一種廣譜鑑定β-受體激動劑類藥物的方法
2023-08-13 01:49:06 2
一種廣譜鑑定β-受體激動劑類藥物的方法
【專利摘要】本發明提供一種廣譜鑑定β-受體激動劑類藥物的方法，涉及藥物檢測領域。通過應用超高效液相色譜-四級杆-軌道阱高分辨質譜設備，得到與β-受體激動劑類藥物特徵性化學結構相關聯的質譜信號，根據β-受體激動劑質譜信號特徵和解離規律，構建β-受體激動劑類藥物特徵圖譜信息庫。通過質譜採集的高通量數據與特徵圖譜庫數據比對，鑑定樣品中存在的已知藥物，並且通過對質譜信號的模式識別，預測樣品可能存在的新型未知藥物。最終形成β-受體激動劑類藥物廣譜性鑑定方法，實現對未知樣品中β-受體激動劑類藥物的快速鑑定。本發明提供的方法具有良好的社會效益和經濟效益。
【專利說明】一種廣譜鑑定β-受體激動劑類藥物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及藥物檢測領域，具體的，涉及一種廣譜性鑑定β-受體激動劑類藥物 的方法。
【背景技術】
[0002] 獸藥、添加劑及有害化合物殘留是影響我國動物性產品安全的重要因素，國內外 在養殖環節非法使用β-受體激動劑類藥物（俗稱"痩肉精"）已經造成多起食品安全事 件，成了困擾世界範圍內食品安全的難題。它不僅威脅著人類的健康，具有致畸、致突變和 致癌等作用；同時嚴重影響畜禽產品的出口貿易，造成巨大的經濟損失。我國政府從1997 年起就已明令禁止在動物養殖過程中使用"瘦肉精"，經過多年治理，成效顯著。但受利益驅 使，少部分不法經營者仍在違法使用，"瘦肉精"問題始終難以根除，對我國的食品安全構成 極大威脅。
[0003] 監管技術落後是"瘦肉精"屢禁不止的一個重要因素。如目前檢測β-受體激動 劑類藥物的技術通常只能同時監測十幾種，但已有報導或研究的β -受體激動劑類藥物卻 有幾十種甚至上百種，而且不斷有新合成的類似物出現，而現有的方法根本檢測不到，這樣 會使很多有類似效果的β -受體激動劑類藥物被摻雜在飼料中進入動物體內，嚴重製約了 "痩肉精"監管工作的開展。
[0004] 另外，現有技術（如ELISA、HPLC-MS/MS或GC-MS)在檢測飼料、組織、血液或尿液 中是否存在β-受體激動劑類藥物藥物時，遇到兩方面的限制，一方面如ELISA、試紙條等 快速檢測技術一次只能實現對已知一種或兩種藥物的篩選，陽性樣品還需用質譜進一步確 證和定量；另一方面如用HPLC-MS/MS或GC-MS檢測未知樣品中是否含有β -受體激動劑類 藥物時，現有技術的做法是需要將所有已知的β-受體激動劑類藥物的標準品全部窮盡檢 測，再與檢測結果一一對比篩選其中是否含有β-受體激動劑或含有哪種β-受體激動劑， 而這類藥物標準品種類多、價格昂貴，且不易獲得，這無疑增加了檢測的工作量和難度。所 以，亟待開發出一種不需要檢測標準品，即能夠實現在動物飼料及動物產品中廣譜性篩查 和確證β-受體激動劑類藥物是否存在的一步完成法。
【發明內容】
[0005] 針對現有技術的缺點，本發明提供一種廣譜鑑定β受體激動劑類藥物的方法以 彌補現有技術的上述不足。
[0006] 本發明首先提供了 β-受體激動劑類藥物質譜庫的構建方法，包括以下步驟：
[0007] 1)對β -受體激動劑類藥物進行一級二級質譜掃描；所述β -受體激動劑類藥物 包括標準品藥物和非標準品藥物；
[0008] 2)將掃描得到的所有β-受體激動劑類藥物的一級、二級質譜信息導入軟體中， 建立基於β-受體激動劑類藥物一級二級質譜庫。
[0009] 上述質譜庫的構建方法還包括將現有技術中已知的其他β -受體激動劑類藥物 的質譜信息添加入質譜庫中。
[0010]其中步驟1)採用超高效液相色譜-四級杆-軌道阱高分辨質譜儀 UPLC-Q-Extractive system(UPLC, Waters ACQUITY UPLC Η-Class Bio System； MS, ThermoFisher Q-Exactive)進行掃描。
[con]步驟1)質譜掃描的條件為：
[0012] a)檢測方式：正離子模式 [0013] b)離子源：電噴霧離子源
[0014] c)噴霧電壓：3500-4000V，優選 3500V [0015] d)霧化溫度：350°C
[0016] e)傳輸毛細管溫度：320°C
[0017] e)鞘氣流速：30L/min
[0018] f)輔助氣流速：10L/min
[0019] g)反吹氣流速：5L/min
[0020] h)碰撞能：25. 0-35. 0V,優選 30. 0V
[0021] 1)掃描模式：?11111113/(1(111182(全掃描/數據依賴二級掃描）
[0022] j)掃描範圍：50-750Μ/Ζ
[0023] k)解析度：70000/17500 (Fullms/ddms2)
[0024] 1)最大掃描時間：100ms
[0025] m)動態排除：l〇.〇s
[0026] 其中步驟2)的軟體為Trace Finder。
[0027] 上述方法製備得到的受體激動劑類藥物質譜庫也屬於本發明的保護範圍。
[0028] 進一步地，本發明提供了一種廣譜鑑定β-受體激動劑類藥物的方法，包括以下 步驟：
[0029] 1)採用上述方法構建β -受體激動劑類藥物質譜圖庫和32種β -受體激動劑類 藥物信息庫，包括化合物分子離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z ;
[0030] 2)待測樣品的前處理；
[0031] 3)利用UPLC-QE對前處理後的樣品進行分離和質譜檢測，質譜掃描採用 Fullms+ddms2模式，得到樣品中所有化合物的質譜信息；
[0032] 4)將所得質譜信息導入Trace Finder軟體，建立分析質譜圖數據的處理方法，然 後將分析得到的所有化合物分別與步驟1)所建質譜圖庫中質譜圖相似度以及32種β-受 體激動劑類藥物信息庫中化合物母離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z進行 比對，若五項信息全部匹配，則該物質被認為是β -受體激動劑類藥物。
[0033] 所述32種β -受體激動劑類藥物分別為班布特羅、溴布特羅、西布特羅、西馬特 羅、克倫普羅、氯丙那林、馬布特羅、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、丁酚胺、菲諾特羅、異丙 腎上腺素、異舒普林、奧西那林、苯乙醇胺Α、利託君、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、皮布 特羅、嗎噴特羅、拉貝特羅、異克倫潘特、噴布特羅、福莫特羅、沙美特羅、異他林、腎上腺素、 淨特羅、丙卡特羅、多巴酚丁胺等。
[0034] 本發明的廣譜性鑑定β -受體激動劑類藥物的方法中，步驟2)的前處理方法為：
[0035] ①提取：a.若待測樣品為飼料：稱取2-5g待測飼料樣品置於乾淨容器中，精確至 O.Olg，加入20-50ml鹽酸甲醇或20-50ml 1.0%甲酸提取液，震蕩10-20min後，然後於4t； 條件下7〇00-12000rpm離心5-lOmin，取上清液備用；或
[0036] b.若待測樣品為尿液：準確取1份體積尿液樣品約2-5ml，置於乾淨容器中，加入 3份體積ρΗ5· 2的乙酸銨緩衝液，渦旋混勻後,7000-l2000rpm離心lOmin,取上清液備用； 或
[0037] c.若待測樣品為血漿：準確取1份體積血漿樣品約2-5ml置於乾淨容器中，加入 3倍體積？115.2的乙酸銨緩衝液，混勻，加入同血漿體積的6%髙氯酸，7000-12000印111離心 lOmin，取上清液備用；或
[0038] d.若待測樣品為組織：準確稱取2-5g組織樣品置於千淨容器中，加入6-l〇mL pH5· 2的乙酸銨緩衝液，再加入用乙酸銨緩衝液稀釋5倍的150 U 1葡萄糖醛甘酸或硫酸酯 酶，組織勻漿機勻漿，65Γ震蕩酶解1. 5_2h,加入2-5ml的6%高氯酸，8000-12000rpm離心 lOmin，取上清液備用；對於眼睛和脂肪樣品，在加入高氯酸沉澱離心之後取上清液，加入 6-15mL正己焼，3000r/min離心lOmin，去下層液體重複萃取，然後再進行固相萃取淨化過 程；
[0039] ②淨化：用3mL甲醇，3ml超純水活化混合型陽離子交換萃取小柱，準確吸取步驟 ①得到的3-5ml離心後的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然後用3mL超純水， 3ml甲醇淋洗，待其全部流出，吹乾柱中殘留的液體，再用3mL 2%或5%氨水甲醇溶液洗 脫，用衍生小瓶收集全部的洗脫液。在40°C條件下氮氣吹千，最後用0. 4-lml液相初始流動 相復溶，過〇· 1或0.22 μ m濾膜（對於個別比較難過濾的樣品可以用0.45 μ m濾膜），濾液 上機待測。
[0040] 上述方法中，步驟3)液相色譜條件為：色譜柱:Waters Atlantis· T3column， 2· 1 X 150mm，3 μ m ;進樣量：5ul ;流動相：A :0· 1 %甲酸+10mM乙酸銨水；B :0· 1 %甲酸乙腈； 洗脫梯度：
[0041] 時W 流速__ 秘 1% 0.0 0?3 95 5 3.0 0.3 70 30 1.0 0 3 1Q 90 11J 03 10 90 11*6 0.3 95 5 IS.5 0.3 95 5 。
[0042] 上述方法中，步驟3)質譜條件為：
[0043] a)檢測方式：正離子模式
[0044] b)離子源：電噴霧離子源
[0045] c)噴霧電壓：35〇〇-4000V，優選 3500V ;
[0046] d)霧化溫度：35〇°C
[0047] e)傳輸毛細管溫度：320 °C
[0048] e)鞘氣流速：30L/min
[0049] f)輔助氣流速：l〇L/min
[0050] g)反吹氣流速：5L/min
[0051] h)碰撞能：25. 0-35. OV,優選 30. OV
[0052] i)掃描模式：FullmS/ddmS2 (全掃描/數據依賴二級掃描）
[0053] j)掃描範圍：50-750M/Z
[0054] k)解析度：70000/17500(Fullms/ddms2)
[0055] 1)最大掃描時間：100ms
[0056] m)動態排除：10. Os
[0057] 本發明提供的廣譜鑑定β受體激動劑類藥物的方法可實現對待測樣品中β受體 激動劑類藥物的廣譜性快速篩選，以及樣品中未知的β受體激動劑類藥物的定性和定量， 為動物食品安全提供有效的監管手段，有利於保障人民食品安全，具有良好的社會效益和 經濟效益。本發明方法檢測時不需要同時測定β受體激動劑類藥物標準品，即可以同步 檢測飼料、血、尿以及組織樣品中的32種β -受體激動劑類藥物，此譜庫還能根據文獻報 道或該類藥物的質譜解析規律，不斷進行擴建和完善，進而能鑑定更多的β -受體激動劑 類藥物或類似物。據統計本方法在飼料中的檢出限為〇· 04-2. 18ng/kg，尿液中的檢出限為 0. 06-0. 30ng/ml，血液中的檢出限為0. 007-0. 07ng/ml，而國標以及有文獻報導的方法在飼 料中的檢出限為10ng/kg，血尿中的檢出限位0. lng/ml ;另外一個重要的優勢是本方法中 所用的質譜為最新出現的高解析度質譜，對藥物的質荷比能精確到小數點後5位，而常用 的低分辨質譜其質荷比只能精確到小數點後2位，因此對比而言，本發明方法的檢測靈敏 度和準確性遠遠大於文獻報導的方法。同時本方法的線性範圍為0· 20-500ng/ml，線性範圍 與其他方法相比也要廣得多。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0058] 圖1為32種β -受體激動劑類藥物（Ing/mL)總離子流圖。
[0059] 圖2為詞料樣品克倫特羅質譜圖與譜庫中標準品克倫特羅質譜圖的相似度比較 圖。該圖由上到下分別為樣品實際質譜圖、實際樣品質譜圖與譜庫質譜圖差異和譜庫中與 之匹配質譜圖。通過這項手動比對可以驗證Trace Finder軟體處理結果的可靠性，以及去 除一些假陽性和假陰性結果。
【具體實施方式】
[0060] 以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。
[0061] 以下實施例使用到的溶液配製如下：
[0062] 鹽酸-甲醇提取溶液：取〇· 1M鹽酸8〇OmL，加入甲醇2〇〇mL，混勻。甲醇：色譜純。 5%氨水甲醇溶液：取5mL氨水與95mL甲醇混合。0· 2%甲酸/水溶液：取2此甲酸，加水定 容到1000mL
[0063] 液相流動相：水相：取lmL色譜純甲酸，0· 7708g乙酸銨，加水定容到1〇〇〇mL ;有機 相：取lmL色譜純甲酸，用色譜純乙腈定容到lOOOmL。 '
[0064] 液相系統所用甲醇和乙腈（HPLC級）購自美國Sigma公司，純水（HPLC級）購自 美國Fisher公司，甲酸（9 9.0%HPLC級）和乙酸銨（99.5%HPLC級）購自北京迪科馬科 技有限公司。實驗用水均為超純水，由Milli-Q Advantage A10超純水系統以去離子水為 進水制的。
[0065] 標準儲備液：準確稱取適量的標準物質，置於15ml離心管中，然後加入適量的 HPLC級甲醇進行溶解,配置成1. Omg/ml的標準儲備液，潤旋lmin以保證樣品充分溶解，不 易溶解的標樣可置於超聲儀中超聲l〇min以加速溶解，於-20?條件下避光保存。
[0066] 混合標準儲備液：用移液槍分別準確移取等量的單標儲備液置於15ml離心管中， 再用HPLC級甲醇稀釋至lppm。
[0067] 混合標準工作液：在繪製標準工作曲線時，用1:1甲醇水進行逐級稀釋。
[0068] 本發明所用儀器為：超高效液相色譜：Waters ACQUITY UPLC H-Class，美國 Waters公司；四級杆-軌道講高分辨質譜：Q-Exactive,美國Waters公司Thermo Fisher 公司；混合型陽離子交換柱：Oasis'?系列MCX(3cc，60mg)，美國Waters公司；固相萃取裝 置：美國Ameritech Scientific有限公司；氮吹儀：美國Ameritech Scientific有限公司； 離心機：美國Beckman公司。
[0069] 本發明所用標準品包括包括32種，分別為班布特羅、溴布特羅、西布特羅、西馬特 羅、克倫普羅、氯丙那林、馬布特羅、特布他林、妥布特羅、齊帕特羅、丁酚胺、菲諾特羅、異丙 腎上腺素、異舒普林、奧西那林、苯乙醇胺A、利託君、克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、皮 布特羅、嗎噴特羅、拉貝特羅、異克倫潘特、噴布特羅、福莫特羅和沙美特羅、異他林、腎上腺 素、淨特羅、丙卡特羅、多巴酚丁胺等，這些標準品均購自美國Sigma公司。
[0070] 實施例1β受體激動劑類藥物質譜庫的構建
[0071] (1)利用Q-E質譜儀對每種標樣進行一級二級質譜掃描。
[0072]用已有的32種標準品，包括常用的克倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇等β1， β 2，β 3-受體激動劑類藥物，採用高分辨質譜UPLC-Q-Extractive systemOJPLC，Waters ACQUITY UPLC H-Class Bio System ;MS，ThermoFisher Q-Exactive)進行。
[0073]其前處理方法、液相條件、和質譜條件的優化：前處理方法優化主要包括兩個方 面，首先是飼料提取液的確定，分別使用1. 0%甲酸水和鹽酸甲醇提取飼料樣品，經檢測發 現1.0 %甲酸水的提取效率為6〇 % _7〇 %，而鹽酸甲醇的提取效率大於80 %，所以最終確 定鹽酸甲醇為飼料樣品提取液；另一方面在用氨水甲醇進行洗脫時，分別用2%和5%氨水 甲醇進行洗脫，用2%氨水甲醇進行洗脫時，克倫特羅的回收率為60% -70%，用5%氨水 甲醇洗脫時回收率為8〇%左右,所以後期實驗中使用5%氨水甲醇作為洗脫液。液相條件 優化包括流動相組成、洗脫梯度的改變,實驗過程中分別採用〇_ 1 %甲酸水和甲醇、0. i % 甲酸水和乙腈、〇· 1%甲酸10mM乙酸銨水和乙腈為流動相進行試驗，發現最終以〇· 1%甲 酸lOmM乙酸銨水和乙腈為流動相，並使用?色譜柱進行分離時色譜峰的峰形和32種 β -受體激動劑類藥物的分離度得到明顯改善。所以，本發明最終採用Waters Ailantk@ ^column (2. 1X l5〇ram，3 μ m)，梯度洗脫。得到32種β -受體激動劑類藥物的總離子流圖， 見圖1。並在飼料、血、尿等中做添加回收實驗，結果表明所有標樣的檢出限為0 001η以 mL-0. Ing/mL，在樣品中添加的回收率為60% -120%，其中本發明方法對非常常見的兩種 β -受體激動__在各種顏巾_觀、驗率見下m 表1克倫特羅和沙丁胺醇在飼料、血、尿中的回收率定性限等性能參數。
[00川」況明方法條件包括前處理和儀器參數
【權利要求】
1. β -受體激動劑類藥物質譜圖庫的構建方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1) 對β-受體激動劑類藥物進行一級二級質譜掃描；所述β-受體激動劑類藥物包括 標準品藥物和非標準品藥物； 2) 將掃描得到的所有β-受體激動劑類藥物的一級、二級質譜信息導入軟體中，建立 基於β-受體激動劑類藥物一級二級質譜庫。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，還包括將已知的其他β-受體激動劑類藥物 的質譜信息添加入質譜庫中。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)採用超高效液相色譜-四級杆-軌 道阱高分辨質譜儀進行掃描。
4. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟1)質譜掃描的條件為：檢測方式： 正離子模式；離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：3500-4000V;霧化溫度：350°C ;傳輸毛 細管溫度：320°C ;鞘氣流速：30L/min ;輔助氣流速：10L/min ;反吹氣流速：5L/min ;碰撞 能：25. 0-35. 0V ;掃描模式：全掃描/數據依賴二級掃描；掃描範圍：50-750m/z ;解析度： 70000/17500 ;最大掃描時間：100ms ;動態排除：3· 0-10. Os。
5. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟2)的軟體為Trace Finder。
6. -種廣譜鑑定β_受體激動劑類藥物的方法，其特徵在於，包括以下步驟： 1) 採用權利要求1-5任一所述的方法構建β -受體激動劑類藥物質譜圖庫； 2) 待測樣品的前處理； 3) 利用UPLC-QE對前處理後的樣品進行分離和質譜檢測，質譜掃描採用FullmS+ddms2 模式，得到樣品中所有化合物的質譜信息； 4) 將所得質譜信息導入Trace Finder軟體後進行組分分析，將分析得到的所有組分 分別與步驟（1)所建質譜圖庫中二級質譜圖以及32種β-受體激動劑類藥物信息庫中化 合物母離子m/z、保留時間、同位素峰、二級碎片離子m/z進行比對，若五項信息全部匹配， 則該組分被認為是β_受體激動劑類藥物。
7. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟2)的前處理方法為： ①提取： a. 若待測樣品為飼料：稱取2-5g待測飼料樣品置於乾淨容器中，精確至O.Olg，加 入20-50ml鹽酸甲醇或20-50ml 1.0%甲酸提取液，震蕩10-20min後，然後於4°C條件下 7000_12000rpm離心5-10min，取上清液備用；或 b. 若待測樣品為尿液：準確取1份體積尿液樣品約2-5ml，置於乾淨容器中，加入3份 體積pH5. 2的乙酸銨緩衝液，渦旋混勻後，7000-12000rpm離心lOmin，取上清液備用；或 c. 若待測樣品為血漿：準確取1份體積血漿樣品約2-5ml置於乾淨容器中，加入3倍體 積口冊.2的乙酸銨緩衝液，混勻，加入同血楽體積的6%高氯酸，7000-12000印111離心10111；[11， 取上清液備用；或 d. 若待測樣品為組織：準確稱取2-5g組織樣品置於乾淨容器中，加入6-10mL pH5. 2的 乙酸銨緩衝液，再加入用乙酸銨緩衝液稀釋5倍的150 μ 1葡萄糖醛甘酸或硫酸酯酶，組織 勻漿機勻漿，65°C震蕩酶解1. 5-2h，加入2-5ml的6%高氯酸，8000-12000rpm離心lOmin， 取上清液備用；對於眼睛和脂肪樣品，在加入高氯酸沉澱離心之後取上清液，加入6-15mL 正己烷，3000r/min離心10min，去下層液體重複萃取，然後再進行固相萃取淨化過程； ②淨化：用3mL甲醇，3ml超純水活化混合型陽離子交換萃取小柱，準確吸取步驟①得 到的3-5ml離心後的上清加入固相萃取小柱，令其自然流速流出，然後用3mL超純水，3ml甲 醇淋洗，待其全部流出，吹乾柱中殘留的液體，再用3mL 2% -5%氨水甲醇溶液洗脫，用衍 生小瓶收集全部的洗脫液。在40°C條件下氮氣吹乾，最後用0. 4-lml液相初始流動相復溶， 過0. 1或0. 22 μ m或0. 45 μ m濾膜，濾液上機待測。
8. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟3)液相色譜條件為：色譜柱： Waters Atlantis? T3column，2. 1 X 150mm，3 μ m ;進樣量：5-10 μ 1 ;流動相：A :0· 1 % 甲酸 +10mM乙酸銨水；B :0. 1 %甲酸乙腈；洗脫梯度： 時間 流速（ml/min) A% B% 0.0 0.3 95 5 3.0 0.3 70 30 8.0 0.3 10 90 11.5 0.3 10 90 11.6 0.3 95 5 15.5 0.3 95 5 。
9. 如權利要求6所述的方法，其特徵在於，步驟3)質譜條件為：檢測方式：正離子模 式；離子源：電噴霧離子源；噴霧電壓：3500V ;霧化溫度：350°C;傳輸毛細管溫度：320°C;鞘 氣流速：30L/min ;輔助氣流速：10L/min ;反吹氣流速：5L/min ;碰撞能：30. 0V ;掃描模式： 全掃描/數據依賴二級掃描；掃描範圍：50-750m/z ;解析度：70000/17500 ;最大掃描時間： 100ms ;動態排除：3· 0-10. Os。
10. 權利要求1-5任一所述方法製備得到的β受體激動劑類藥物質譜庫。
【文檔編號】G01N30/88GK104297406SQ201410563021
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月21日 優先權日:2014年10月21日
【發明者】賀平麗, 李婷婷, 李溱, 曹晶晶 申請人:中國農業大學