一種食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒的製作方法

2023-07-10 06:07:01

本發明涉及食品檢測技術領域，具體是一種食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒。

背景技術：

肉製品中有毒代謝物的殘留問題越來越多的引起國際社會的關注，為了實現效益最大化，一些不法商販在動物飼料中非法添加玉米赤黴醇等激素類藥物，促進動物機體蛋白質的合成，提高飼料利用率，從而產生促增重作用，獲得更多經濟回報。玉米赤黴醇及其代謝產物具有雌激素類物質的生物活性，對促性腺激素結合受體、體外肝臟激素結合受體均有抑制作用。雌激素類物質的殘留會引起人體性激素機能紊亂及影響第二性徵的正常發育，在外部條件誘導下，可能致癌。

目前，玉米赤黴醇的測定方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、薄層層析法、高效液相色譜-質譜聯用法等，其檢測結果準確可靠，但儀器設備比較昂貴，操作繁瑣，耗時，且樣本前處理過程相對複雜，對操作人員要求較高。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種低成本、快速而準確的食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

一種食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒，包括酶標板、玉米赤黴醇標準品、玉米赤黴醇抗體工作液、玉米赤黴醇酶標二抗工作液、底物A液、底物B液、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液；所述的玉米赤黴醇抗原的製備，是通過玉米赤黴醇半抗原與兔血清白蛋白偶聯得到，具體步驟為：取0.05mmol玉米赤黴醇半抗原與兔血清白蛋白按6：1的結合比混合在0.06mol/L的pH值9.0的碳酸鹽緩衝液中，然後加入0.12mmol碳化二亞胺，攪拌置於室溫條件下反應20h，再於0.16～0.18mol/L的pH值7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液中透析兩天，除去未反應的半抗原，將得到的蛋白質偶聯物溶液於-20℃保存，得玉米赤黴醇抗原。

作為本發明進一步的方案：所述的玉米赤黴醇半抗原是採用混合酸酐法將玉米赤黴醇與雞卵清白蛋白偶聯得到，具體步驟為：將0.5mmol玉米赤黴醇溶於12～15ml無水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室溫下反應2.5～3.0h，離心，將下層固體溶於14～16ml的N，N-二甲基甲醯胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應2.0～2.5h；將上述反應液加入到12～14ml含有6～8mg/ml雞卵清白蛋白的磷酸緩衝液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝液透析4～5次，冷凍乾燥，得到玉米赤黴醇半抗原。

作為本發明進一步的方案：所述的酶標板的製備，步驟為：用0.055～0.058mol/L的pH值9.2～9.4的碳酸鹽緩衝液作為包被液，將玉米赤黴醇抗原稀釋成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶標板甩掉板內液體，加入稀釋後的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然後加入0.5wt.%兔血清白蛋白封閉液，150μL/孔，37℃放置2h，棄去封閉液直接拍幹，拍幹後的酶標板置於常溫條件下晾乾，抽檢合格後將酶標板真空密封於4℃條件下保存。

作為本發明進一步的方案：所述的玉米赤黴醇標準品的的濃度分別為0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.32ng/mL、0.64ng/mL、1.28ng/mL、2.56ng/mL。

作為本發明進一步的方案：所述的底物A液為含有0.60～0.65mmol/L的過氧化氫的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液；所述的底物B液為四甲基聯苯二胺溶液。

作為本發明進一步的方案：所述的終止液為2mol/L的鹽酸溶液。

作為本發明進一步的方案：所述的濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，其為0.06～0.08mol/L的pH值7.3～7.4的磷酸鹽緩衝液；所述的濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其為含0.6～0.7wt.%吐溫-20、0.012～0.15mol/L的pH值7.2～7.4的磷酸鹽緩衝液。

利用所述的食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

（1）預處理待測樣品：將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，並將其復溶於樣品稀釋液中；

（2）檢測：取包被有玉米赤黴醇抗原的酶標板，按序分別加入標準品/樣本、玉米赤黴醇酶標二抗工作液、玉米赤黴醇抗體工作液各50μL/孔到對應的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光環境中反應35～40min，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液充分洗滌2～3次，每次間隔10s，拍幹後加入底物A液50μL/孔，底物B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置常溫避光環境中反應10～12min，加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於350nm處或雙波長350/620nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5min內讀完數據），以標準品濃度的對數為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪製標準曲線；

（3）分析結果：對照標準曲線計算樣品中玉米赤黴醇的含量。

與現有技術相比，本發明的有益效果是：本發明利用樣品中的玉米赤黴醇與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標二抗，與抗體反應，通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中玉米赤黴醇的含量。如果樣品中的玉米赤黴醇含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用於大批量樣品的快速檢測。

具體實施方式

下面將結合本發明實施例，對本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。

實施例1

本發明實施例中，一種食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒，包括酶標板、玉米赤黴醇標準品、玉米赤黴醇抗體工作液、玉米赤黴醇酶標二抗工作液、底物A液、底物B液、終止液、濃縮稀釋液和濃縮洗滌液；底物A液為含有0.62mmol/L的過氧化氫的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液；底物B液為四甲基聯苯二胺溶液；終止液為2mol/L的鹽酸溶液；濃縮稀釋液是10倍濃縮稀釋液，其為0.07mol/L的pH值7.3的磷酸鹽緩衝液；濃縮洗滌液是10倍濃縮洗滌液，其為含0.64wt.%吐溫-20、0.014mol/L的pH值7.4的磷酸鹽緩衝液。

1、玉米赤黴醇抗原的製備

（1）採用混合酸酐法製得玉米赤黴醇半抗原

將0.5mmol玉米赤黴醇溶於14ml無水乙醇中，加入0.5mmol戊二酸酐，室溫下反應2.8h，離心，將下層固體溶於14～16ml的N，N-二甲基甲醯胺，加入0.5mmol三正丁胺和0.5mmol氯甲酸異丁酯，繼續反應2.4h；將上述反應液加入到14ml含有7mg/ml雞卵清白蛋白的磷酸緩衝液中，室溫反應過夜；將上述反應液用磷酸緩衝液透析5次，冷凍乾燥，得到玉米赤黴醇半抗原，備用。

（2）玉米赤黴醇半抗原與兔血清白蛋白偶聯得到玉米赤黴醇抗原

取0.05mmol玉米赤黴醇半抗原與兔血清白蛋白按6：1的結合比混合在0.06mol/L的pH值9.0的碳酸鹽緩衝液中，然後加入0.12mmol碳化二亞胺，攪拌置於室溫條件下反應20h，再於0.17mol/L的pH值7.3的磷酸鹽緩衝液中透析兩天，除去未反應的半抗原，將得到的蛋白質偶聯物溶液於-20℃保存，得玉米赤黴醇抗原，備用。

2、玉米赤黴醇抗體的製備

選用健康成年純種BALA/C小鼠，取玉米赤黴醇抗原50μg與等量完全弗氏佐劑混合，採用腹腔注射進行初次免疫，之後每隔3周用相同劑量玉米赤黴醇抗原加等量不完全弗氏佐劑採用腹腔注射進行二次、三次免疫，每次免疫6天後尾靜脈採血測定抗血清效價至一定滴度後，用相同劑量不加佐劑進行末次免疫，3天後取脾製備脾細胞懸浮液與骨髓瘤細胞進行細胞融合，篩選出所需要的雜交瘤細胞系進行克隆化，選擇處於對數生長期的雜交瘤細胞進行凍存，用於腹水製備，先腹腔注射0.5ml液體石蠟於BALB/C鼠致敏，2周後腹腔注射1×106個雜交瘤細胞，接種細胞9天後可產生腹水，待腹水儘可能多時用注射器抽取腹水，反覆收集數次，4000rpm離心15min，收集上清，採用辛酸-硫酸銨法純化腹水對單克隆抗體進行純化，冷凍乾燥得凍乾粉後於-20℃保存，得玉米赤黴醇抗體，備用。

3、酶標板的製備

用0.056mol/L的pH值9.3的碳酸鹽緩衝液作為包被液，將玉米赤黴醇抗原稀釋成1：60000比例，100μL/孔，37℃孵育2h，取出酶標板甩掉板內液體，加入稀釋後的濃縮洗滌液300μL/孔，洗板2次，30s/次，然後加入0.5wt.%兔血清白蛋白封閉液，150μL/孔，37℃放置2h，棄去封閉液直接拍幹，拍幹後的酶標板置於常溫條件下晾乾，抽檢合格後將酶標板真空密封於4℃條件下保存。

4、玉米赤黴醇標準品的配製

將玉米赤黴醇配製成濃度分別為0ng/mL、0.01ng/mL、0.02ng/mL、0.04ng/mL、0.08ng/mL、0.16ng/mL、0.32ng/mL、0.64ng/mL、1.28ng/mL、2.56ng/mL的玉米赤黴醇標準品。

5、玉米赤黴醇抗體工作液的製備

採用玉米赤黴醇人工抗原免疫小鼠得到單克隆抗體，用抗體稀釋液稀釋成1：40000比例，得到玉米赤黴醇抗體工作液。

6、玉米赤黴醇酶標二抗工作液的製備

由酶標二抗加稀釋液稀釋成1：4000比例，得到玉米赤黴醇酶標二抗工作液。

利用所述的食品中玉米赤黴醇的檢測試劑盒進行檢測的方法，包括以下步驟：

（1）預處理待測樣品：將待測試的樣品處理為液體樣品，或者用有機溶劑提取待測樣品，並將其復溶於樣品稀釋液中；以固態樣品為例，具體預處理的一種操作為：研磨待測樣品，過篩，稱取5g研磨過濾後的樣品加入50mL、體積濃度為70%的甲醇溶液，在密封的容器裡混合震蕩10min，離心取上清液用樣品稀釋液稀釋成1：20比例，混勻待測。

（2）檢測：取包被有玉米赤黴醇抗原的酶標板，按序分別加入標準品/樣本、玉米赤黴醇酶標二抗工作液、玉米赤黴醇抗體工作液各50μL/孔到對應的微孔中，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置室溫避光環境中反應38min，將孔內液體甩幹，用洗滌工作液充分洗滌3次，每次間隔10s，拍幹後加入底物A液50μL/孔，底物B液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板膜蓋板後置常溫避光環境中反應12min，加入終止液50μL/孔，輕輕振蕩混勻，設定酶標儀於350nm處或雙波長350/620nm檢測，測定每孔吸光度值（請在5min內讀完數據），以標準品濃度的對數為橫坐標，標準品百分吸光度值為縱坐標，繪製標準曲線。

（3）分析結果：對照標準曲線計算樣品中玉米赤黴醇的含量。

本發明利用樣品中的玉米赤黴醇與酶標板上固定的抗原特異性競爭抗體，加入酶標二抗，與抗體反應，通過酶催化顯色劑顯色，根據顯色的深淺來判斷樣品中玉米赤黴醇的含量。如果樣品中的玉米赤黴醇含量少，顯色深；反之，則顯色淺。本發明的試劑盒檢測方法操作簡便，檢測靈敏、準確、快速，適用於大批量樣品的快速檢測。

對於本領域技術人員而言，顯然本發明不限於上述示範性實施例的細節，而且在不背離本發明的精神或基本特徵的情況下，能夠以其他的具體形式實現本發明。因此，無論從哪一點來看，均應將實施例看作是示範性的，而且是非限制性的，本發明的範圍由所附權利要求而不是上述說明限定，因此旨在將落在權利要求的等同要件的含義和範圍內的所有變化囊括在本發明內。

此外，應當理解，雖然本說明書按照實施方式加以描述，但並非每個實施方式僅包含一個獨立的技術方案，說明書的這種敘述方式僅僅是為清楚起見，本領域技術人員應當將說明書作為一個整體，各實施例中的技術方案也可以經適當組合，形成本領域技術人員可以理解的其他實施方式。