一種製備難溶性藥物脂質體製劑的新方法

2023-07-10 17:35:46 3

專利名稱：：一種製備難溶性藥物脂質體製劑的新方法一種製備難溶性藥物脂質體製劑的新方法發明領域本發明涉及製備脂質體製劑的新方法和通過這種方法生產的脂質體製劑。技術背景如何增加難溶性藥物溶解度是目前藥劑研究的一個熱點，當前臨床上使用的難溶性藥物注射劑是由傳統方法製成，如採用複合溶媒、增溶劑等，但這會增加處方的剌激性或毒性，臨床應用時會引起過敏反應甚至引起抗藥性。如紫杉垸類藥物紫杉醇和多西他賽，對多種腫瘤都有很好的療效，但由於其幾乎不溶於水，故臨床上應用的紫杉垸製劑採用CremopherEL或Tween80增溶製成的注射液，給藥後，部分病人會出現藥物性皮疹、呼吸急促、支氣管痙攣、低血壓等過敏反應，這是因為處方中CremopherEL或Tween80引起體內組胺釋放所致，目前多採取給藥前口服地塞米松等以防過敏反應，而且臨床上使用時一旦稀釋必須立即使用，並在規定時間內使用完，否則放置數小時即有藥物析出，被在線濾器過濾，導致藥效降低，因此需要尋找其他增溶方式來增加難溶性藥物的溶解度。脂質體是由脂質雙分子層形成的閉合囊泡狀結構。脂質體根據其結構和粒徑的不同可以分為①單室(層)脂質體，其中小單室(層)脂質體(SUV)粒徑《100nm，大單室(層)脂質體(LUV)粒徑在100-1000nm之間；②多室(層)脂質體(MLV)粒徑《5pm;③含有表面活性劑的脂質體的多相脂質體。其中雙分子層由具有疏水性"尾基"區域和親水性"頭基"區域的類脂單層所構成，在這樣的雙層膜結構中，類脂單層的疏水性(非極性)"尾基"朝向雙層中心，而其親水性"頭基"朝向水相。脂質體己廣泛用作藥物載體，因為脂質體組成是人體細胞膜成分，結構也相近，已被認為生物相容性優良且最能夠降低靜脈注射的全身毒性，並同時達到與原劑型相同的療效的一種給藥系統。目前製備脂質體和用脂質體載藥的方法很多，如薄膜分散法、逆相蒸發法、去汙劑透析法、注入法、復乳法、熔融法、pH梯度法等，可以根據藥物的性質選用。空白脂質體的工業化製備技術己經相對成熟，如乙醇注入法、噴霧乾燥法等。對於兩親性藥物可以通過跨膜梯度主動載藥法製備脂質體，主要有pH梯度法和硫酸銨梯度法，兩親性藥物如阿黴素、米託蒽醌、環丙沙星等可通過主動載藥法製備，包封率可達90%以上。但是對於難溶性藥物的脂質體，主要還是採用以薄膜分散法為基礎的"被動載藥法"，即將用於形成脂質體的脂質和藥物溶於有機溶媒中，通常是氯仿或氯仿和甲醇的混合物，之後在減壓的條件下除去有機溶媒形成乾燥的脂質膜，在脂質膜水化時使用適當的機械力即可形成多層脂質體，然後使用恰當的方法如高壓均質、超聲、擠出控制粒徑。此方法雖是最經典的方法，但是卻存在許多缺點。如使用毒性有機溶媒；工業化生產有一定的難度。VanHoogerestP等報導了一種原位製備難溶性藥物脂質體的方法(SupraVailTMInstantSolubilizationSystem),最終產品由兩瓶液體組成，一瓶為採用磷脂水化-均質方法製備的平均粒徑為50nm的空白脂質體，磷脂濃度為100mg/mL，緩衝液組成為2.5%甘油，10mM組氨酸(pH6.8)，另一瓶為藥物和負電荷磷脂溶於有機溶劑中，如乙醇、PEG300、丙二醇、DMSO、N-甲基吡咯烷酮。臨用前將藥物溶液注入空白脂質體中，邊注入邊緩慢渦旋，形成平均粒徑為50nm左右的含藥脂質體(VanHoogevestP，etal.Instantsolubilizationofpoorlywater-solubledrugsbyin-situloadingofaqueousphospholipiddispersionssuitableforparenteraladministration,PDAJPharmSciTechnol.2006Nov-Dec;60(6):366-377.)。但是該法存在以下缺點一是使用2.5%-10%(v/v)的有機溶劑，可能會破壞脂質體的穩定性；二是使用高達10。/。的DMSO、N-甲基吡咯烷酮等有機溶劑易對人體產生不良反應；三是液體狀態的空白脂質體和藥物脂質溶液，製劑的穩定性無法保證，特別是對於50nm左右的小單層脂質體，易出現聚集、融合等現象，導致粒徑變大；四是兩瓶裝，使用前需要混合、載藥，臨床操作不便。因此，需要方法更為簡單可靠，工業化生產難度小的製備脂質體方法，來提高難溶性藥物的溶解度，更加方便臨床使用。
發明內容本發明的目的是提供一種製備難溶性藥物脂質體製劑的新方法，僅需要將藥物均勻分散在空白脂質水化液或空白脂質體混懸液中，通過常規的減少粒徑步驟將脂質體粒徑減少，工藝過程簡單，易於工業化生產的載藥脂質體。本發明的目的可以通過以下措施來實現一種製備在水中溶解度不高於100pg/mL的藥物脂質體的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將處方量的脂質體材料加入有機溶劑中，加熱使之充分溶解後除去有機溶劑，得空白脂質混合物，再加入水化介質後製得空白脂質水化液或空白脂質體混懸液；(2)將藥物加入上述製備的空白脂質水化液中或空白脂質體混懸液中分散，得分散液；(3)將分散液通過均質或薄膜擠壓或微射流方法循環重複操作，直至達到所需粒徑範圍的脂質體溶液；(4)除去脂質體溶液中未包裹的藥物。本發明藥物的可以選擇為紫杉醇、多西他賽、喜樹鹼、多種喜樹鹼衍生物(SN38、HCPT等)，維甲酸、維替泊芬、環孢菌素、兩性黴素B、地西泮、替尼泊苷、依託泊苷、鬼臼乙叉武、咪康唑、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、異康唑、氟曲康唑、尼莫地平、卡馬西平等。本發明的空白脂質體的製備可選用目前製備技術相對成熟的乙醇注入法、噴霧乾燥法等方法，選用的脂質體材料是磷脂醯膽鹼含量在80%~99%之間的磷脂。所述磷脂選自天然磷脂、合成磷脂、天然磷脂與合成磷脂的混合物；為了提高載藥量，可加入適量帶電荷的天然磷脂或合成磷脂。本發明的天然磷脂選自蛋黃卵磷脂(EPC)、氫化蛋黃磷脂(HEPC)、蛋黃磷脂醯甘油(EPG)、蛋黃磷脂醯絲氨酸(EPS)、氫化蛋黃腦磷脂-PEG2000(HEPC-PEG2000)、大豆磷脂(SPC)、氫化大豆磷脂(HSPC)、大豆磷脂醯甘油(SPG)、大豆磷脂醯絲氨酸(SPS)或氫化大豆腦磷脂-PEG2000(HSPE-PEG2000)中的一種或多種。合成磷脂選自二油醯磷脂醯膽鹼(DOPC)、二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼(DPPC)、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼(DMPC)、二月桂醯磷脂醯膽鹼(DLPC)、二油醯磷脂醯甘油(DOPG)、二硬脂醯磷脂醯甘油(DSPG)、二棕櫚醯磷脂醯甘油(DPPG)、二肉豆蔻醯磷脂醯甘油(DMPG)、二月桂醯磷脂醯甘油(DLPG)、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000(DSPE-PEG2000)、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000(DPPE-PEG2000)或二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000(DMPE-PEG2000)中的一種或多種。由於注射用天然磷脂的價格大大低於合成磷脂，所以我們優選天然磷脂，但這並不意味著合成磷脂不適用於本發明。本發明的水化介質是指為pH5.07.8的緩衝液，優選磷酸鹽緩衝液，檸檬酸緩衝液，丁二酸緩衝液；pH進一步優選5.56.5。水化介質中可以含有凍幹保護劑，合適的凍幹保護劑選自海藻糖、山梨醇、甘露醇、蔗糖或乳糖。本發明的製備方法中，將藥物粉末和空白脂質體混懸液或空白脂質水化液混合，分散均勻。在本發明中的難溶性藥物可以是粉末或者經過微粉化。藥物用量和總脂質的重量比為1:101:80。本發明脂質體材料中還可以包含膽固醇，用於調節磷脂膜性質；膽固醇與脂質的重量比為0:10.5:1。本發明還可以加入抗氧化劑，合適的抗氧化劑選自a-生育酚、a-生育酸琥珀酸酯抗壞血酸棕櫚酸酯、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、二丁基苯酚(BHT)或沒食子酸丙酯中的一種或多種；抗氧化劑與磷脂的重量比為0丄5-l:5。空白脂質體可以是多層脂質體或者大單層脂質體，甚至可以是脂質水化液，混懸液用超聲或高壓均質機製備脂質體至所需的粒徑和均勻度，也可通過擠壓設備把多層脂質體在一定壓力下通過相應孔徑的微孔膜來達到，脂質體的平均粒徑為40-500nm。經0.22Mm微孔膜過濾除菌，分裝，2'C-8'C下保存或凍幹保存至使用。本方法製備的脂質體凍乾粉針復溶後，脂質體的包封率不低於90%,其中不包含藥物晶體沉澱。本發明的有益效果表現在本發明可以極大地提高難溶性藥物在水性介質中的溶解度，避免了注射給藥時由於其中表面活性劑增溶而引起的毒副作用。本發明的製備方法非常適合工業化大生產，可以不使用氯仿、甲醇等有機溶劑，生產的安全性大大提高；藥脂比高，接近於常規的製備方法，可以代替常規的製備方法；空白脂質體的生產工藝較為成熟，如乙醇注入法製備空白脂質體等，解決了目前難溶性藥物脂質體工業化生產困難的問題。在支持本發明的研究中，選用多西他賽作為模型化合物，室溫時，多西他賽在水中的溶解度為3pg/mL左右，應當理解的是，本發明的組合物和方法還期望用於本發明的其他難溶性化合物，包括紫杉醇、多西他賽、喜樹鹼及其衍生物、維甲酸、維替泊芬、環孢菌素、兩性黴素B、地西泮、替尼泊苷、依託泊苷、鬼臼乙叉甙、咪康哇、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、異康唑、氟曲康唑、尼莫地平、卡馬西平等。本發明多西他賽脂質體凍乾粉針稀釋穩定性良好，室溫放置12h未見有藥物晶體析出。本發明製備的脂質體與常規方法製備的脂質體相比，釋放度無顯著性差異，藥代動力學曲線及所計算的藥代動力學參數均無顯著性差異。圖l、多西他賽脂質體凍幹前的粒徑分布2、多西他賽脂質體凍幹復溶後的粒徑分布3、本發明製得的脂質體與常規方法製得的脂質體體外釋放曲線圖4、大鼠靜脈本發明製得的脂質體與常規方法製得的脂質體平均血濃經時曲線具體實施方式以下實施例將對在此所述的本發明作進一步說明，但並不對本發明的範疇作任何限制。實施例1稱取大豆磷脂(SPC)25g，DSPE-PEG20001.5g，膽固醇2.4g和a-生育酚O.lg溶解於20mL40-45。C無水乙醇溶液中，將溶解的類脂溶液快速加入到恆溫(40-45'C)的lOmM磷酸鹽緩衝液500mL(pH6.5)中，並繼續攪拌lh形成的脂質體混懸液，加入多西他賽lg，在室溫下攪拌2h，通過高壓均質機均質至80土10nm。用聚碸真空纖維超過濾器進行膜滲濾，交換8體積的蔗糖溶液來除去殘留乙醇，保持工作流的溫度為20-30°C，用10。/。蔗糖-10mM磷酸鹽溶液定容並調節多西他賽濃度為2mg/mL，0.22pm的微孔濾膜過濾除菌，分裝即得成品，成品可在2'C-8'C下保存或者凍幹保存至使用。實施例2稱取蛋黃磷脂(EPC)30g，蛋黃磷脂醯甘油(EPG)1.5g和a-生育酚0.12g，加到500mL無水乙醇中，超聲混合至溶解，噴霧乾燥法除去有機溶劑，並將得到的脂質粉末於35r的真空乾燥箱中放置過夜；配製20mM的丁二酸鈉溶液，將蔗糖溶解於丁二酸鈉溶液作為水化液，並用適量丁二酸將pH值調節至5.5，水化溫度為4(TC，得多室脂質體混懸液；加入微粉化的多西他賽1.5g，繼續攪拌2h，高壓均質機均質至平均粒徑為120土10nm，用水化液定容並調節多西他賽的濃度為3mg/mL，0.22pm的微孔濾膜過濾除菌，分裝即得成品，成品可在2"-8'C下保存或者凍幹保存至使用。比較實施例2常用製備方法選用蛋黃磷脂(EPC)30g，蛋黃磷脂醯甘油(EPG)1.5g和a-生育酚0.12g，溶於氯仿-甲醇(2:1)溶液並混合均勻；用減壓蒸發法將有機溶劑除去，形成脂質混合物;配製20mM丁二酸鈉液，將蔗糖溶解在丁二酸鈉溶液作為水化液，適量丁二酸調節pH至5.5，水化溫度為4(TC，得多室脂質體混懸液；水化完全後用高壓均質機均質至平均粒徑為120土10nm，用水化液定容並調節至多西他賽的濃度為3mg/mL，0.22pm的微孔濾膜過濾除菌，分裝即得成品，成品可在2。C-8。C下保存或者凍幹保存至使用。實施例3稱取二硬脂醯磷脂醯膽鹼(DSPC)24g，大豆磷脂醯絲氨酸(SPS)4.8g和a-生育酚0.2g，加到200mL乙醇溶液中，攪拌使脂質溶解並混合均勻，用減壓蒸發法將乙醇除去，形成脂質混合物；配製10mM檸檬酸鈉溶液，將海藻糖溶解在檸檬酸鈉溶液作為水化液，水化溫度一般在55'C士5。C之間，得多室脂質體混懸液；水化完全後加入多西他賽4g，繼續攪拌4h，用高壓均質機均質至平均粒徑為100±10nm，水化液定容並調節多西他賽的濃度為4.0mg/mL，經0.22pm的微孔濾膜過濾除菌，分裝即得成品，成品可在2。C-8'C下保存或者凍幹保存至使用。實施例4稀釋穩定性取實施例l所製備的樣品，用5%葡萄糖注射液稀釋至0.74mg/mL，所得脂質體混懸液室溫放置，定時取樣，對藥物含量、有關物質、脂質體的粒徑、包封率進行檢測，同時用顯微鏡對脂質體中藥物的析出情況進行考察，結果見表1。表1多西他賽脂質體稀釋穩定性考察Oh2h4h8h12h含量(％)有關物質(％)平均粒徑(nm)包封率(％)顯微鏡觀察100.20.59099.15無結晶析出100.30.79299.23無結晶析出100.10.69599.17無結晶析出99.71.29499.02無結晶析出98.12.010098.58無結晶析出實施例5體外釋放實驗取實施例2所製備的兩種樣品(常規法製備的記為脂質體l,本法製備的記為脂質體2)，進行體外釋放比較。試驗方法將預處理過的透析袋在釋放介質中浸泡過夜，精密稱取按實施例2製備的多西他賽脂質體凍乾粉針，蒸餾水復溶後用5%葡萄糖稀釋至多西他賽濃度約為0.5mg/mL，取1mL置於透析袋內，兩端紮緊後，綁於溶出儀的小漿上，放入盛有100mL1M水楊酸鈉-pH7.4PBS緩衝液的溶出小杯中，在100r.min-'和(37±0.5)'C介質溫度下進行體外釋放實驗。按設定時間間隔(0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，7，8，24h)取5mL釋放介質測定濃度，並補充5mL釋放介質，HPLC測定釋放介質中的多西他賽濃度，計算藥物累積釋放百分率。釋放結果表明兩種不同工藝製備的脂質體體外釋放無明顯差異。實施例6大鼠藥動學實驗多西他賽脂質體按實施例3製備，濃度為4.0mg/mL(常規法製備的記為脂質體1，本法製備的記為脂質體2)，臨用前用5%的葡萄糖配製成lmg/mL。選取SD大鼠12隻，雌雄各半，隨機分成兩組，一組大鼠尾靜脈推注常規法製得的脂質體，另一組推注本法製得的脂質體，均以10mg'kg"的劑量給藥。給藥後2min，5min，10min，30min及lh，1.5h，2h,4h，6h眼眶靜脈取血250pL，離心，取血漿lOO^iL,血樣經預處理後，進行液質聯用(LC-MS)測定血漿中多西他賽含量。將體內藥物濃度數據用統計距法進行處理，得非房室模型參數見表2，統計距結果表明，脂質體l與脂質體2的平均滯留時間(MRT)分別為24.96和17.89min，AUQ-t分別為606.36和649.79嗎min/mL，AUC0.~分別為611.41和653.57pg'min/mL。實驗動物各時間點血濃的平均值與時間的關係見附圖4，可見，本發明製得的脂質體與常規方法製得的脂質體之間的藥代動力學曲線及所計算的藥代動力學參數均無顯著性差異。表2統計距估算的藥代動力學參數tableseeoriginaldocumentpage9權利要求1.一種製備在水中溶解度不高於100μg/mL的藥物脂質體的方法，其特徵在於包括以下步驟(1)將處方量的脂質體材料加入有機溶劑中，加熱使之充分溶解後除去有機溶劑，得空白脂質混合物，再加入水化介質後製得空白脂質水化液或空白脂質體混懸液；(2)將藥物加入上述製備的空白脂質水化液中或空白脂質體混懸液中分散，得分散液；(3)將分散液通過均質或薄膜擠壓或微射流方法循環重複操作，直至達到所需粒徑範圍的脂質體溶液；(4)除去脂質體溶液中未包裹的藥物。2.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於藥物可以選自紫杉醇、多西他賽、喜樹鹼、SN38、HCPT、維甲酸、維替泊芬、環孢菌素、兩性黴素B、地西泮、替尼泊苷、依託泊苷、鬼臼乙叉武、咪康唑、伊曲康唑、益康唑、酮康唑、芬替康唑、硫康唑、噻康唑、特康唑、氯康唑、異康唑、氟曲康唑、尼莫地平或卡馬西平。3.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於所述的脂質體材料是磷脂醯膽鹼含量在80%~99%之間的中性或帶電荷磷脂。4.根據權利要求3所述的製備方法，其特徵在於所述的中性或帶電荷磷脂選自天然磷脂、合成磷脂、天然磷脂與合成磷脂的混合物。5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於天然磷脂為蛋黃卵磷脂、氫化蛋黃磷脂、蛋黃磷脂磷脂醯甘油、蛋黃磷脂醯絲氨酸、氫化蛋黃腦磷脂-PEG2000、大豆磷脂、氫化大豆磷脂、大豆磷脂醯甘油、大豆磷脂醯絲氨酸或氫化大豆腦磷脂-PEG2000中的一種或多種；合成磷脂為二油醯磷脂醯磷脂醯膽鹼、二硬脂醯磷脂醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯磷脂醯膽鹼、二肉豆蔻醯磷脂醯膽鹼、二月桂醯磷脂醯膽鹼、二油醯磷脂醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯甘油、二棕櫚醯磷脂醯甘油、二肉豆蔻醯磷脂醯磷脂醯甘油、二月桂醯磷脂醯甘油、二硬脂醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000或二肉豆蔻醯磷脂醯乙醇胺-PEG2000中的一種或多種。6.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於藥物可以是粉末或經過微粉化的。7.根據權利要求1至6中任一項所述的製備方法，其特徵在於所述藥物與磷脂的重量比為1:1(M龍8.根據權利要求7所述的製備方法，其特徵在於脂質體材料中還可以包含膽固醇；膽固醇與磷脂的重量比為0:10.5:1。9.根據權利要求7或8所述的製備方法，其特徵在於脂質體材料中還可以包含抗氧化劑，所述抗氧化劑選自a-生育酚、ci-生育酸琥珀酸酯抗壞血酸棕櫚酸酯、叔丁基對羥基茴香醚(BHA)、二丁基苯酚(BHT)或沒食子酸丙酯中的一種或多種；抗氧化劑與磷脂的重量比為0.1:5-1:5。10.根據權利要求1所述的製備方法，其特徵在於載藥脂質體的平均粒徑是40nm500nm。全文摘要本發明提供了製備難溶性藥物脂質體製劑的一種新方法，僅通過分散及減小粒徑步驟即可將藥物載入空白脂質體的雙分子層膜上，製備方法簡單。由於目前空白脂質體工業化生產已經非常成熟，故易於實現脂溶性藥物脂質體的工業化生產。文檔編號A61K31/337GK101244039SQ20081001987公開日2008年8月20日申請日期2008年3月20日優先權日2008年3月20日發明者劉春暉,林巧平,王青松,許向陽申請人:江蘇先聲藥物研究有限公司