樹舌種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應用的製作方法

2023-07-10 11:28:56 3

專利名稱：樹舌種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬靈芝菌株鑑別領域，特別是涉及一種樹舌種菌株或子實體特異性分子標 記及其獲得方法與應用。
背景技術：
在我國和日本民間樹舌作為藥物，主治急慢性肝炎、早期肝硬化、食管癌、肺癌、肝 癌、鼻咽癌、胰腺癌、胃癌、乳房癌。明顯改善睡眠質量，曾強免疫力。對便秘，尿急， 尿頻，美容，排腸毒等均有很好效果。還可以治療風溼性肺結核，有止痛、清熱、化積、 止血、化痰之功效。該菌子實體熱水提取物對小白鼠肉瘤180的抑制率為64.9%。作為一種 藥用真菌，它為人類治療疾病發揮著重要作用。
隨著對靈芝的生物學功效的不斷了解，以其為原料開發的產品越來越多，銷售量也越 來越大，靈芝原料的質量越來越受到重視。近年來，隨著靈芝各種產品的商品化，大大帶 動了中國靈芝栽培生產的迅速發展，同時靈芝的種質資源也在不斷擴大，但是由於我國食 藥用菌品種登記制度尚未完善，因此靈芝的生產用菌種比較混亂，同種異名和異名同種的 現象在栽培生產上非常普遍，這不僅給菌種的管理帶來了難度，也給以靈芝為原料的保健 品及藥品等的相關產業造成了一定的經濟損失。現在因為菌種問題常常造成我國靈芝產品 質量難以穩定的局面，也嚴重地制約了我國靈芝產品走出國門，走向國際市場的步伐。
傳統的分類鑑定主要依據子實體的形態學特徵來進行，包括擔孢子的大小和子實體真 皮菌絲的形態特徵，但是子實體的許多形態學特徵往往隨著生長條件的不同而發生變化， 而且許多鑑別性特徵經常是幾個種所共有的，這給傳統的分類學帶來了很大的困難，僅僅 依據形態學特徵進行菌種鑑定不是很可靠。因此，尋找可靠的鑑定手段，對靈芝產業的進 一步發展尤為重要。
近年來，國內對栽培靈芝菌株的分類研究也越來越多，主要是集中在應用拮抗實驗、 RAPD (Random amplified polymorphic DNA，隨機擴增的多態性DNA)分析及同工酶分析 技術方面。
張松等(1995)通過對4株靈芝菌株的酯酶同工酶酶譜的分析發現，供試的四個菌株 存在5條相同的酶帶，說明它們具有靈芝的某些共同的遺傳特徵，在其代謝過程中具有某 些相似的生理活動，但各菌株在酶帶數目、Rf值及含量百分比上存在差異，均具有自己的 特徵酶帶，同時發現子實體形態學特徵相似的，酯酶同工酶酶譜也相似，親緣關係比較近， 這些說酯酶同工酶分析對於靈芝的分類鑑定有一定的價值。趙明文等(2003)利用RAPD技術對生產中常用的靈芝屬8個菌株的親緣關係進行了 分析。根據UPGMA構建的樹狀圖將8個菌株在較低的相似水平上分成3個明顯不同的組: 第1鄉且包,舌黑芝(Gawotfenwa fl^""w) 、 ；fe、杉靈芝(Gawode/7Wflf "wgae)、 圓芝(Ga"ocferwa raft/wcfc^w附)、靈芝0770 (Gflfwoc/enwfl /wc/c/ww 0770)禾口韓國靈芝(Gawo(/er附fl /wc/c ww HG); 第2組包括密紋靈芝(Gawoc/er附a or6raWn'a加附)禾口紫靈芝(Gawo^fe/vwa s/wem"e); 第3 組為樹舌靈芝(Ga oAwzaa;^/" fltoM)。這一結果與經典分類結果基本相符，表明RAPD 技術可以用來區分生產中一些常用的靈芝種，同時說明靈芝生產用種之間遺傳差異較大， 可能是造成靈芝產品研究比較混亂的重要原因。
1999年我國籤署了《國際植物新品種保護法》，這不僅要求我們尊重其它國家的品種 智慧財產權，同時也要加強保護我們國家自己的品種智慧財產權，為了建立食用菌新品種登記 制度來真正保護我國的品種產權，必須首先建立成熟的品種鑑定技術，為新品種登記奠定基礎。
隨著分子生物學技術的快速發展，特別是分於標記和基因標記技術的建立與成熟，為 發展簡便、快速、準確的鑑定技術提供了有效手段。SCAR(S叫uence Characterized Amplified Region)標記是一種十分穩定的分子標記，在應用上具有迅速、簡便、低成本的特點，本 發明建立了樹舌種的SCAR分子標記，能對樹舌種進行快速鑑定。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種樹舌種菌株或子實體的特異性分子標記及 其獲得方法與應用，通過該分子標記能簡便、快速、準確的鑑定和檢測樹舌菌種。
本發明的樹舌種菌株或子實體的特異性分子標記，是一種基因SCAR分子標記， 是PCR擴增後為471bp的特異DNA片斷，其PCR擴增引物對序列為 5'cgtgaaacgggctcgtttat 3'禾卩5'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3'。
本發明的樹舌種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，包括如下步驟 I.菌株或子實體基因組DNA的提取
(1) 菌株基因組DNA的提取
將4-6'C的菌種轉接到PDA斜面上，26-28'C培養活化，5-7天後轉接到馬鈴薯葡萄糖培 養液中，26-28振蕩培養10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;
(2) 子實體基因組DNA的提取
將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTA Na2 混合物浸泡處理20-30小時，過濾，水衝洗，研磨粉碎後，加入800-1000nLpH8.0CNETS溶液分裝於2ml離心管中，60-7(TC保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min後，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%(m/V)SDS;
II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、測序及序列比對 用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，；
ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實體ITS片段；然後測序並比對各個靈芝屬種的代表性的序列。
III. 特異性PCR引物的獲得
根據ITS序列的比對結果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結合位點(見下面序 列的紅色加粗部分)，利用Primer Premier5.0並設計出特異性PCR引物對為 5 'cgtgaaacgggctcgtttat 3鄰5 'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3';
IV. 用特異PCR擴增引物對對密紋薄芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴 增
V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
上述PCR擴增產物6-8pL，與0.5^L加樣緩衝液混勻，點樣於1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠 上，於1.0XTAE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束後，用溴化乙錠溶液染色5-10min， 凝膠成像儀上照相。
所述步驟I (l)中所述的LETS提取法
① 將凍幹的菌絲大約20-30mg置於預冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，後迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩衝液，分裝於2個1.5ml的離心管中；
② 向每個管中加入600-800pL的苯酚:氯仿異:戊醇(縮寫為PCI)(比例為25:24:1)上下 顛倒，充分混勻，4-10。C 16000g離心8-15分鐘;
③ 輕輕吸取上清於新的離心管中，加入500nL的PCI， 4'C 16000g離心8-15分鐘；
④ 重複步驟③，直到兩相的界面沒有雜質為止；
⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-20匸預冷的無水乙醇或95%乙醇，輕輕混勻， 置於-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；
⑥ 取出，4'C16000g離心10-15分鐘；
⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預冷的70。/。 (V/V)乙醇，用指頭輕輕敲打沉澱使其溶 解，靜置一會兒，4'C16000g離心10分鐘；
⑧ 重複步驟⑦1次；(D倒去上清，待管中酒精揮發後，加入適量體積的TE緩衝液(pH8.0)，按100mlTE緩衝液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑩將獲得的基因組DNA經過ITS-PCR擴增後再通過1.0。/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質量是否滿足試驗需要。
所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括
① 將已經預處理過得子實體置於預冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，後迅速向研缽中加 入1000ml己配製定好的CNETS緩衝液，分裝於2個2.0 ml的離心管中；
② 向每個離心管中加入600-800pL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;
③ 取上清，重複重複步驟②1-2次；
④ 取上清，加入600-80(^L 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑤ 取上清，加入500-600nL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 去上清，向沉澱中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15 min;
⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發後，加入20-3(HiL的TE緩衝液(pH8.0)，按100mlTE緩衝液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑧ 將獲得的基因組DNA經過ITS-PCR擴增後再通過1.0y。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質量是否滿足試驗需要。
所述步驟II中，ITS-PCR擴增反應體系(25y 1): 10XPCR buffer (Promega) 2. 5ul, 25鵬ol/LMgC12(Promega) 2. 1， 10mmol/L dNTPs 0. 5 u L，引物ITS1F/ITS4(10 u mol/L) 各lul， Taq酶(5U/ul) (Promega) 0. 25ul， DNA模板(10 ng/u L) 1 u L，加無菌雙蒸 水補足，PCR反應條件為94。C 2 min; 94°C 15s， 62"30s, 72°C 1 min， 28個循環； 72°C 5min，密紋薄芝種菌株或子實體ITS序列，大小為632bp，具體如下AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATGA 。
所述步驟IV中，PCR擴增的反應體系總體積為25pL: 10XPCR buffer 2.5pL， 25mmol/L MgCl22.0pL， 10 mmol/L dNTP 0.5pL， lOpmol/L特異引物對各lpL， 5U/^iL Taq 酶0.3(VL， 10-20ng4iLDNA模板l|aL，無菌雙蒸水補足25pL; PCR反應條件為94°C 2 min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環;72°C 5min。
所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴增產物6-8^L，與0.5pL加樣緩衝 液混勻，點樣於1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，於1.0XTAE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電 泳結束後，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
本發明的樹舌種菌株或子實體的特異分子標記應用於快速鑑定和檢測樹舌種菌 株及市售靈芝類產品的真偽。 本發明的有益效果
(1) 只有樹舌菌種能PCR擴增出分子量為471bpDNA的專一擴增條帶，而靈芝屬的其 它菌種均未出現該特異性片斷；
(2) 採用這種特異性分子標記進行檢測，與常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比， 具有檢測時間短，準確性高的優點，該檢測所需時間只需要2-3天，而常規的拮抗試驗所 需時間至少需要兩周時間，出菇試驗則需要5-6個月的時間。


圖1是ITS-PCR擴增產物電泳圖譜；
圖2是樹舌特異引物對PCR擴增產物電泳圖譜。
其中，生產用種(136支):1-27， 29， 30， 32-38， 40-42， 44-49， 52， 54， 59， 60， 62, 63， 65-86， 88-101， 103， 104， 106-109， 111-113， 115-117， 120， 146， 149-154， 157-189; 來自ATCC (24支)121-126， 128-145;
標號中間有斷開的，這是因為在菌種保藏過程中失去活力了，但並未因此改變其他菌株的編號。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術 人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
實施例1
菌種收集到來自國內的140支靈芝屬生產用菌種以及來自ATCC 24支共計164支菌 株，它們分屬於赤芝、紫芝、樹舌、松杉靈芝、樹舌、密紋薄芝、紫光靈芝、近擬鹿角靈 芝、黃靈芝以及無柄靈芝等IO餘個種。對它們的基因組DNA和樹舌117的子實體基因組 (編號l卯)DNA共計165個樣品進行PCR擴增。
一、 基因組DNA的提取
1. 菌絲培養和基因組DNA的提取
將4-6'C保藏的菌種轉接到PDA斜面上，26-28'C培養活化，5-7天後轉接到馬鈴薯葡萄 糖培養液中，26-28振蕩培養10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;
2. 子實體基因組DNA的提取
① 將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% (V/V)酒精和0.5 mol/L EDTANa2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾；
② 過濾後用滅過菌的雙蒸水衝洗，放在滅過菌的研缽中用液氮處理並進行研磨；
③ 向每個離心管中加入600-800nL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min; 取上清，重複重複步驟②1-2次
⑤ 取上清，加入600-800nL 1:1 (V/V)苯酚氯仿混合物混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑥ 取上清，加入500-600pL49:l (V/V)氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;
⑦ 去上清，向沉澱中加入70% (V/V)的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15min;
⑧ 倒去上清，待管中酒精揮發後，加入20-3(VL的TE緩衝液(pH8.0),按100mlTE緩衝液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；
⑨ DNA稀釋至10-20 ng/pL， .20。C保存。
二、 特異性PCR擴增
擴增的反應體系總體積為25pL: 10XPCRbuffer 2.5pL， MgCl2 (25mmol/L ) 2.0^L， dNTP (10腿ol/L) 0.5nL， 10,1/L特異引物對(5'cgtcgtaaagcgagtctcttc 3'禾口 5'ggtcataaagttgtcccagac 3')各l(xL， Taq酶(5U4iL) 0.30nL， DNA模板(10-20ng/^L) ltiL，無菌雙蒸水補足25^L。 PCR反應條件為94°C 2min; 94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環；72。C 5min。
三、 瓊脂糖凝膠電泳檢測
取特異性PCR擴增產物6-8pL，與0.5pL加樣緩衝液混勻，點樣於1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，於l.OXTAE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結束後，用溴化乙錠溶液染色 5-10min，自來水衝洗後在凝膠成像儀上照相。
結果發現，在這些樣品中只有樹舌種能擴增出大小為471bp的專一擴增條帶，而靈芝 屬的其它菌種均未出現該特異性片斷。
權利要求
1.一種樹舌種菌株或子實體的特異性分子標記，其特徵在於該標記是一種基因SCAR分子標記，是PCR擴增後為471bp的特異DNA片斷，其PCR擴增引物對序列為5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttgtctctgtaac 3′。
2. 樹舌種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，包括步驟I.菌株或子實體基因組DNA的提取(1) 菌株基因組DNA的提取將4-6'C的菌種轉接到PDA斜面上，26-28'C培養活化，5-7天後轉接到馬鈴薯葡萄糖培 養液中，26-28振蕩培養10-14天，收集菌絲，用LETS法提取基因組DNA;(2) 子實體基因組DNA的提取將子實體l-2g剪碎，用體積比為1:2-3的95% V/V酒精和0.5 mol/L EDTA Na2混合 物浸泡處理20-30小時，過濾，水衝洗，研磨粉碎後，加入800-1000pL pH 8.0 CNETS溶 液分裝於2ml離心管中，60-70。C保溫1-3小時，10000-12000g離心2-5min後，取上清， 按照酚/氯仿法提取子實體基因組DNA，其中的CNETS溶液組成是l%(m/V)CTAB、 1 mol/L NaCl、 10mmol/LEDTA、 20 m mol/L Tris-Cl、 l%m/VSDS;II. 密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或子實體ITS片段的獲得、測序及序列比對 用ITS-PCR法，其中ITS引物對為ITS1F: 5，-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3，；ITS4: 5 '-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'，得密紋薄芝種及靈芝屬其他種的菌株或 子實體ITS片段；然後測序並比對各個靈芝屬種的代表性的序列。III. 特異性PCR引物的獲得根據ITS序列的比對結果，找到密紋薄芝的ITS序列上特異性的結合位點，利用Primer Premier5.0 並設計出特異性 PCR 引物對為 5'cgtgaaacgggctcgtttat 3'禾口 5'ggtcataaaagttgtctctgtaac 3';IV. 用特異PCR擴增引物對對密紋薄芝種菌株或子實體的基因組DNA進行PCR擴 增V. 瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3. 根據權利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特 徵在於所述步驟I(1)中所述的LETS提取法① 將凍幹的菌絲大約20-30mg置於預冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，後迅速向研缽中加 入1000ml已配置好的LETS緩衝液，分裝於2個1.5ml的離心管中；② 向每個管中加入600-80(HiL的苯酚:氯仿異:戊醇PCI比例為25:24:1上下顛倒，充分混勻，4-10°C 16000g離心8-15分鐘；③ 輕輕吸取上清於新的離心管中，加入500|aL的PCI， 4°C 16000g離心8-15分鐘；④ 重複步驟③，直到兩相的界面沒有雜質為止；⑤ 取上清，向上清液中加入2倍體積的已-2(TC預冷的無水乙醇或95^乙醇，輕輕混勻， 置於-2(TC冰箱中靜置5-10分鐘；⑥ 取出，4。C16000g離心10-15分鐘；⑦ 倒去上清，再向管中加入500pL預冷的70% V/V乙醇，用指頭輕輕敲打沉澱使其溶 解，靜置一會兒，4。C16000g離心IO分鐘；⑧ 重複步驟⑦1次；⑨ 倒去上清，待管中酒精揮發後，加入適量體積的TE緩衝液pH8.0，按100mlTE緩衝液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑩ 將獲得的基因組DNA經過ITS-PCR擴增後再通過1.0Q/。瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質量是否滿足試驗需要。
4. 根據權利要求2所述的密紋薄芝種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特 徵在於所述步驟I (2)中所述的酚/氯仿提取法，步驟包括① 將已經預處理過得子實體置於預冷的無菌研缽中迅速研磨成細粉，後迅速向研缽中加 入1000ml已配製定好的CNETS緩衝液，分裝於2個2.0 ml的離心管中；② 向每個離心管中加入600-800)xL飽和苯酚混勻，12000-14000g離心10-15 min;③ 取上清，重複重複步驟②1-2次； ' 取上清，加入600-80(VL 1:1 V/V苯酚氯仿混合物混勻，12000陽14000g離心10-15 min;⑤ 取上清，加入500-600nL49:l V/V氯仿異戊醇混勻，12000-14000g離心10-15 min;⑥ 去上清，向沉澱中加入70o/。V/V的酒精，振蕩；10000-12000g離心5-15 min;⑦ 倒去上清，待管中酒精揮發後，加入20-30pL的TE緩衝液pH8.0，按100mlTE緩衝液 加入2pL lmg/ml的DNase-free RNase; 37。C溫浴1-2個小時；⑧ 將獲得的基因組DNA經過ITS-PCR擴增後再通過1.0%瓊脂糖凝膠電泳、檢測，以確定 其質量是否滿足試驗需要。
5. 根據權利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異性分子標記的獲得方法，其特 徵在於所述步驟II中，ITS-PCR擴增反應體系25u 1: 10XPCRbufferPromega2. 5u 1， 25mmol/LMgC12 Promega 2. 1， 10酬ol/L dNTPs 0. 5u L，引物ITS1F/ITS4 10nmol/L 各1 ii 1 ， Taq酶5U/ u 1 Promega 0. 25 u 1 ， DNA模板10 ng/ y L 1 " L，加無菌雙蒸水補足，PCR反應條件為94°C 2min;94。C 15s， 62。C30s， 72°C 1 min， 28個循環；72°C 5min， 密紋薄芝種菌株或子實體ITS序列，大小為632bp，具體如下AGGTAGGACTACCCGCTGAACTTAAGCATATGA。
6. 根據權利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特徵在 於所述步驟IV中，PCR擴增的反應體系總體積為25pL: 10XPCRbuffer2.5nL， 25mmol/L MgCl22.0nL， 10mmol/LdNTP0.5pL， lOpmol/L特異引物對各lpL， 5U LTaq酶0.30pL， 10-20ng4iL DNA模板lpL，無菌雙蒸水補足25^L;PCR反應條件為94°C 2 min;94°C 15s， 62°C 30s， 72°C 1 min， 30個循環;72°C 5min。
7. 根據權利要求2所述的樹舌種菌株或子實體的特異分子標記的獲得方法，其特徵在於 所述步驟V中，瓊脂糖凝膠電泳檢測的條件是PCR擴增產物6-8nL，與0.5tiL加樣緩衝液混 勻，點樣於1.2-1.5%的瓊脂糖凝膠上，於1.0XTAE緩衝液中，5V/cm電壓下電泳，電泳結 束後，用溴化乙錠溶液染色5-10min，凝膠成像儀上照相。
8. —種樹舌種菌株或子實體的特異分子標記應用於快速鑑定和檢測樹舌種菌株及市售 靈芝類產品的真偽。
全文摘要
本發明涉及一種樹舌種菌株或子實體特異性分子標記及其獲得方法與應用，該標記是PCR擴增後為471bp的特異DNA片斷，5′cgtgaaacgggctcgtttat 3′和5′ggtcataaaagttgtctctgtaac 3′；獲得方法1)菌株或子實體基因組DNA的提取；2)獲得特異DNA片段；3)獲得特異PCR擴增引物；4)用特異PCR擴增引物對對樹舌種菌株或子實體的基因組DNA進行擴增；5)瓊脂糖凝膠電泳檢測；應用用於快速鑑定和檢測樹舌種菌株及市售靈芝類產品的真偽。本發明的方法常規形態學檢測、拮抗試驗、出菇試驗相比，具有檢測時間短，準確性高的優點。
文檔編號C12Q1/68GK101514368SQ20081020455
公開日2009年8月26日 申請日期2008年12月12日 優先權日2008年12月12日
發明者娜 馮, 方 劉, 劉豔芳, 帥 周, 唐傳紅, 唐慶九, 張勁松, 焱 楊, 蘇春麗, 薇 賈, 郝瑞霞 申請人:上海市農業科學院