用於真核細胞的培養基的製作方法

2023-04-25 02:54:01 1

用於真核細胞的培養基的製作方法
【專利摘要】本發明涉及選自L-3-苯基乳酸、粘(半乳糖二)酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α-羥基異戊酸、α-羥基異己酸和三羥基丁酸以及它們的組合的C2-C6α-羥基酸在用於培養真核細胞的培養基中作為生長和生產促進成分的用途。本發明另外涉及包含在至少0.001mg/l的水平的這些α-羥基酸衍生物的培養基。
【專利說明】用於真核細胞的培養基

【技術領域】
[0001] 本發明涉及用於培養真核、具體地動物細胞的培養基的生產，以及因此生產的細 胞培養基，和其用於真核、具體地動物細胞的體外培養的的用途。

【背景技術】
[0002] 通過培養哺乳動物、植物或昆蟲細胞，有價值的生物化學品和生物醫藥品，例如抗 體和抗生素的生產需要適當的培養基。已經用包含未定義的成分（如胎牛血清（FCS)，幾 種動物來源的蛋白質和/或牛來源的蛋白質水解產物）的一系列添加物補充細胞培養基成 分。
[0003] 在動物細胞培養中使用的血清或血清來源的物質，如白蛋白、轉鐵蛋白或胰島素， 可以包含可能汙染培養物以及由這些所獲得的生物醫藥產品的不需要的試劑。此外，像牛 肉或膠原水解產物的牛來源蛋白產品承受BSE汙染的風險。而且，必須對所有已知的病毒， 包括可以通過血清傳輸的肝炎和HIV，測試來源於人類血清中的添加劑。
[0004] 總之，通過未知的試劑可以汙染所有血清衍生的產品。在細胞培養中，在血清或蛋 白質添加劑來源於人類或其它動物來源的情況下，無數的問題（例如，不同批次的質量和 組成變化，以及病毒、支原體或BSE汙染的風險）可以發生。因此，植物蛋白質水解產物或 植物蛋白腖普遍使用於應當不含動物組分的培養基。
[0005] 然而，在沒有動物來源的細胞培養添加劑的培養基中，動物細胞的生長和產率總 是無法令人滿意的。頻繁地觀察到，體外培養的動物細胞成團（in lump)生長。這被認為 是欠佳的條件，因為剝奪了在團的核心的細胞的營養物，並且細胞將會死亡。在下遊處理過 程中，還存在堵塞管路或過濾器的風險。通過它們的外觀也可以評估細胞下降的活力。具 有下降的活力的細胞顯示出不規則的形狀，即不圓的外形，並且還具有不同於具有完全明 亮的和透明的細胞內含物的健康細胞的"成粒"細胞內含物。
[0006] W02006/123926涉及在至少一種植物蛋白來源（優選地，來自油菜、小麥或香菜） 的基礎上的一種用於生長和/或培養微生物和/或細胞的肽組合物。在實施例中介紹了小 麥水解產物的效果。
[0007] W02006/128764公開了用於培養生產複合蛋白質的哺乳動物細胞的方法，其中，向 細胞培養物中進料一種或多種植物來源的蛋白腖。舉例證明了植物來源大豆、棉籽和豌豆。 在伴隨實施例中顯示了大豆水解產物對CH0細胞培養的影響。
[0008] W02009/020389公開了向日葵屬（向日葵）物質的蛋白質水解產物作為用於培養 真核、具體地動物細胞的培養基組分的用途。
[0009] US2003/0203448A1描述了用於細胞培養的無蛋白質的和無血清的培養基，包含大 豆水解產物和可選地添加的游離胺基酸。
[0010] Nicoll 等人，Connective Tissue Research,第 42 卷，第 1 期，第 59-69 頁公 開了乳酸在人類皮膚的成纖維細胞中對於軟骨形成（軟骨發展）的誘導的影響的研究。其 中，細胞在包含用10%胎牛血清（FBS)、青黴素、鏈黴素以及80mM乳酸補充的最小必需培養 基（MEM)的培養基中生長。
[0011] Morishima 等人，Neuroscience Research,第 61 卷，第 1 期，第 18-26 頁研究 了在培養的大鼠星形膠質細胞中，乳酸對水通道蛋白質水通道蛋白（AQP4)的表達和定位 的影響。對於這種影響，在包含達爾貝科改進的伊格爾培養基（DMED)、10%胎牛血清（FBS) 以及15-45mM乳酸或乳酸鹽的培養基中培養星形膠質細胞。
[0012] Lampe 等人，Biotechnology and Bioengineering,第 103 卷，第 6 期，第 1214-1223頁公開了乳酸對於神經前體細胞的影響的調查研究。其中，在包括DMEM、青黴 素、鏈黴素、N2、L-穀氨醯胺、鹼性成纖維細胞生長因子（bFGF)以及至多達10mg/ml的乳酸 的培養基中培養細胞。
[0013] Kromenaker 等人，J. Biotechnol?，第 34 卷，1994，第 13-34 頁描述了乳酸濃度對 於雜交瘤細胞生長和抗體生產的細胞周期動力學的影響。在包括DMEM、青黴素、鏈黴素、熱 滅活的馬血清以及至多達140mM的乳酸的培養基中培養細胞。
[0014] Ballez等人公開了一種用於細胞培養的無蛋白質的培養基，包含用0. 1%普朗尼 克（pluronic)F68、0. 04pM亞硒酸鈉和500iiM檸檬酸鐵補充的基礎確定的培養基（BDM) (第105頁，頂部），以及稻穀或小麥蛋白質水解產物。
[0015] US2002/0039787公開了用於在體外培養微血管內皮細胞的方法，所述方法包括， 在存在有效量的人類血清下，培養微血管內皮細胞的富集群。
[0016] 植物蛋白質水解產物的功能性是它的化學成分的直接結果。它受到如原料、加工 因素、過程控制和儲存條件的幾個因素的影響。因此，它導致一種持久的仍很少研究的定義 為"批次間偏差"的現象。
[0017] 生物製藥工業對其表示了重要的關注，其是這些水解產物的消費者，因為它可以 意味著在產品收率上10%至25%的偏差以及它具有直接的財政後果。本發明旨在解決這 些憂慮。


【發明內容】

[0018] 已發現特定c2-c6 a-羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯以及它們的組合對於真核 細胞、特別是動物細胞的體外細胞培養具有強的生長和生產促進效果。這些化合物的最低 水平的存在導致一致的並且因此商業上有吸引力的產品性能。包含這些衍生物的培養基極 其適用於培養真核、具體地動物細胞。因此本發明提供了一種包含這些特定a-羥基酸、它 們的鹽或它們的酯的細胞培養基，以及生產這些培養基的方法和使用包含作為培養基組分 的這些a -羥基酸、它們的鹽或它們的酯的組合物用於在體外培養動物細胞的方法。

【具體實施方式】
[0019] 本發明涉及一種生產用於培養真核細胞、具體地動物細胞的培養基的方法，涉及 選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥 基異戊酸、ct-輕基異己酸以及三輕基丁酸（赤酮酸，erythronic acid)的一種或多種 C2_C6 a-羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合作為生長促進或生產改進成 分的用途。本發明也涉及用於培養真核、具體地動物細胞的培養基，基於乾重，包含至少 0? 02ppm(0. 02mg/kg)，優選地至少0? 2mg/kg，更優選地至少2mg/kg，甚至更優選地至少 20mg/kg，最優選地至少50ppm(50mg/kg)的一種或多種上述的a-輕基酸或它們的衍生物。
[0020] 在本文描述的任何地方，給定的本發明的細胞培養基的成分的量都是基於乾重， 通過任意地取5% (50g/l)的幹固體含量可以得出在液體培養基中的最終濃度，並且反之 亦然。因此，為了得到優選的水平，l〇〇mg/kg乾物質的量對應5mg/l的最終的液體培養 基。這決不意味著液體培養基的幹固體含量應當是5%。取決於特定細胞培養濃度，幹固 體的水平可以選擇為例如〇. 5wt %至30wt %，優選地0. 5wt %至15wt %，更優選地lwt %至 15wt %，最優選地lwt %至5wt %。
[0021] 根據本發明供使用的c2-c6 a -羥基酸在c2-c6主鏈處可以可選地被取代。適合的 取代基包括滷素、酯、醚、羥基、氨基以及芳香族基團。
[0022] 優選的鹽是本發明的C2_C6 a -羥基酸的鈉、鉀、鈣、鎂或銨鹽。
[0023] 優選的酯是本發明的C2_C6a_羥基酸的直鏈或支鏈的酯。
[0024] 具體地，根據本發明供使用的優選的化合物是粘酸和甲基-L-3-苯基乳酸酯。
[0025] 根據本發明使用的a-羥基酸、它們的鹽以及它們的酯可以像這樣使用。大部分 組分是商購的。或者，它們可以通過通常已知的合成或半合成過程產生。大部分的衍生物 也可以從適合的蛋白質部分或水解產物，特別地植物來源的蛋白質如從大豆、豌豆、扁豆、 小麥（麩質）、棉籽（棉子）、稻穀、向日葵、紅花等中分離得到。從蛋白質部分、或更方便地 從蛋白質水解產物中提取或富集它們。這些方法在本領域中是已知的。
[0026] 本發明因此涉及一種通過向培養基的另外的組分添加以下物質生產細胞培養基 的方法：一定量的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥 基丁酸、羥基異戊酸、羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多種C 2_C6 a-羥基酸， 這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合，使得根據本發明並且在下面詳細描述的每種單 獨的a -輕基酸或衍生物在培養基中的最終濃度為至少〇.〇〇lmg/l，優選地至少0. 01mg/l， 更優選地至少〇. lmg/1，最優選地至少lmg/1。優選地，每種單獨的a-羥基酸、這種酸的鹽 或這種酸的酯在培養基中最終濃度為至多50g/l，優選地至多lg/1，更優選地至多100mg/ 1。可以像這樣添加衍生物，例如純化的和/或合成的產品。優選地，這樣的純化和/或合 成的組分具有至少80 %，更優選地至少90 %，最優選地至少95 %的純度。或者，可以作為濃 縮物添加化合物，即通過濃縮或富集根據本發明的一種或多種a -羥基酸或其衍生物的溶 液至按重量計至少〇. 01%，優選地至少〇. 1%，更優選地至少1%，最優選地至少10%，或者 甚至至少25 %，和優選地按重量計至多80 %，更優選地至多70 %的水平，或者具有優選地 至少0. lmg，更優選地至少lmg，甚至更優選地至少10mg，甚至更優選地至少lg，還更優選地 至少10g，最優選地至少100g每kg的乾物質的濃度可獲得的產品。
[0027] 在本發明範圍內，術語"培養基的另外的組分"和"另外的常規培養基組分"是指 本領域通常已知的作為細胞培養基的組分的化合物，如植物或動物細胞因子和/或生長因 子（條件是這些不是動物來源的）、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素（痕量元素， trace element)、核苷、核苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖，抗生素等。植物激素包括生長 激素、赤黴素、脫落酸以及它們的組合。取決於設想的細胞系和細胞方面，技術人員能夠選 擇期望的或需要的另外的培養基組分的類型和數量。
[0028] 本發明另外涉及通過這種方法可獲得的細胞培養基。更具體地，本發明涉及一 種用於培養真核細胞的培養基，包含至少〇.〇〇lmg/l，優選地至少0. 01mg/l，更優選地至 少0. lmg/1，甚至更優選地至少每lmg/1，最優選地至少5mg/l的最終液體培養基的選自 L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥基異戊 酸、a-羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多種C 2-C6a-羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的 酯或它們的組合，其中，濃度是每種單獨的組分。優選地，每種所述單獨的組分在培養基中 的最終濃度為至多50g/l，優選地至多lg/1，更優選地至多100mg/l。就本發明的細胞培 養基的乾重而言，它包含至少〇. 〇2mg/kg，優選地至少0. 2mg/kg，更優選地至少2mg/kg，甚 至更優選地至少20mg/kg，最優選地至少250mg/kg的乾物質，以及至多1000g，優選地至多 2〇g，更優選地至多2g每kg的乾物質的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡 糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a -羥基異戊酸、a -羥基異己酸以及三羥基丁酸的一種或多 種C2_C6a -羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯或它們的組合，其中，濃度是每種單獨的組分。
[0029] 在本發明的優選的實施方式中，細胞培養基包含5mg/l至30g/l每種單獨的組分， 或者100mg至600g，優選地250mg至150g每kg乾物質的濃度的一種或多種上述a -輕基 酸或它們的酯或鹽。更優選的水平是l〇mg/l至lg/1或者200mg至100g，優選地500mg至 50g每kg的乾物質，甚至更優選地20mg/l至500mg/l或者lg至25g每kg乾物質。
[0030] 在本發明的一個實施方式中，根據本發明的a-羥基酸、它們的鹽或它們的酯用 作一種或多種植物蛋白質水解產物的部分。
[0031] 在本發明特別優選的實施方式中，一種或多種a-羥基酸、它們的鹽或它們的酯、 或它們的組合與一種或多種植物蛋白質水解產物組合使用或添加至一種或多種植物蛋白 質水解產物。
[0032]在液體培養基中（基本上水可溶性的）水解產物的量可以由技術人員確定，但是 包含優選地〇?〇〇l_l〇.〇wt/vol%，更優選地0? 01-10. Owt/vol%，更優選地0? 01-4. Owt/ vol%，甚至更優選地0? 05-2. Owt/vol%，或0? 05-1. Owt/vol%，甚至更優選地0? 1-1. Owt/ vol%，並且最優選地0? 2-0. 6wt/vol%。
[0033] 通過本領域已知的方法，例如通過壓制、磨製、剝殼和/或粉碎，通過處理豆、豆 莢、種子等，若需要緊接著脫脂，例如使用如己烷的有機溶劑，可以產生蛋白質水解產物。優 選地，脫脂的種子材料包含至少20wt%的蛋白質。脫脂的種子材料優選地具有不到10wt% 的脂肪含量。
[0034] 通常，通過酶促蛋白水解作用獲得蛋白質水解產物，也可以將其稱為蛋白水解產 物（proteolysate)。（脫脂的）植物種子材料（可選地粉碎的）經受使用來自於細菌、真 菌、植物或動物來源的內切和/或外切蛋白酶或它們的混合物的水解作用；然而，優選地， 酶不來自於動物來源。使用重組DNA技術可以生產酶。優選的酶是內切蛋白酶。更優選地， 酶包含鹼性蛋白酶。適合的蛋白酶包含枯草桿菌蛋白酶（Alcalase)，絲氨酸內切蛋白酶。 特別適合的酶包含來自Novozymes的枯草桿菌蛋白酶，和/或來自於Merck的木瓜蛋白酶。 其它適合的酶包含，例如中性蛋白酶（Neutrase)。
[0035] 水解作用的條件包括30分鐘至30小時；優選地1-6小時，最優選地2-4小時的反 應時間；溫度是20至65°C，優選地40°C至60°C，全部取決於特定的蛋白質來源和期望的水 解程度。pH值可以調整為6.0至8. 5,優選地6. 6至8.0,最優選地為7.0-8. 0。在溶液中 待水解的蛋白質的濃度是1至10 %，優選地2-8，最優選地3-6wt %的蛋白質。基於底物，使 用的酶的量為〇? 5-10wt%，優選地l-5wt%，最優選地1. 5-3. 5wt%。
[0036] 優選地，進行水解作用直至獲得5至50%，優選地10至40%，最優選地10至 30%的水解程度。使用熱處理停止水解反應。優選地，熱處理包括80至100°C 15至90 分鐘的加熱時間（批量熱處理），或在100-120°Cl-5分鐘的加熱時間。採用常規的甲醛 滴定可以確定水解的程度，如在實施例中所確定的。在水解反應終止之後，可以可選地精 煉（polish)反應混合物以去除不可溶的部分，例如使用離心作用或者諸如硅藻土（例如 Celitex，Dicaliteu, Hyfl〇K )的在本領域中已知的過濾助劑。優選地，基於乾物質，水 解產物包含不到l〇wt%的不可溶於水的材料，更優選地不到5wt%，最優選地不到2wt%。 例如，通過噴霧乾燥或冷凍乾燥可以乾燥水解產物。可以像這樣使用或者可以進一步分餾 水解產物。
[0037]基於總蛋白質，優選地，水解產物包含20至80wt %，特別地20至60wt %的具有 100-500Da的分子量的肽和/或10至30wt%的500至lOOODa的分子量的肽。就肽長度而 言，基於總蛋白質，水解產物優選地包含至少15wt%，更優選地至少25wt%，最優選地至少 35wt%，至多達例如85wt%，更優選地至多達65wt%，最優選地至多達55wt%的二肽至五 肽，8至30wt%的六肽至九肽，至少8wt%，特別地，15至60wt%的高級肽（higher peptide) 和0. 1至30wt %，優選地0.5至10wt %的游離胺基酸。在優選的實施方式中，可以超濾水 解產物，優選地，使用5或10kDa分子量的截留（cut-off)。水解產物可以包含另外的組分， 如碳水化合物、可溶纖維、多價金屬鹽等。優選地，蛋白質的含量（所有蛋白質類材料，包括 游離胺基酸）是30至90wt %，更優選地45至85wt %。這些量是基於乾重的。
[0038] 水解產物可以與培養基的其它常規組分組合，如植物或動物細胞因子和/或生長 因子（條件是這些不是動物來源的）、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核 苷酸、植物激素、包括葡萄糖的糖、抗生素等等。植物激素包含生長激素、赤黴素、脫落酸以 及它們的組合。
[0039] 根據本發明的細胞培養基可以進一步包含選自胺基酸衍生物；酚酸衍生物；直鏈 c 2-c6或環狀C6糖醇；批陡酸（pyridinic acid)衍生物；以及選自尿啼陡、腺噪呤、3'-單磷 酸腺苷（3'_AMP)和5'-單磷酸腺苷的核鹼基和/或核苷酸的一種或多種化合物；以及來自 這些化合物組的化合物的組合。這些化合物的濃度為至少0. 00lmg/1，優選地至少0. 0lmg/ 1，更優選地至少〇. lmg/1，甚至更優選地至少lmg/1，最優選地至少5mg/l的最終的液體培 養基，其中濃度是每種單獨的組分。優選地，在培養基中的最終濃度為至多50g/l，優選地至 多lg/1，更優選地至多l〇〇mg/l每種所述單獨的組分。
[0040] 在優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含選自Y -穀氨醯基胺基酸、焦穀氨 醯基胺基酸、包含穀氨酸（glutamate-containing)或包含脯氨酸的二肽、氧代胺基酸、高 胺基酸（homo-amino acid)、N-乙醯基-胺基酸以及甘氨醯基-甘氨酸的一種或多種氨基 酸衍生物。在特別優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含選自N-乙醯基-甲硫氨酸、 N-乙醯基-苯丙氨酸、N-乙醯基-鳥氨酸、穀氨醯基酪氨酸、穀氨醯基苯丙氨酸、 焦穀氨醯基穀氨醯胺、焦穀氨醯基甘氨酸、纈氨醯基穀氨酸（纈氨醯基穀氨酸酯，valinyl glutamate)、甘氨醯基脯氨酸、環甘氨醯基-穀氨醯胺、5-氧代脯氨酸，以及S-氧代-甲硫 氨酸、和3 -丙氨酸、2-氨基丁酸、甘氨醯基-甘氨酸和高絲氨酸的一種或多種胺基酸衍生 物。
[0041] 在另外的優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含一種或多酚酸衍生物、這些 酚酸衍生物的酯或這些酚酸衍生物的鹽。應理解術語"酚酸衍生物"包括含有酚環和有機羧 酸官能的具有Ci-Ce骨架（主鏈，skeleton)的所有有機化合物，並且這些有機化合物可以被 例如滷素、酯、醚、羥基、氨基和/或芳香族基團在Ci-C；骨架和/或酚環進一步取代。在特 別優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含選自阿魏酸（(E)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯 基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯甲酸）、香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯 甲酸）、芥子酸（3_(4_羥基-3, 5-二甲氧基苯基）丙-2-烯酸）的一種或多種酚酸衍生物， 這些酸的Ci_c4酯，或這些酸的鹽。最優選的酚酸衍生物是阿魏酸、丁香酸，這些酸的 Ci_c4 酯或這些酸的鹽。
[0042]在另外的優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含一種或多種酚酸衍生物。應 理解術語"酚酸衍生物"包括含有吡啶環（C5H4N)和有機羧酸官能的具有Ci-C；骨架所有有機 化合物，並且這些有機化合物可以被例如滷素、酯、醚、羥基、氨基和/或芳香族基團在Ci-Q 骨架和/或吡啶環進一步取代。吡啶氮也可以是季銨化的，即用直鏈、支鏈、飽和的或不飽 和的脂肪族或芳香烴烷基化。
[0043] 優選的鹽是本發明的吡啶酸衍生物的鈉、鉀、鈣、鎂或銨鹽。
[0044]優選的酯是本發明的吡啶酸衍生物的直鏈或支鏈酯。
[0045] 根據本發明的供使用的特別優選的吡啶酸衍生物是葫蘆巴鹼（1-甲基吡啶-3-羧 酸鹽）。
[0046] 在另外的優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含一種或多種直鏈C 2_C6糖醇 或環狀C6糖醇。在本發明的範圍內，術語"C2_C 6糖醇"是指具有通式H(HCH0)n+1H的直鏈化 合物，其中n是1、3、4或5,以及環狀(： 6化合物環己烷-1，2,3,4,5,6-六醇。這些化合物 的典型的實例分別是木糖醇、蘇糖醇、甘露醇和肌醇、異肌醇、L-手性-肌醇和D-手性-肌 醇。在特別優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含一種或多種糖醇，這些糖醇選自手性 肌醇、赤蘚醇、蘇糖醇以及山梨醇，最優選地手性肌醇。
[0047] 在又一個優選的實施方式中，細胞培養基進一步包含選自尿嘧啶、腺嘌呤、3' -單 磷酸腺苷（3' -AMP)以及5' -單磷酸腺苷（AMP)的一種或多種核鹼基和/或核苷酸。
[0048] 在本發明典型的實施方式中，細胞培養基包含選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二） 酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2_羥基丁酸、a _羥基異戊酸、a _羥基異己酸以及三羥基丁 酸的一種或多種C2_C6 a _羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯；以及選自Y _穀氨醯基胺基酸、 焦穀氨醯基胺基酸、包括穀氨酸鹽/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代胺基酸、高胺基酸、N-乙 醯基-胺基酸以及甘氨醯基-甘氨酸的一種或多種胺基酸衍生物，其中這些化合物的濃度 為至少0. 001mg/l，優選地至少0. 01mg/l，更優選地至少0. lmg/1，甚至更優選地至少lmg/ 1，最優選地至少5mg/l的最終液體細胞培養基，其中濃度是每種單獨的組分。優選地，在培 養基中的最終濃度為至多50g/l，優選地至多lg/1，更優選地至多100mg/l每種所述單獨的 組分。
[0049] 在本發明的另一個實施方式中，細胞培養基包含選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖 二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2_羥基丁酸、a _羥基異戊酸、a _羥基異己酸以及三羥 基丁酸的一種或多種C2_C6 a _羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯；以及選自Y _穀氨醯基氨 基酸、焦穀氨醯基胺基酸、包括穀氨酸鹽/酯或包括脯氨酸的二肽、氧代胺基酸、高胺基酸、 N-乙醯基-胺基酸以及甘氨醯基-甘氨酸的一種或多種胺基酸衍生物；一種或多種酚酸衍 生物、這些酚酸衍生物的酯或這些酚酸衍生物的鹽；一種或多種直鏈c2-c6糖醇或環狀c 6糖 醇；選自尿嘧啶、腺嘌呤、3'-單磷酸腺苷（3'-AMP)以及5'-單磷酸腺苷（AMP)的一種或多 種核鹼基和/或核苷酸；葫蘆巴鹼（1-甲基吡啶-3-羧酸鹽），其中這些化合物的濃度為至 少0. 001mg/l，優選地至少0. Olmg/1，更優選地至少0. lmg/1，甚至更優選地至少lmg/1，最 優選地至少5mg/l的最終液體細胞培養基，其中濃度是每種單獨的組分。優選地，在培養基 中的終濃度為至多50g/l，優選地至多lg/1，更優選地至多100mg/l每種所述單獨的組分。
[0050] 商購的基礎培養基也可以與本發明的a-羥基酸和可選的蛋白質水解產物組合 使用。可以使用的動物細胞系如來自於Lonza的CH0-1、⑶-CH0、PowerCHO,來自於Irvine Scientific的ISCH0-CD，或者來自於SAFC的Excell 325PF CH0。對於植物細胞，可以使用 從SAFC可獲得的Murashige和Skoog基礎培養基。水解產物也可以是來自於不同的蛋白 質來源的水解產物，如來自小麥和大豆、大豆和豌豆、稻穀和棉籽的水解產物。優選地，細胞 培養基不包含諸如胎牛血清的血清或血清來源的組分，以使得是完全可複製的和/或避免 汙染。優選地，細胞培養基不含動物組分，如動物來源的蛋白質和/或動物（例如牛來源） 的蛋白質水解產物。因此，在優選的實施方式中，本發明涉及在本文中所定義的用於培養真 核細胞的無血清的培養基，和製備這樣的無血清培養基的方法。
[0051] 根據本發明的細胞培養基和培養方法能夠支持真核、具體地動物細胞的培養，其 中能力指的是在體外通過細胞能夠至少生存、增殖和/或分化，並且優選地進行產物的表 達。在分批、補料、連續或灌注的反應器中培養均是設想到的。
[0052] 在細胞倍增和生長的實際生長階段和生產階段中，細胞生長曲線可以是分離的， 在生產階段中，細胞或多或少處於一種穩定的狀態，只是開始產生感興趣的代謝物，例如抗 體。本發明的a-羥基酸能夠支持動物或其它真核細胞的生長階段和生產階段。
[0053] 可以以液體或以粉末的、乾燥的形式提供細胞培養基。在液體培養基中（基本上 水可溶性的）粉末的或乾燥的細胞培養組分的量可以通過技術人員確定，但是包含優選 地 0? 01-10. Owt/vol %，更優選地 0? 01-4. Owt/vol %，甚至更優選地 0? 05-2. Owt/vol %，或 0? 05-1. Owt/vol %，甚至更優選地 0? 1-1. Owt/vol %，並且最優選地 0? 2-0. 6wt/vol %。
[0054] 在可以用水重建的乾燥細胞培養基中水解產物的量取決於培養基組分，但是典型 地在2-80% w/w，優選地5-50% w/w的範圍之內。優選地，細胞培養基也包含糖、具體地葡 萄糖，優選地10至〇. 1、更優選地2. 5至0. 4的葡萄糖和水解產物的乾重比率，以及上述的 另外的成分。
[0055] 而且，本發明涉及用於培養真核細胞的細胞培養基的用途。真核生物包括真菌 (包括酵母）、原生生物、色藻界、植物界以及後生動物（動物）。本發明特別涉及用於培養 植物細胞（例如稻穀、菸草和玉米），並且尤其是動物細胞，優選地，體外培養的用途。所要 培養的細胞可以是自然來源的或者可以是遺傳改變的。動物細胞特別包含脊椎動物和無脊 椎動物細胞，包含諸如人類細胞（例如，PER C6 ce丨丨S& )的哺乳動物細胞，嚙齒類動物細胞， 具體地，中國倉鼠卵巢（CH0)細胞、鳥、魚、爬行動物、兩棲動物或昆蟲細胞。
[0056] 通過本發明的方法培養的細胞特別適用於在生物製藥業中可以進一步純化的蛋 白質產品的表達。在非限制的實施例中，在本發明的培養基中，可以有利地生產包含促紅細 胞生成素（用於治療血液障礙），依那西普（用於治療風溼病和痛風的TNF-a抑制劑），a 鏈球菌（用於治療囊腫性纖維化的脫氧核糖核酸酶）、0 -幹擾素（對於治療多發性硬化） 以及大範圍的治療性單克隆抗體的蛋白質產品。可以通過本領域已知的方法回收蛋白質產 品，如通過分餾、親和色譜法（吸附-脫附）等，或者它們的組合從培養基中分離細胞和從 無細胞液體（上清液）中分離蛋白質產品。
[0057] 而且，本發明涉及一種試劑盒，包括含有選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、 葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、a-羥基異戊酸、a-羥基異己酸以及三羥基丁酸 的一種或多種C 2_C6 a -羥基酸，這些酸的鹽、這些酸的酯以及它們的組合的部分，以及選自 植物水解產物、植物或動物細胞因子和/或生長因子、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微 量元素、核苷、植物激素、核苷酸、糖以及抗生素的一種或多種培養基的組分。在試劑盒中的 組分可以作為一種或多種組合存在。例如，本發明的羥基酸可以單獨地以乾燥的或溶 解的形式存在，並且部分或全部的培養基的另外的組分，如植物水解產物、植物或動物細胞 因子和/或生長因子、維生素、礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、 糖以及抗生素，可以作為單獨的組合存在。或者，a-羥基酸可以與例如胺基酸和/或肽和 /或糖預先混合，並且任何剩餘的組分可以單獨地或以一種或多種組合存在。優選地，至少 一種組合物是液體，液體可以有利地是滅菌的。在使用培養基之前混合試劑盒的組分。
[0058] 因而發現，根據本發明的特定C2-C6a-羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯，以及它 們的用途具有幾個重要的優勢。它們具有生長促進的效果，其超過由常見蛋白質組分提供 的生長。它們導致提高的生產，生產和/或生長較低的差異，並且是成本有效的。
[0059] 在體外培養的動物細胞不是成團或成簇生長的，而是作為單個細胞存在。其次，如 通過完好的圓形和明亮的透明細胞內含物所判斷的，細胞的活力極好。第三，在沒有損害期 望的細胞產物的表達水平的情況下，相比於如那些基於無血清蛋白質、具體地大豆蛋白質 的現有技術細胞培養基，可以獲得高得多的細胞密度。第四，根據本發明的C 2_C6 a -羥基 酸、它們的酯和它們的鹽可以與任何用於動物細胞體外培養的基礎培養基組合，使得能夠 生產具有上面提及的優勢的多種細胞培養基。此外，培養可以延伸延長的時間段，致使更高 的產品收率。
[0060] 實施例
[0061] 實施例1 :包含要求保護的a -羥基酸、這些酸的酯和這些酸的鹽的蛋白質水解產 物的分析，以及生長刺激的證據
[0062] 通過使用Waters Acquity UPLC和由電噴射離子化（ESI)來源和線性離子阱 (LIT)質譜儀組成的Thermo-Finnigan LTQ質譜儀，通過液相色譜/質譜法（LC/MS，LC/MS2) 分析從 FrieslandCampina Domo, USA 獲得的如 SE50MAF-UF、WGE80M-UF、CNE80M-UF、PCE80B 的商用植物蛋白質水解產物。把樣品提取物分成兩個等分部分，乾燥，然後在酸性或鹼性 LC-相容性溶劑中重建。使用分離專用柱在兩次單獨注射中，使用酸性陽離子優化的條件分 析一個等分部分，並且使用鹼性負離子優化的條件分析另一等分部分。使用均含有〇. 1 % 甲酸的水和甲醇梯度洗脫在酸性條件中重建的提取物，而也使用水/甲醇的鹼性提取物包 含6. 5mM碳酸氫銨。MS分析在MS和使用動態排除的數據依賴MS2掃描之間交替。通過比 較純化標準品的代謝物組學庫登記項（庫體，library entry)或重現的未知實體確定生物 化學品。對於特定化合物或同重元素的實體，色譜的特性和質譜的組合給出了匹配的指示。 因此，產生了存在於植物蛋白質水解產物中的生物化學組分和它們的相對濃度的概述。而 且，在細胞培養試驗中測試的所有水解產物用於細胞生長和抗體生產。在細胞生長和化合 物分析數據中進行線性回歸分析，以確定顯著影響細胞生長和抗體生產的生物化學組分。 使用Microsoft Excel 2003的SLOPE功能，計算抗體生產和組分相對濃度之間的關係，其 結果示出於下表1中。正斜率越高，在細胞培養中生物化學組分的重要性越高。也使用MS Excel的關聯回歸函數計算p-值，其代表值的顯著性，越低的p-值（全部在0到1之間）， 測定值越顯著。
[0063] 表1:抗體產量和a-羥基酸衍生物的相對濃度的關係
[0064]

【權利要求】
1. 一種生產用於培養真核細胞的培養基的方法，包括向另外的常規培養基成分添加選 自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、 α-羥基異 戊酸、α -羥基異己酸和三羥基丁酸的一種或多種C2_C6a -羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的 酯以及它們的組合作為生長促進和/或生產改進成分的步驟， 使得每種單獨的α -羥基酸、其酯或其鹽在所述培養基中的最終濃度為至少〇. OOlmg/ 1，其中所述一種或多種C2_C6 α -羥基酸、這些酸的鹽或這些酸的酯作為純物質或作為濃縮 物添加。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，在所述培養基中的所述最終濃度為至少0. Olmg/ 1，更優選地至少〇. lmg/1，最優選地至少lmg/1。
3. 根據權利要求1或2所述的方法，其中，所述C2_C6 α-羥基酸選自L-3-苯基乳酸和 粘酸。
4. 根據權利要求1-3中任一項所述的方法，其中，另外向所述培養基添加植物蛋白質 水解產物。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述植物蛋白質水解產物是小麥、大豆、棉花或 豌豆蛋白質水解產物，或者這些水解產物的兩種或更多種的混合物。
6. 根據權利要求1-5中任一項所述的方法，其中，向所述培養基添加選自以下各項的 另外的一種或多種化合物：選自γ-穀氨醯基胺基酸、焦穀氨醯基胺基酸、包含穀氨酸或包 含脯氨酸的二肽、氧代胺基酸、高胺基酸、Ν-乙醯基-胺基酸以及甘氨醯基-甘氨酸的氨 基酸衍生物；酚酸衍生物；直鏈C 2-C6或環狀C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及選自尿嘧啶、腺嘌 呤、3' -單磷酸腺苷（3' -AMP)和5' -單磷酸腺苷（AMP)的核鹼基和/或核苷酸，或來自 這些化合物組的化合物的組合，使得每種單獨的化合物在所述培養基中的最終濃度為至少 0. 00 lmg/1，優選地至少0. 0 lmg/1，更優選地至少0. lmg/1，最優選地至少lmg/1。
7. -種通過根據權利要求1-6中任一項所述的方法可獲得的細胞培養基。
8. -種用於培養真核細胞的培養基，包含至少0. 〇〇lmg/l，或至少0. 02mg/kg的乾物質 的選自L-3-苯基乳酸、粘（半乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α-羥 基異戊酸、α -羥基異己酸和三羥基丁酸的一種或多種C2_C6 α -羥基酸，這些酸的鹽，這些 酸的酯以及它們的組合。
9. 根據權利要求7或8所述的培養基，包含至少0. 01mg/l，更優選地至少0. lmg/1，甚 至更優選地至少lmg/1，最優選地至少5mg/l，或者至少0. 2mg/kg，更優選地至少2mg/kg，甚 至更優選地至少20mg/kg，最優選地至少250mg/kg的乾物質的選自L-3-苯基乳酸、粘（半 乳糖二）酸、葡糖酸、葡糖二酸、甘油酸、2-羥基丁酸、α -羥基異戊酸、α -羥基異己酸和三 羥基丁酸的一種或多種C2_C6 α -羥基酸，這些酸的鹽，這些酸的酯以及它們的組合。
10. 根據權利要求7-9中任一項所述的培養基，包含至多50g/l，優選地至多lg/Ι，更 優選地至多l〇〇mg/l每種所述單獨的組分，或者至多1000g，優選地至多20g，更優選地至多 2g/kg的乾物質的一種或多種所述C 2_C6a -羥基酸、它們的酯、它們的鹽或它們的組合，其 中所述濃度是每種單獨的組分。
11. 根據權利要求7-10中任一項所述的細胞培養基，以5mg/l至30g/l或100mg至 600g/kg乾物質，優選地5mg/l至3g/l或100mg至150g，更優選地250mg至60g/kg乾物質 的濃度的每種單獨的組分，包含一種或多種所述C 2-C6 α -羥基酸、這些酸的鹽、這些酸的酯 以及它們的組合。
12. 根據權利要求7-11中任一項所述的培養基，所述培養基進一步包含選自維生素、 礦物質、胺基酸、緩衝鹽、微量元素、核苷、核苷酸、植物激素、糖、抗生素和蛋白質水解產物 的培養基的一種或多種常規組分。
13. 根據權利要求7-12中任一項所述的培養基，所述培養基進一步包含選自小麥、大 豆、棉花或豌豆蛋白質的一種或多種水解產物。
14. 根據權利要求7-13中任一項所述的培養基，所述培養基進一步包含選自以下各項 的一種或多種化合物：由穀氨醯基胺基酸、焦穀氨醯基胺基酸、包含穀氨酸或包含脯氨 酸的二肽、氧代胺基酸、高胺基酸、N-乙醯基-胺基酸和甘氨醯基-甘氨酸組成的胺基酸 衍生物的組；酚酸衍生物；直鏈C 2-C6或環狀C6糖醇；吡啶酸衍生物；以及選自尿嘧啶、腺嘌 呤、3' -單磷酸腺苷（3' -AMP)和5' -單磷酸腺苷（AMP)的核鹼基和/或核苷酸，或來自這 些化合物組的化合物的組合。
15. 根據權利要求7-14中任一項所述的培養基，其中，所述胺基酸衍生物選自γ-穀氨 醯基-酪氨酸、Y -穀氨醯基苯丙氨酸、環甘氨醯基-穀氨酸、纈氨醯基穀氨酸、5-氧代脯氨 酸和β -丙氨酸。
16. 根據權利要求7-15中任一項所述的培養基，其中，所述酚酸選自阿魏酸 ((Ε)-3-(4-羥基-3-甲氧基-苯基）丙-2-烯酸）、丁香酸（4-羥基-3, 5-二甲氧基苯 甲酸）、香草酸（4-羥基-3-甲氧基苯甲酸）、芥子酸（3-(4-羥基-3, 5-二甲氧基苯基） 丙-2-烯酸），這些酸的酯，或這些酸的鹽，優選地，阿魏酸、丁香酸，這些酸的酯或這些酸的 鹽,這些酸的鹽和這些酸的酯。
17. 根據權利要求7-16中任一項所述的培養基，所述培養基包含選自手性肌醇、赤蘚 醇、蘇糖醇、山梨醇和葫蘆巴鹼的一種或多種化合物。
【文檔編號】C12N5/00GK104271734SQ201380024347
【公開日】2015年1月7日 申請日期:2013年3月8日 優先權日:2012年3月8日
【發明者】阿希謝卡·古普塔, 米雷列·瑪麗亞·加德利亞, 多米尼克·伊夫·威利·馬埃斯 申請人:菲仕蘭產品有限公司