非特異吸附性實驗:選取基質金屬蛋白酶MMP-2、溶菌酶(LYZ)、牛血清白蛋白(BSA)、鏈黴親和素(SA)為競爭蛋白，按照上述方法進行FITC螢光標記，分別得FITC-MMP-2、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC-SA，然後稱取 Img SPA-MIPs 和 NIPs 分別置於離心管中，加入 Iml 的 0.2mg/ml 的 FITC-MMP-2、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC_SA 和 FITC-SPA 溶液於37°C置于振蕩器上振蕩吸附2h後，分別測定上清液中的螢光強度，結果如圖4所示。結果顯示，SPA-MIPs只對SPA具有較高的吸附性能，而對其他四種競爭蛋白的吸附性能相對較低，與NIPs對SPA的吸附性能相當。這說明本發明所構建的印跡聚合物SPA-MIPs對模板分子SPA具有較高的特異選擇性。
[0045]在SPA印跡的靶向脂質體分子水平上的考察基礎上，還對其細菌水平上進行考察。由於印跡的SPA蛋白是一種從金黃色葡萄球菌細胞壁分離的蛋白質，是細胞壁抗原的主要成分。因此，首先對本發明所構建的分子印跡靶向系統進行包載6-氨基螢光素(6-FAM)，通過流式細胞來測定細菌對不同的幾種製劑的攝取來評價他們的靶向作用。包載6-氨基螢光素的印跡聚合物(FAM-SPA-MIPs)與非印跡聚合物(FAM-NIPs)的方法參照SPA印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的製備方法，區別在於製備脂質體時，用Iml含有Img 6-FAM的PBS溶液代替水化液即可，其餘步驟與SPA-MIPs和NIPs的製備方法相同。然後將FAM-SPA-MIPs、FAM-NIPs和6-FAM(三者的6-FAM濃度相同)用生理鹽水分別稀釋5倍，金黃色葡萄球菌菌液(lX108CFU/mL)稀釋100倍；再將FAM-SPA-MIPs, FAM-NIPs或6-FAM分別與金黃色葡萄球菌菌液按體積比為1:1混合，置於37°C恆溫水箱中，同時以相同濃度的細菌作為對照組，孵育6h後於7000r/min條件下離心1min,除去上清液，保留沉澱，向沉澱中加入滅菌的新鮮培養基5mL混勾，用流式細胞儀測螢光強度值，結果如圖5所示。結果顯示，金黃色葡萄球菌分別與FAM-SPA-MIPs、FAM-NIPs和6-FAM孵育6h後，攝取包載螢光素製劑的螢光強度不同，細菌結合FAM-SPA-MIPs的量顯著高於FAM-NIPs和6-FAM，螢光強度分別是FAM-NIPs和6-FAM的2.2倍和2.8倍。表明FAM-SPA-MIPs對金黃色葡萄球菌具有更強的體外結合能力。
[0046]其次，對本發明所構建的分子印跡靶向系統進行紅黴素載藥，通過考察其對金黃色葡萄球菌的抑制作用來進一步驗證其靶向性。包載紅黴素的印跡聚合物(EM-SPA-MIPs)與非印跡聚合物(EM-NIPs)的製備方法參照SPA印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)的製作方法，區別在於在製備脂質體時，按紅黴素與脂質體的質量比為1:15稱取紅黴素Img溶於200 μ I乙醇中，稱取大豆卵磷脂10.5mg、膽固醇4.5mg溶於氯仿:甲醇(I:1)的混合溶液800 μ I中，將三者均加入茄形瓶中，餘下步驟與SPA印跡的靶向脂質體(SPA-MIPs)和非印跡聚合物(NIPs)的製備方法一致。紅黴素的濃度測定採用高效液相色譜法(HPLC)，檢測條件如下:色譜柱:C18柱；柱溫:25°C ;檢測波長:21nm ;流動相:0.lmol/L磷酸二氫銨緩衝液(三乙胺調pH 6.5):乙腈體積比為70:30 ;流速:1.0mL/min ；進樣量50yL。檢測結果顯示，在紅黴素濃度為100?500 μ g 範圍內紅黴素濃度(X)與HPLC色譜峰面積⑴間有良好的線性關係。標準曲線方程為:Y = 30054X+56254(R2 =0.9991)，低、中、高質量濃度測定精密度RSD分別為3.46%、2.18%和1.52%，回收率分別為 96.54±2.05%,98.73±2.59%、100.26±3.02%。
[0047]最後，測定紅黴素脂質體包封率:取紅黴素脂質體均分為兩份，一份經SephadexG-50凝膠柱純化收集，另一份直接稀釋到同樣體積，兩者均加入甲醇破乳，分別測定兩份樣品中的紅黴素濃度C和Q。計算包封率(EE):EE = C/QX10^。經檢測，紅黴素脂質體EM-LIP的包封率均值(η = 3)為91.25±1.48%，紅黴素印跡聚合物(EM-SPA-MIPs)的包封率均值(η = 3)為 86.25 ± 2.53 %。
[0048]在測定EM-SPA-MIPs對金黃色葡萄球菌的抑菌效果時，按照金黃色葡萄球菌攝取實驗中採用的孵育方法，先將EM-SPA-MIPs、EM-NIPs, EM(三者的EM濃度相同)用生理鹽水分別稀釋5倍，金黃色葡萄球菌菌液(IX 108CFU/mL)稀釋100倍；再將EM-SPA-MIPs、EM-NIPs, EM分別與金黃色葡萄球菌菌液按體積比為1:1混合，置於37°C恆溫水箱中，相同濃度的細菌作為對照組，孵育6h後在7000r/min條件下離心lOmin，除去上清液，保留沉澱，向沉澱中加入滅菌的新鮮培養基5mL混勻。將樣品混懸液於96孔板點樣，置於恆溫培養箱中培養，並分別於0h、lh、2h、4h、6h、8h測其OD值，實驗結果如圖6所示。結果顯示，EM-SPA-MIPs組和EM-NIPs組的OD值均低於非給藥組(Control組)的OD值，與NIL組相比，EM-SPA-MIPs組的OD明顯低於EM-NIPs組，說明EM-SPA-MIPs對細菌的抑制作用強於EM-NIPs，進一步說明本發明所構建的分子印跡靶向製劑的靶向效果明顯。
[0049]實施例2、基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體的製備及其評價
[0050]基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的革El向脂質體的製備，具體步驟如下:
[0051](I)採用薄膜分散超聲法製備脂質體，具體方法為:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用氯仿和甲醇體積比為1:1的溶液Iml溶解，然後在37°C條件下減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質薄膜，加純水ImL於37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀超聲5min(800W，50次，每次超聲1s後間隔1s)，得脂質體(LIP)；
[0052](2)採用溶膠法製備表面修飾二氧化矽的脂質體，具體方法為:按磷脂:正矽酸乙酯(TEOS):H20摩爾比為1:8:344向脂質體中緩慢加入經體積分數為10%乙醇分散的TE0S，然後在攪拌條件下用0.lmol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至8.50，室溫(18_25°C )攪拌過夜，再將混合物透析除去體系中未沉積的二氧化矽前驅體，得表面修飾二氧化矽的脂質體，命名為二氧化娃脂質體(S-LIP)；
[0053](3)烯鍵修飾二氧化矽脂質體，具體方法為:將50 μ L的3-巰基_1_丙烷磺酸鈉(MPS)緩慢滴加到250 μ L的乙醇中分散半小時後，然後取其10 μ L分散液滴加到2ml 二氧化矽的脂質體中室溫(18-25? )攪拌過夜，即得烯鍵修飾的二氧化矽脂質體(MS-LIP);
[0054](4)基質金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物的製備，具體方法為:取丙烯醯胺(AAM)4mg和N-N亞甲基雙丙烯醯胺(MAA) 2mg溶解到pH為7.4、濃度為0.02M的PBS中，超聲溶解，得混合溶液A，然後將2mg基質金屬蛋白酶MMP-2分散在ImL烯鍵修飾的二氧化矽脂質體溶液中並放置於室溫攪拌0.5h，再將混合物進行真空脫氣lOmin，得混合溶液B，在氮氣保護下取200 μ L混合溶液A滴加入混合溶液B中，並吹氮氣lOmin，室溫(18_25°C )攪拌下預聚合lh，氮氣保護下滴加7 yL過硫酸銨(APS，10%，W/W)和4.5 yL四甲基乙二胺(TEMED，5%，W/V)於混合物中引發聚合，然後再放置於室溫攪拌24h，用純水透析一周，除去模板分子及未反應的試劑，凍幹至恆重即基質金屬蛋白酶MMP-2印跡聚合物命名為MMP-2-MIPs。用純水透析一周，除去模板分子及未反應的試劑。凍幹至恆重即得基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體(MMP-2-MIPs)。
[0055]非印跡聚合物(NIPs)的合成除不加入模板蛋白分子外，其他製備方法同上。
[0056]基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體的吸附實驗:為考察製備得到的基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體對基質金屬蛋白酶MMP-2的特異性吸附能力，採用以下方法對其進行驗證。
[0057]首先，對基質金屬蛋白酶MMP-2進行了 FITC螢光標記:取4mg基質金屬蛋白酶MMP-2溶於0.2M Na2PO4S液中，另取0.16mgFITC溶於0.2M Na孑04溶液中，使FITC與基質金屬蛋白酶MMP-2的摩爾比為1.2:1。磁力攪拌下，將含有基質金屬蛋白酶MMP-2的溶液加入含FITC的溶液中，避光反應1.5h。反應結束後，8000r/min條件下離心lOmin，以除去沉澱基質金屬蛋白酶MMP-2。取上清液用Sephadex G_50凝膠柱進行分離純化，凍幹，即得FITC標記的基質金屬蛋白酶MMP-2。
[0058]動態吸附實驗:將5mg MMP-2-MIPs 和 NIPs 分別與 5ml 的 0.2mg/ml FITC-MMP-2 溶液於37°C振蕩孵育，分別於0.25h、0.5h、lh、2h、4h取出1ml，以4500r/min離心lOmin，測定上清液的螢光強度，結果如圖7所示。結果顯示，MMP-2-MIPs及NIPs對FITC-MMP-2的吸附隨著時間的增加而增加，在2h的時候即達到動態平衡。並且，動態吸附平衡時，MMP-2-MIPs對FITC-MMP-2的吸附量為NIPs的5倍左右，說明本發明構建的分子印跡靶向聚合物載體對蛋白具有很好的吸附能力。
[0059]等溫吸附實驗:精確稱取Img MMP-2-MIPs和NIPs分別置於離心管中，分別與Iml的 0.05mg/ml、0.lmg/ml、0.2mg/ml、0.4mg/ml、0.8mg/ml 的 FITC-MMP-2 溶液在 37 °C 條件下振蕩孵育，2h後取出，以4500r/min離心lOmin，吸取上清液測定螢光強度，結果如如圖8所示。等溫吸附實驗表明，聚合物對模板分子的吸附隨著FITC-MMP-2濃度的變化而變化，當FITC-MMP-2的濃度低於0.2mg/ml時，吸附比例快速上升，當FITC-MMP-2的濃度達到0.2mg/ml時，吸附比例達到平衡，與NIPs相比，MMP-2-MIPs對FITC-MMP-2有較高的吸附容量和較好的選擇性。
[0060]特異吸附實驗:具體選取了金黃色葡萄球菌表面蛋白SPA、溶菌酶(LYZ)、牛血清白蛋白(BSA)，鏈黴親和素(SA)為競爭蛋白，競爭蛋白的FITC標記參照FITC-MMP-2的製備方法，分別得FITC-SPA、FITC-LYZ、FITC-BSA，FITC-SA。特異性吸附試驗的具體操作為:稱取一系列的Img MMP-2-MIPs和NIPs分別置於離心管中，加入Iml的0.2mg/ml的FITC-SPA、FITC-LYZ、FITC-BSA、FITC-SA和FITC-MMP-2溶液於37°C置于振蕩器上振蕩吸附2h後，分別測定上清液中的螢光強度，結果如圖9所示。結果顯示，MMP-2-MIPs只對MMP-2具有較高的吸附性能，而對其他競爭蛋白的吸附性能相對較低，與NIPs對MMP-2的吸附性能差不多。這說明本發明所構建的印跡聚合物MMP-2-MIPs對模板分子MMP-2具有較高的特異選擇性。
[0061]在此基礎上，對基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體進行了細胞水平上的檢驗，由於MMP-2型基質金屬蛋白酶酶是腫瘤細胞外部基質金屬蛋白酶酶的一種，因此，通過驗證MMP-2印跡聚合物對腫瘤細胞的靶向性來評價其印跡能力。在這個實驗中，選用腫瘤細胞U937，螢光探針為阿黴素。
[0062]載阿黴素的基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體(DOX-MMP-2-MIPs)與包載阿黴素的非印跡聚合物(DOX-NIPs)的製備方法同基質金屬蛋白酶MMP-2印跡的靶向脂質體(MMP-2-MIPs)與非印跡聚合物(NIPs)，區別在於做脂質體時，採用硫酸銨梯度法製備得到包阿黴素的脂質體:稱取大豆卵磷脂10.5mg，膽固醇4.5mg，用氯仿和甲醇體積比為I:1的溶液Irnl溶解，然後在37°C條件下減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成一層均勻的透明脂質薄膜，加純水ImL於37°C水化lh，利用超聲細胞粉碎儀超聲5min(800W，50次，每次超聲1s後間隔10s)，得脂質體(LIP);將所得LIP對水透析4h。用0.9%生理鹽水配製10mg/ml的阿黴素溶液，然後將透析過後的LIP與150 μ I的阿黴素溶液在60°C條件孵育20min，孵育完成後經S印hadex G-50凝膠柱除去游離的阿黴素，即得包載阿黴素的脂質體(DOX-LIP) ο
[0063]然後測定U937細胞對DOX-MMP-2-MIPs與DOX-NIPs的攝取實驗，來評價本發明所構建的印跡的靶向脂質體的靶向性。具體操作為:將1m的U937細胞培養過夜，分別與DOX-SPA-MIPs、DOX-NIPs ( 二者的DOX濃度相同)孵育2h，然後用PBS洗掉未被細胞攝取的藥液，然後用多聚甲醛固定30min，固定好後的細胞經DAPI染色，在螢光顯微鏡下觀察細胞的攝取結果，結果如圖10所示。結果顯示，與DOX-MMP-2-MIPs孵育的細胞核周圍可觀察到較強的紅色螢光，而與DOX-NIPs孵育的細胞觀察到的紅色螢光較弱，由此，可充分說明，DOX-MMP-2-MIPs對U937細胞有更好的體外結合能力。
[0064]最後說明的是，以上優選實施例僅用以說明本發明的技術方案而非限制，儘管通過上述優選實施例已經對本發明進行了詳細的描述，但本領域技術人員應當理解，可以在形式上和細節上對其作出各種各樣的改變，而不偏離本發明權利要求書所限定的範圍。
【權利要求】
1.基於蛋白分子印跡的靶向脂質體的製備方法，其特徵在於，包括如下步驟:取丙烯醯胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯醯胺按質量比為I?5:1溶解至pH6.8?7.4、濃度為0.02?0.1M的PBS溶液或水中，超聲，得混合液A，所得混合液A中丙烯醯胺類化合物和N-N亞甲基雙丙烯醯胺的總濃度為I?5mg/ml ;再用烯鍵修飾二氧化矽脂質體，然後將蛋白分子分散於烯鍵修飾的二氧化矽脂質體溶液中攪拌，真空脫氣得混合液B ;氮氣保護下將混合液A按體積比為1:1?1:10滴加入混合液B中，吹氮氣，攪拌預聚合，然後氮氣保護下滴加過硫酸銨和四甲基乙二胺引發聚合，繼續攪拌，透析，得基於蛋白分子印跡的靶向脂質體。
2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於，所述二氧化矽脂質體的製備方法為:先採用薄膜分散超聲法製備脂質體，然後向脂質體中加入經乙醇溶液分散的正矽酸乙酯，攪拌下用氫氧化鈉溶液調節pH至8?10.4，攪拌過夜，透析，得二氧化矽脂質體。
3.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述正矽酸乙酯的加入量按磷脂:正矽酸乙酯:H20的摩爾比為I:8:344o
4.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述乙醇溶液的體積分數為5%?25%。
5.根據權利要求2所述的製備方法，其特徵在於:所述薄膜分散超聲法製備脂質體的方法是將磷脂和膽固醇溶於體積比為1:1的氯仿與甲醇的混合溶液中，減壓旋轉蒸發除去有機溶劑，形成透明脂質薄膜，加水水化，超聲，得脂質體。
6.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於:所述磷脂和膽固醇的摩爾比為2?3:1。
7.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於:所述超聲的條件為在800W條件下超聲50次，每次超聲10s，間隔1s後繼續超聲。
8.根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於:所述水化的條件是在37°C條件下水化I小時。
9.根據權利要求1?8任一項所述的製備方法，其特徵在於:所述蛋白分子為金黃色葡萄球菌蛋白A或基質金屬蛋白MMPs。
10.由權利要求1?9任一項所述的製備方法製得的基於蛋白分子印跡的靶向脂質體。
【文檔編號】A61K47/42GK104492396SQ201410755690
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月10日 優先權日:2014年12月10日
【發明者】李翀, 龍瑩瑩, 張焱, 陳章寶 申請人:西南大學