純化鵝去氧膽酸的方法
2023-07-10 06:15:11 1
專利名稱：純化鵝去氧膽酸的方法
技術領域：
本發明涉及一種純化鵝去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5j5-膽酸)的方法。 尤其，本發明涉及一種以高產率和高純度、由豬膽汁固體中含有的低 等級鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
背景技術：
鵝去氧膽酸通常含在牛、豬、熊或家禽，例如雞或鵝的膽汁中， 也含在人的膽汁中。鵝去氧膽酸是製備熊去氧膽酸的原料，熊去氧膽 酸能夠有效緩解膽汁系統的疾病、高脂血症、膽石病和慢性肝病，本 領域已知的製備熊去氧膽酸的常用方法如下所示。
製備鵝去氧膽酸的常用方法包括步驟用甲基酯化膽酸 (3a，7a，12a-三羥基膽酸)；用無水乙酸對3a和7a位上的羥基進行乙醯 化作用以對其進行保護；使用鉻酸將12ot位上的羥基氧化為羰基，然 後通過Wolff-kichner還原反應除去羰基；水解所得產物並脫保護以得 到鵝去氧膽酸。上述方法需要將反應維持在高於200。C的溫度下，而 且原料的供應可能由於牛海綿狀腦病等而被中斷。
家禽的膽汁中含有鵝去氧膽酸、石膽酸和少量的膽酸。因此，從 家禽製備鵝去氧膽酸的方法是本領域公知的，但是由於原料供應減少 和產率低的原因這種方法在經濟上並不可行[參見，Windhaus等人，I Physiol. Chem.， 140， 177 ~ 185(1924)。
美國專利No.4，186，143公開了 一種從來自天然豬膽汁的鵝去氧膽 酸混合物完全分離和純化鵝去氧膽酸的方法。該方法包括以下主要步 驟通過膽汁的急化作用而預處理除去3a-羥基-6-氧代-5p-膽酸；膽汁 酸的酯化；膽汁酸酯的乙醯化；使用非極性有機溶劑除去中間產物； 對式I的乙醯化的酯進行結晶；脫保護；和利用在有機溶劑中的結晶 來製備式I化合物。但是，該專利沒有描述用於式I的乙醯化酯的
HPLC內容物，而且由於特有的旋光性為[aD25 +13.8°(c=l， CHC13), 熔點為119~121°C [STD: [a]D25 +15.2°(c=l， CHC13)，熔點127 ~ 129°C，因此終產物的純度非常低。而且，經結晶純化終產物需要非 常長的時間(即，16-48小時)，並且整個過程有八個(8)步驟之複雜。因 此，當使用上述方法純化式I化合物時，終產物的產物變低，反應時 間長達12天。因此，該方法經濟上不可行。
尤其，當上述方法用於本發明中所用的含有35 55wt。/。鵝去氧膽 酸的豬膽汁固體時，攪拌過濾是困難的，因為所需的化合物與雜質一 起沉澱和凝結。
為了克服上述問題，本發明的目的是提供一種以高純度和高產率 純化式I和II化合物的方法，同時還縮短整個方法所需的時間。
發明內容
本發明提供一種純化式I化合物的方法，formula see original document page 5
[式I
該方法包括下述步驟預處理豬膽汁；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯 的乙醯化；使用非極性有機溶劑除去中間產物；乙醯化膽汁酸酯的結 晶；和脫保護；其中該方法的特徵在於
1) 作為預處理步驟，將含有35 55wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固 體溶解在含有鹽的有機溶劑中；
2) 作為結晶步驟，在15 25。C的溫度範圍內，使從預處理步驟 獲得的產物在CL4醇中進行結晶；和
3) 作為脫保護步驟，通過加入鹼使從結晶步驟獲得的產物脫保 護，並通過加入酸使脫保護的產物在水存在下結晶。
發明詳述
在本說明書中，措詞"豬膽汁固體"代表來自豬膽汁的固體，其含
有式I~IV的鵝去氧膽酸的混合物。
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其中，式I化合物代表鵝去氧膽酸(3a，7a-二羥基-5p-膽酸， CDCA);式H化合物代表豬去氧膽酸(3a，6a-二羥基-5p-膽酸，HDCA); 式III化合物代表豬膽酸(3a，6a，7a-三羥基-5(5-膽酸，HCA);和式IV 化合物代表3a-羥基-6-氧代-5(5-膽酸(keto)。
下文中將舉例詳細說明根據本發明的純化鵝去氧膽酸的每個步驟。
步驟l:豬膽汁固體的預處理
為了在純化步驟中使用含有35 55wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固 體，攪拌所有的豬膽汁固體並在回流下將其溶解在有機溶劑中。然後， 將混合物冷卻至室溫，再攪拌1~2小時。之後使用濾紙，優選濾紙和 硅藻土從混合物中除去不溶的物質。減壓除去有機溶劑得到剩餘物(例 如，CDCA、 HDCA、 HCA和keto)，將其用在下一步驟中。可以任 意選擇該步驟中使用的鹽，只要其不影響反應物中的化合物。優選， 該鹽為選自氯化鈉、無水硫酸鎂(MgS04)和無水硫酸鈉中的至少 一種， 更優選氯化鈉。基於有機溶劑的量，該步驟中所用的鹽的量優選為5~ 10wt%。如果鹽的量小於5wt%，則不能充分除去豬膽汁固體中的水 和不溶性物質(例如脂肪酸等)，其使過濾發生困難並且降低產率和酯 化反應的速度。如果鹽的量大於10wt%,則過量的鹽殘留成為雜質， 使純化發生困難。優選可以從能溶解豬膽汁固體中的鵝去氧膽酸並且 沒有不利影響的溶劑中任意選擇有機溶劑。更優選，溶劑為乙酸乙酯 或丙酮。
步驟2:鵝去氧膽酸的酯化
向前面步驟所獲得的剩餘物鵝去氧膽酸混合物中加入醇，之後回 流攪拌溶液直至剩餘物完全溶解。然後將溶液冷卻至0 5。C。將酸催 化劑加入到溶液中，在室溫下攪拌溶液直至鵝去氧膽酸混合物的酯化 反應進行完全。當反應完全時，加入鹼中和溶液，隨後進行過濾。用 醇洗滌濾出的物質並減壓濃縮，得到剩餘物鵝去氧膽酸酯混合物(例 如，CDCA-Me、 HDCA-Me、 HCA-Me和keto-Me)。對於用在該步驟
中的醇沒有特別限制，但是為了容易進行酯化反應優選具有1 ~ 4個碳
原子的低級醇，更優選甲醇。該步驟中使用的酸催化劑優選為疏酸或
者對曱苯磺酸(PTSA)，鹼為碳酸氫鈉、碳酸鈉或碳酸鉀。 步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙醯化
在回流下向前面步驟中獲得的剩餘物中加入無水乙酸和弱鹼，使 鵝去氧膽酸酯混合物中的所有羥基發生乙醯化作用。當反應完全時， 在回流攪拌下向反應溶液中加入甲苯。然後減壓濃縮反應溶液以除去 無水乙酸、乙酸和反應後剩餘的鹼，從而獲得剩餘物乙醯化鵝去氧膽 酸酯混合物(例如，CDCA-diAc-Me、 HDCA誦diAc畫Me、 HCA國triAc畫Me 和keto-Ac-Me)。該步驟中使用的弱鹼優選為無水乙酸鈉或吡"定，更 優選無水乙酸鈉。
步驟4:式III和IV中間產物的除去
將非極性溶劑加入到剩餘物中。回流攪拌混合物直至剩佘物溶解 並冷卻至室溫。將溶劑的溫度保持在20~25°C, 4吏式ni和iv的中間 產物和一部分式II的中間產物(例如，HCA-triAc-Me、 keto-Ac-Me和 部分HDCA-diAc-Me)結晶並將其過濾除去。用非極性溶劑額外洗滌濾 過的物質，之後減壓濃縮過濾和洗滌的溶液並真空乾燥。該步驟中使 用的非極性溶劑優選為己烷、庚烷、辛烷、異辛烷等，更優選己烷或 庚烷。
步驟5:乙醯化式I化合物的酯的製備
為了製備式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酉旨-甲酯(CDCA-diAe-Me)，其 為製備式I化合物的中間產物，將醇溶劑加入到從前面步驟獲得的產 物中，之後將混合物在15°C ~25°C，優選20。C 25。C下放置2~3小 時以使式V化合物結晶。如果溫度低於15。C，則由於式V化合物發 生凝結而使攪拌和過濾發生困難，而如果溫度高於25。C,則結晶作用 不充分。當式V化合物發生結晶時，使用過濾從溶劑中除去式II的中 間產物。用醇溶劑洗滌如此過濾出的物質，並真空乾燥以獲得粗產物 式V的鵝去氧膽酸-二乙酸酯-曱酯。為了以高純度，優選99%或更高 含量地純化式V化合物，優選加入醇溶劑並將混合物在0'C ~ 15°C,
優選0°C 5。C下放置2~3小時。如果溫度低於0""C，則式V化合物 的含量降低，而如果溫度高於15。C，即使進行重結晶式V化合物的含 量仍降低。考慮到式V化合物的含量，結晶所用的醇溶劑優選為具有 1~4個碳原子的直鏈或支鏈低級醇，更優選乙醇、甲醇或異丙醇，最 優選甲醇。結晶所用的醇的量為剩餘物量的0.5~3倍，優選1.0~2.0 倍。如果該量低於0.5倍，則由於晶體彼此凝結而難以過濾。如果該 量高於3倍，則式V化合物的含量不受該量的影響。
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步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結晶
在鹼存在下對在前面步驟中獲得的式I化合物的中間產物-式V化 合物進行脫保護，並在酸性條件下將反應的pH調節至4或更低，優 選2~3，以形成式I的鵝去氧膽酸。同時，在水存在下使反應溶液保 持在35~45°C，優選35 40。C，以使式I化合物結晶。過濾反應溶液、 用水洗滌並真空乾燥以完全精製鵝去氧膽酸。對用於脫保護的鹼沒有 特別地限制，但是為了後處理步驟而優選氫氧化鈉或氫氧化鉀。如果 pH大於4,則不形成晶體，如果pH小於2，則由於過量的酸而使終 產物的純度降低。如果在水中的結晶溫度低於35°C，則式I化合物的 純度降低，而如果溫度高於45。C，則由於來自式I化合物的晶體彼此 凝結而難以過濾。對用於中和反應溶液的酸沒有特別限制，但是為了 後處理步驟而優選鹽酸或硫酸。由於來自前面步驟的剩餘物含有99% 或更多的式V化合物，由於雜質含量低，因而無需使用有機溶劑進行 附加的結晶作用就可以完全精製式I化合物。含有根據本發明的、從 水中結晶的式I化合物的產物適合於工業製備方法，因為與在有機溶
劑中結晶的式I化合物相比，其熔點高出約20。C，並且具有更小的體積。
下列實施例將更詳細地闡釋本發明。但是，應該理解下列實施例 的意圖是說明本發明，並不以任何方式限制本發明的範圍。 分析方法
使用HPLC來確定每個步驟分離出來的中間產物，試驗條件如下
柱Capcell pak UG120 C18(4.6 X 250mm， Shiseido)
流動相乙腈/水(85:15)
檢測器紫外分光計(21011111)
流速1.0ml/min
注入20jil
實施例
步驟l:豬膽汁固體的預處理
將600g含有35 ~ 40wt。/。鵝去氧膽酸的豬膽汁固體和240g氯化鈉 在2400ml乙酸乙酯中攪拌回流1小時，以溶解所有的豬膽汁固體。 然後，將混合物冷卻至20~25°C,攪拌1小時並用硅藻土過濾，用 240ml乙酸乙酯洗滌如此過濾的物質。減壓濃縮過濾出的物質以除去 有機溶劑，從而獲得剩餘物鵝去氧膽酸混合物(CDCA、 HDCA、 HCA 和keto)。
步驟2:鵝去氧膽酸的酯化
向得自前面步驟的剩餘物中加入1500ml甲醇，回流攪拌混合溶 液30分鐘直至剩佘物完全溶解。將溶液冷卻至0 10。C，在攪拌下將 19.5ml硫酸加入到溶液中，之後通過在20 ~ 25。C下攪拌2小時而使鵝 去氧膽酸混合物的酯化反應進行完全。當酯化反應完成後，用53.9g 碳酸氫鈉中和溶液，之後過濾。用600ml甲醇洗滌如此過濾的物質， 並減壓濃縮而獲得534g剩餘物鵝去氧膽酸酯混合物(CDCA-Me、 HDCA畫Me、 HCA-Me和keto-Me)。
步驟3:鵝去氧膽酸酯的乙醯化
向534g得自前面步驟的鵝去氧膽酸酯混合物中加入80g無水乙酸
鈉和800ml無水乙酸。在120~ 140。C下回流混合溶液5小時，之後立 即減壓濃縮。向反應溶液中加入100ml甲笨，回流攪拌15分鐘並減 壓濃縮以徹底除去無水乙酸和乙酸，從而獲得剩餘物乙醯化鵝去氧膽 酸酯混合物(CDCA畫diAc-Me、 HDCA-diAc-Me 、 HCA-triAc-Me和 keto-Ac-Me)。剩餘物的HPLC結果(RT): HCA-triAc-Me(8.76min)、 keto-Ac-Me(9.05min)、 CDCA-diAc-Me(12.21min)和HDCA-diAc-Me (12.81min)。
步驟4:式III和IV中間產物的除去
向得自前面步驟的剩餘物中加入非極性溶劑(2670ml己烷)，之後 將混合溶液攪拌回流30分鐘。然後，將己烷溶劑冷卻至25~35°C， 攪拌3小時，隨後過濾。用534ml己烷額外洗滌如此過濾的物質 (HCA-triAc-Me和keto-Ac-Me)，並減壓濃縮經過濾和洗滌的溶液， 從而獲得剩餘物式I和II的中間產物(CDCA-diAc-Me 、 HDCA-diAc-Me)。剩餘物的HPLC結果(RT): CDCA-diAc-Me (12.21min)和HDCA-diAc國Me(12.81min)。
步驟5:鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯的製備
向得自前面步驟的剩餘物中加入801ml曱醇，並將混合溶液攪拌 回流30分鐘，冷卻至20 25。C，再攪拌2小時，之後過濾。用267ml 甲醇洗滌過濾出的物質(CDCA-diAc-Me),在60'C下真空乾燥獲得 95~98%含量的粗產物。然後，向粗產物中加入288ml甲醇，並在0~ 5。C下重結晶2小時，以獲得99。/。含量的鵝去氧膽酸-二乙酸酯。產率 為143g(113.8g+29.2g母液)。m.p.: 128~129°C。剩餘物的HPLC結 果(RT): CDCA-diAc國Me(12.21 min)。
步驟6:鵝去氧膽酸的脫保護和結晶
向1425ml水中加入143g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-酯和171g氫氧化 鈉，之後將溶液攪拌回流4小時。使用342ml鹽酸將溶液的pH調節 至2~3。之後在35 45。C下攪拌溶液1小時，然後過濾。用142ml 水洗滌過濾出的物質並在70。C下真空乾燥得到113.8g純鵝去氧膽酸。 m.p.: 160 ~ 161°C， [alD25 +13.0。(c=l， CHC13)。
對比例
步驟1:膽汁的預處理
將150g濃縮的豬膽汁溶解在1000ml熱水中。然後加入lOOg氫 氧化鈉，攪拌回流溶液20小時。將該溶液冷卻至25。C。向溶液中加 入1500ml水，使溶液保持冷卻1天。將10g硅藻土加入到反應溶液 中，然後攪拌並過濾以除去沉澱的、式IV的3a-羥基-6-氧代膽酸鈉。 使用濃硫酸將濾出液的pH調節至8，之後加入5g連二亞硫酸鈉，然 後攪拌15分鐘。隨後將400ml乙酸乙酯加入到溶液中，再使用稀釋 的硫酸將pH調節至5。將溶液攪拌30分鐘，通過層分離而從中除去 水層。向有機層中加入7g硅藻土和7g活性炭，然後攪拌30分鐘並過 濾。用50ml乙酸乙酯洗滌如此過濾出的物質，並減壓濃縮。
步驟2:膽汁酸的酯化
將得自前面步驟的剩餘物溶解在300ml甲醇中。將4.0ml濃疏酸 加入到溶液中，在室溫下攪拌l天。之後用碳酸氫鈉(pH7)中和溶液、 過濾，然後減壓濃縮。
步驟3:式II的曱酯的除去
將得自前面步驟的剩餘物溶解在320ml熱苯中，將混合溶液濃縮 至225ml並保持低溫1天。然後過濾溶液；用苯洗滌如此過濾出的物 質(式II的曱酯苯加合物)，減壓濃縮苯-過濾和洗滌的溶液。
步驟4:膽汁酸酯的乙醯化
向得自前面步驟的剩餘物中加入75ml無水乙酸和7.5g無水乙酸 鈉，之後將混合溶液攪拌回流5小時。通過蒸餾無水乙酸、加入35ml 曱醇，之後攪拌回流15分鐘，隨後減壓蒸餾而除去剩餘的無水乙酸。
步驟5:式III的乙醯化酯的除去
在200ml己烷溶劑中回流得自前面步驟的剩餘物，在2(TC下將溶 液貯存l天；並過濾。用己烷洗滌如此過濾出的物質(HDCA-triAc-Me 的粗晶體)，並減壓蒸餾經過濾和洗滌的溶液。
步驟6:式V化合物的分離
將得自前面步驟的剩餘物溶解在46ml熱乙醇中，之後保持冷卻1
天。過濾該溶液，用27ml冷乙醇洗滌如此過濾出的物質，並在60°C 下真空乾燥。使用乙醇對21.5g式V的化合物進行3次重結晶，以獲 得18.5g產物。m.p. 119~121。C; [ajD25 +10.4°(c=l， 二氧雜環己烷);aID25 +13.80(c=l，CHCl3)。 步驟7:皂化和中和
向185ml水中加入18,5g鵝去氧膽酸-二乙酸酯-甲酯和18.5g氫氧 化鈉，之後將混合溶液攪拌回流14小時，然後使用濃硫酸將溶液的 pH調節至4.5。
步驟8:式l化合物的製備
使用乙酸乙酯萃取反應溶液，從中棄去水層。用6%的鹽水洗滌 溶液中的乙酸乙酯層，並將溶液蒸餾至約90ml。冷卻該溶液，加入 90ml己烷，之後保持冷卻1天並過濾。用20ml己烷洗滌如此過濾出 的物質，並在60。C下真空乾燥以製備12.7g鵝去氧膽酸。m.p. 142 ~ 1450C; ["Id25 +13.0o(c=1， CHC13)。
工業實用性
本發明可以從豬膽汁固體中高產率和高純度地純化式I的鵝去氧 膽酸。而且，本發明由於縮短純化時間而適合用於工業純化。
權利要求
1.一種純化式I化合物的方法，該方法包括以下步驟豬膽汁的預處理；膽汁酸的酯化；膽汁酸酯的乙醯化；使用非極性有機溶劑除去中間產物；乙醯化膽汁酸酯的結晶；和脫保護；其中該方法的特徵在於1)作為預處理步驟，將含有35～55wt％鵝去氧膽酸的豬膽汁固體溶解在含有鹽的有機溶劑中；2)作為結晶步驟，在15～25℃的溫度範圍內，使從預處理步驟獲得的產物在C1-4醇中進行結晶；和3)作為脫保護步驟，通過加入鹼使從結晶步驟獲得的產物脫保護，並通過加入酸使脫保護的產物在水存在下結晶。
2. 根據權利要求1的方法，其中用在預處理步驟中的鹽為選自下 列的至少一種鹽氯化鈉、無水硫酸鎂和無水硫酸鈉。
3. 根據權利要求2的方法，其中基於有機溶劑的總重量計，鹽的 量為5~ 10wt%。
4. 根據權利要求1的方法，其進一步包括在結晶步驟之後於0~ 15°C的溫度範圍內在d-4醇中進行重結晶，其中該重結晶產物含有99% 或更多的式V化合物 formula see original document page 3
5. 根據權利要求1的方法，其中結晶步驟在20 25。C的溫度範圍內進行。
6. 根據權利要求1的方法，其中結晶步驟中所用的醇的量為從中 間產物除去步驟獲得的剩餘物的量的0.5 ~ 3倍。
7. 根據權利要求l的方法，其中脫保護步驟的pH為4或更小。
8. 根據權利要求1的方法，其中在水存在下的結晶於35~45°。的 溫度範圍內進行。
全文摘要
本發明涉及一種純化鵝去氧膽酸(3α，7α-二羥基-5β-膽酸)的方法。尤其，本發明涉及一種以高產率和高純度、由低等級的鵝去氧膽酸混合物純化鵝去氧膽酸的方法。
文檔編號C07H21/00GK101365711SQ200680050036
公開日2009年2月11日 申請日期2006年7月31日 優先權日2005年12月30日
發明者尹然貞, 崔秀珍, 李聖宰, 李炳具, 林永默, 秦庸碩, 金月永, 金泰利, 金英洙 申請人:株式會社大熊製藥;大熊化學株式會社