用於治療疼痛和copd的極性糖脂的混合物的製作方法

2023-08-01 15:10:06 2

用於治療疼痛和copd的極性糖脂的混合物的製作方法
【專利摘要】本發明涉及用於治療和/或預防疼痛和/或慢性阻塞性肺疾病(Chronic Obstructive Pulmonary Disease，COPD)的方法，所述方法包括對受試者施用包含極性糖脂的組合物，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種(CyP)(cyanobacterium Oscillatoria species(CyP))的細胞獲得。
【專利說明】用於治療疼痛和COPD的極性糖脂的混合物
[0001] 本發明涉及包含極性糖脂的組合物，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種 (cyanobacterium Oscillatoria species, CyP)的細胞獲得，所述組合物用於治療和/或預 防疼痛和 / 或慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, C0PD)。
[0002] 發明背景
[0003] 藍細菌（也稱藍綠藻）是具有獨特特性的活性成分的一種天然源。眾所周 知，來自藍細菌的低分子量糖脂提取物含有一種屬於脂肪酸甘油酯類的脂質組分，例 如單半乳糖甘油二酯（monogalactosyl diacylglycerols, MGDG)、雙半乳糖甘油二酯 (digalactosyl diacylglyceroIs, DGDG)、硫代異鼠李糖醜甘油二酯（sulfoquinovosyl diacylglycerols, SQDG)、磷脂醯甘油（phosphatidyl glycerol, PG),等等。這種從 藍細菌製備的低分子量的提取物已顯示出各種類型的生物活性，例如抗炎的特性， 例如專利申請EP1571203中所述的抗炎的特性，以及如Shiraashi等，1993,0^111· Pharm. Bull.，41:1664-66中所述的抗腫瘤的特性。此外，來自藍細菌的硫代脂 質（sulpholipids)提取物也顯示出抗HIV 的活性（Gustafson，J. Natl. Cancer Instit.，1989, 81:1254-1258)。
[0004] 專利申請WO 2010/010172和WO 2010/094693描述了糖脂級分的製備物，其提取 自淡水（fresh water)藍細菌顫藍細菌屬菌種並包含一種具有脂多糖樣（LPS-Iike)結構 的高分子量的極性糖脂（33KDa)，在此也稱"VB3323"。極性糖脂的這種高純度製備物可從 藍細菌Oscillatoria Plankothotrix菌種提取，其特徵在於存在至少1個高分子量糖脂 種類，所述高分子量糖脂種類包含1個或多個鼠李糖單元。這種製備物的特徵還在於蛋白 質汙染低於或等於總重量的2 %，具體地特徵在於沒有蛋白質汙染，如例如通過Bradford 方法所評估的，以及特徵在於核酸汙染低於或等於總重量的5%，具體地低於或等於總重量 3%。在這種製備物中，能檢測到對ATP合酶（ATP-SX)的抑制活性，導致細胞外ATP水平降 低。
[0005] 專利申請WO 2010/010172和WO 2010/094693已顯示這種糖脂提取物具有強力 的抗炎活性。更準確地說，已顯示所述糖脂提取物具有強力的TLR4拮抗劑活性，因為其 能夠在人樹突細胞中拮抗由TLR4受體LPS激動劑觸發的促炎作用，例如來自大腸桿菌 (E.coli)和馬流產沙門氏菌（Salmonella abortus equi)的LPS，並拮抗來自牙銀卩卜啉單 胞菌（Porphyromonas gingivalis)的LPS的促炎作用。除了其對TLR4的作用以外，還顯 示VB3323部分地抑制細胞表面ATP合酶的活性，其結果是細胞外ATP水平的降低。
[0006] Toll樣受體（TLRs)代表了識別微生物病原性結構和使其進入負責免疫識別和 刺激的細胞的主要路徑之一。而且，近期的研究已顯示TLRs不僅在觸發針對潛在病原體 的炎症反應中有重要作用，而且在由受應激或受損傷的組織所激活的應答中也有重要作 用。TLR4是一種涉及炎症放大（amplification)的關鍵受體。具體地，TLR4已被證明在響 應應激和/或組織損傷而產生的通過外源分子激活的細胞信號傳導中具有重要作用；所 述TLR4已知為涉及對細菌脂多糖（LPS)的先天性免疫應答的受體。這些分子中的一些 是壞死細胞釋放的介質，如熱休克蛋白（Heat Shock Proteins, HSPs)和高遷移率族蛋白 BI (High-Mobility Group protein BI, HMGB1);其他是細胞外基質的產物，如二聚糖、透明 質酸的片段、以及肌腱蛋白C(tenascin-C)。
[0007] ATP是另一種重要的內源促炎症介質，它的下調在減少與TLR4拮抗劑活性協同的 炎症狀態方面具有相關作用。ATP合酶在很多不同細胞類型上表達，包括肝細胞、神經元、星 形膠質細胞、成纖維細胞、免疫細胞、以及內皮細胞，並且在腫瘤細胞的質膜上以特別高的 水平表達。
[0008] 因此，專利申請 WO 2010/010172 和 WO 2010/094693 公開了所述從 Oscillatoria Planktothrix菌種提取的糖脂級分用於治療由促炎症狀態的激活引起的大量多種急性或 慢性病況的用途。
[0009] 發明概述
[0010] 所述發明中一個實施方案包括用於治療和/或預防疼痛和/或慢性阻塞性肺炎 (Chronic Obstructive Pulmonary Disease, C0PD)的方法，其包括對受試者施用包含極性 糖脂的組合物，所述極性糖脂是從藍細菌顫藍細菌屬菌種（cyanobacterium Oscillatoria species，CyP)細胞獲得或可獲得的。所述極性糖脂通常是從藍細菌顫藍細菌屬菌種提取的 脂多糖（lip〇P〇lysaccharide，LPS)。 toon] 在所述方法的一個實施方案中，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種通過如 下方法獲得，包括：(a)提供所述藍細菌；(b)從所述藍細菌提取所述極性糖脂；（c)沉澱來 自步驟（b)的極性糖脂；以及（d)將步驟（c)的經提取並沉澱的極性糖脂純化。在一個具 體的實施方案中，步驟（b)包括用變性溶液來治療，所述變性溶液包含促溶劑和非質子有 機溶劑。
[0012] 在另一個實施方案中，所述方法包括步驟：⑴提供藍細菌的濃縮物；（ii)將所述 濃縮物懸浮於溶液中；（iii)任選地，用微波和/或液體/固體分離來處理，並收集液相（成 為上清）；（iv)將藍細菌的懸浮液或所述上清與包含促溶劑和非質子有機溶劑的變性溶液 混合；(V)將步驟（iv)獲得的溶液進行溫育；(vi)進行液體/液體分離，並收集水性液相； (vii) 沉澱糖脂級分；(viii)將沉澱物重懸於水溶液中；（ix)任選地，用有機溶劑處理在 (viii) 中獲得的溶液，離心，並收集液相；以及（X)通過離子交換柱並收集包含所述極性糖 脂的級分。
[0013] 在一個另外的實施方案中，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種通過如下方 法獲得，所述方法包括用變性的促溶劑提取，用核酸酶處理提取物直到達到核酸汙染水平 低於或等於總重量的5%，在截留為30KDa的設備上進行分子分離，然後是回收更高分子量 的級分。在一個具體的實施方案中，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種通過如下方 法獲得，所述方法包括用變性的促溶劑提取，其中提取步驟如下述步驟（b)中所述進行，核 酸酶處理如下述步驟（g)中所述進行，分子分離如下述步驟（k)中所述進行，並包括進一 步的如下步驟（a)、（c)-(f)、e)、（h)-(j)和（l)-(m) :(a)以1:1-1:2的體積比用水溶液 懸浮藍細菌顫藍細菌屬菌種的濃縮物；(b)將藍細菌的懸浮物與2-4體積的變性溶液進行 混合，所述變性溶液包含促溶劑、極性質子有機溶劑、以及非質子有機溶劑；(c)溫育短於 60分鐘的時間；（d)離心並收集液相（稱為上清）；（e)通過向所述上清添加鹽和有機溶劑 來沉澱糖脂級分，並用經水稀釋的乙醇來洗滌沉澱物（或沉澱）；（f)將沉澱物重懸於水溶 液中；（g)用核酸酶處理，並隨後用蛋白酶處理；(h)通過添加鹽和有機溶劑來沉澱糖脂相； (i)任選地，用經水稀釋的乙醇來洗滌沉澱並重懸於包含離子表面活性劑和季銨鹽的水溶 液中；（j)如步驟（b)-(f)中所述從水溶液中再提取；（k)在截留為30KDa的設備上進行分 子分離；（1)用水或緩衝水溶液來回收高分子量極性糖脂級分並評估核酸或蛋白質汙染的 水平；(m)回收並使用具有低於總重量5%的核酸汙染的級分。
[0014] 在一個進一步的實施方案中，所述組合物包含極性糖脂的混合物，其包含硬脂酸 (C18:0,十八酸）和/或棕櫚酸（C16:0,十六酸）作為主要糖脂組分的脂肪酸，其中它們 的至少一種與包含至少一個單元的鼠李糖或其衍生物的糖類有關。在一個具體的實施方案 中，所述極性糖脂的混合物包含相對於所述糖脂混合物的總脂質級分50% -80%的硬脂酸 ((：18:0，十八酸）和/或15%-40%的棕櫚酸（(：16:0，十六酸）。在另一個具體的實施方 案中，所述極性糖脂的混合物包含了相對於所述糖脂混合物的總脂質級分65-75%的硬脂 酸（(：18:0，十八酸）和/或20-32%的棕櫚酸（(：16 :0，十六酸）。
[0015] 在一個實施方案中，所述藍細菌顫藍細菌屬菌種是以登錄號No. 1459/45保藏在 藻類和原生動物培養物保藏中心（Culture Collection of Algae and Protozoa(CCAP)) 的顫藍細菌屬菌種。
[0016] 在另一個實施方案中，所述方法用於治療和/或預防疼痛。在一個具體的實施方 案中，所述方法用於治療和/或預防神經性疼痛。在另一個具體的實施方案中，所述方法用 於治療和/或預防周圍神經性疼痛、中樞神經性疼痛、或混合（周圍和中樞）神經性疼痛。 在一個進一步的具體實施方案中，所述方法用於治療和/或預防由糖尿病、獲得性免疫缺 陷症候群或癌症引起的神經性疼痛。
[0017] 在一個實施方案中，所述方法用於治療和/或預防C0PD。
[0018] 在一個實施方案中，所述組合物進一步包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/ 或其他穩定劑。
[0019] 在另一個實施方案中，所述組合物用於口服、靜脈內（i.v.)、通過吸入或局部施 用。
[0020] 附圖簡述
[0021] 圖1 :圖IA和B是顯示VB3323急性治療對於弗氏完全佐劑模型（Freund complete adjuvant model)中機械性痛覺超敏（mechanical allodynia)和熱痛覺過敏（thermal hyperalgesia)的作用的圖。
[0022] 圖2 :圖2A和B是顯示VB3323 口服治療的慢性治療對於FCA模型中機械性痛覺 超敏和掌水腫（paw edema)的作用的圖。
[0023] 圖3 :圖3A和B是顯示VB3323 口服治療的慢性治療對於小鼠體重和器官總體形 態學評估的作用的圖。
[0024] 圖4 :圖4A和B是顯示VB3323慢性治療對於坐骨神經結紮模型中機械性痛覺超 敏和熱痛覺過敏的作用的圖。
[0025] 圖5 :圖5是顯示VB3323慢性治療對於小鼠體重的作用的圖。
[0026] 圖6 :圖6是顯示VB3323對於大腸桿菌-LPS溫育過程中TNFa釋放的作用的圖。
[0027] 圖7 :圖7是不同的三批VB3323的NMR)概貌。
[0028] 圖8 :圖8是顯示VB3323治療對於（C0PD模型小鼠）體重變化的作用的圖。
[0029] 圖9 :圖9是顯示VB3323治療對於COro模型小鼠中肺水腫（肺重量）的作用的 圖。
[0030] 發明描述
[0031] 所述糖脂混合物的治療用途
[0032] 本發明的發明人顯示了來自顫藍細菌屬菌種的所述糖脂級分在疼痛的動物模型 中減輕疼痛。特別是，他們已顯示用所述糖脂混合物的急性治療強力且劑量依賴性地在由 弗氏佐劑誘導的慢性炎症小鼠模型中減少機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏（實施例2)。他 們已顯示用如本申請所述的糖脂製備物的慢性治療顯著減少機械性痛覺超敏（實施例3)。 最後，他們已顯示用糖脂製備物的慢性治療在由坐骨神經結紮誘導的神經性疼痛小鼠模型 中顯著減少熱痛覺過敏和機械性痛覺超敏（實施例5)。
[0033] 因此，包含這種糖脂的組合物能夠有利地用於治療和/或預防疼痛，特別是神經 性疼痛。
[0034] 神經性疼痛是由於周圍或中樞神經系統的損傷或功能障礙引起的。神經性疼痛可 以由此被分為周圍神經性疼痛、中樞神經性疼痛、或混合（周圍或中樞）神經性疼痛。
[0035] 神經性疼痛通常是由神經損傷或疾病引起的，如糖尿病、獲得性免疫缺陷症候群 或癌症，其損傷周圍神經。與組織受損、感覺遲鈍（例如灼燒（burning)、麻刺（tingling))、 以及神經學檢查過程中檢測出的神經受損症況不成比例的疼痛暗示了診斷。神經性疼痛的 一個共同症狀是觸覺性痛覺超敏，其特徵是對正常無害的觸覺刺激的疼痛響應。
[0036] 雖然神經性疼痛響應阿片類藥物，但治療通常用佐劑藥物（例如抗抑鬱藥、抗痙 攣藥、巴氯芬、局部藥物）。
[0037] 疼痛在受傷後能夠進展至任何水平的神經系統，周圍或中樞；可能涉及交感 神經系統（引起交感維持的疼痛）。具體的症狀包括皰疹後神經痛、根性撕脫傷（root avulsions)、疼痛性外傷性單一神經病變（painful traumatic mononeuropathy)、疼痛性 多神經病（特別是由於糖尿病）、中樞性疼痛症候群（由幾乎任何水平的神經系統的任何損 害潛在引起）、術後疼痛症候群（例如乳房切除術後症候群、開胸術後症候群、幻痛）、以及 複雜的局部疼痛症候群（反射交感性營養不良和灼性神經痛）。
[0038] 因此，所述包含糖脂混合物的組合物能夠有利地用於治療和/或預防周圍神經性 疼痛、中樞神經性疼痛、或混合（周圍和中樞）神經性疼痛。特別是，所述包含糖脂混合物 的組合物能夠有利地用於治療和/或預防由糖尿病、獲得性免疫缺陷症候群或癌症引起的 神經性疼痛。
[0039] 發明人進一步顯示了來自顫藍細菌屬的所述糖脂級分在人類支氣管實質組織培 養物中抑制大腸桿菌-LPS誘導的TNF-α釋放（實施例7)。慢性阻塞性肺病（COPD)是細 菌或細菌產物（LPS)引起的慢性炎症。在人類支氣管實質組織培養物中獲得的結果指示 VB3323能夠抑制細菌或細菌產物（LPS)誘導的體內炎症並由此能預防和/或治療C0PD。
[0040] 因此，所述發明中另一個方面是所述包含糖脂的組合物用於治療和/或預防COPD 的用途。
[0041] 慢性阻塞性肺病（COPD)是炎症反應引起的部分可逆的氣流受限。症狀為排痰性 咳嗽（productive cough)和進展多年的呼吸困難。常見症況包括呼吸聲減小、呼吸的呼氣 階段延長、以及哮鳴（wheezing)。通常的治療包括支氣管擴張藥、皮質類固醇、以及（若需 要時）O 2和抗生素。患者中約50%在診斷的10年內死亡。
[0042] coro包括慢性阻塞性支氣管炎和肺氣腫。許多患者兩種特徵都具有。
[0043] 慢性阻塞性支氣管炎是有氣流阻塞的支氣管炎。若氣流阻塞的肺量測定證據進展 了，慢性支氣管炎就變成慢性阻塞性支氣管炎。慢性哮喘性支氣管炎是一種類似的重疊的 症況，其特徵為慢性排痰性咳嗽、哮鳴、以及部分可逆的氣流阻塞；其主要在有哮喘史的吸 煙者中出現。在一些案例中，慢性阻塞性支氣管炎和慢性哮喘性支氣管炎之間的區別尚不 清楚。
[0044] 肺氣腫是肺實質的毀壞，導致彈性回縮的丟失及肺泡隔和徑向氣道牽引（radial airway traction)的丟失,其增加了氣道崩潰的趨勢。隨之而來的是肺充氣過度（Lung hyperinflation)、氣道受限、以及空氣滯留。氣域（Airspaces)擴大並且可能最終發展為 大泡。
[0045] 所述發明由此涉及包含糖脂的組合物，具體是從藍細菌顫藍細菌屬菌種獲得或可 獲得的極性糖脂，其用於治療和/或預防疼痛和/或慢性阻塞性肺病（COPD)。
[0046] 所述發明也涉及治療和/或預防疼痛和/或coro的方法，所述方法包括向需要它 的受試者施用如本申請所述的包含極性糖脂混合物的組合物的步驟。所述組合物具體地以 治療上有效的量來施用。
[0047] 組合物可以包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或其他穩定劑，並可以以任 何適當的路徑施用。具體的施用路徑包括口服、靜脈內（i.v.)、局部施用或通過吸入。 [0048] 如本申請所述製備的包含藍細菌極性糖脂的組合物，顯示了蛋白質汙染水平低於 或等於總重量的2%，具體地顯示了無蛋白質汙染；以及核酸汙染水平低於或等於總重量 的5%，具體為低於或等於總重量的3%，所述組合物對於哺乳動物細胞沒有細胞毒性，如 在細胞系以及分離自人血液的PBMC中的細胞毒性測定法所評估的。所述組合物沒有細胞 毒性，這已在濃度高達100 μ g/ml的體外細胞系統中測試，其為最低有效濃度的100倍高。 在確保患者安全同時，它用於治療和/或預防疼痛和/或COPD的用途能夠因此而預見。
[0049] 此外，發明人顯示了 VB3323慢性治療在弗氏佐劑誘導的慢性炎症小鼠模型中不 誘導任何顯著的體重變化及器官改變（實施例4)，並且在坐骨神經結紮誘導的神經性疼痛 小鼠模型中減少了由慢性疼痛誘導的體重減輕（實施例6)。這些數據進一步支持所述極性 糖脂混合物作為治療化合物（compound)用於治療和/或預防神經性疼痛和/或COro的潛 在用途。
[0050] 所述受試者可以是人或是非人哺乳動物，如貓類（feline)、犬類（canine)、齧齒 類（rodent)、靈長類（primate)、牛類（bovine)、羊類（ovine)或馬。在一些實施方案中，所 述受試者是人，如小孩、女人或男人。
[0051] 如此處所用，術語"治療"（"treatment"或"treating"）表示逆轉、緩解、或 抑制此術語所適用的病症或病況、或這類病症或病況的一個或多個症狀的進展。"預 防"（"prevention"或"preventing"）意為防止此術語所適用的病症或病況、或這類病症 或病況的一個或多個症狀的出現。
[0052] 本領域技術人員可以容易地確定所述來自顫藍細菌屬的極性糖脂在治療上有效 的量。它可以依賴於如受試者的年齡、體重、病況等等。通常，同樣地，所述來自顫藍細菌屬 的極性糖脂在治療上有效的每日劑量可包括〇· 〇lmg-50mg，例如0· lmg-5mg，如0· 3-3mg。
[0053] 包含所述極性糖脂的組合物的特徵
[0054] 專利申請 WO 2010/010172 和 WO 2010/094693 已顯示從 Bluegreen Biotech s. r. I.，via Massena 15, 20125Milano, Italy 以登錄號 No. 1459/45 於 2008 年 7 月 9 日保 藏於藻類和原生動物培養物保藏中心（CCAP, Scotland, United Kingdom)的藍細菌顫藍細 菌屬菌種的細胞通過提取獲得或可獲得的極性糖脂的高純度製備物的特徵為存在至少一 種包含一個或多個鼠李糖單元的高分子量糖脂種類。
[0055] 因此，所述發明中使用的包含糖脂的組合物可從藍細菌顫藍細菌屬菌種，如例如 cyanobacterium Oscillatoria Planktothrix菌種的細胞獲得或可獲得的。這種極性糖脂 的製備物有時在科學文獻中被稱為"CyP"。
[0056] 所述藍細菌顫藍細菌屬菌種可為,例如,任何保藏在藻類和原生動物培養物保藏 中心（CCAP)的顫藍細菌屬菌種，如例如以登錄號No. 1459/45、No. 1459/43、或No. 1459/44 保藏的那些菌株。
[0057] 在一個具體的實施方案中，所述顫藍細菌屬菌種是以以登錄號No. 1459/45保藏 在藻類和原生動物培養物保藏中心（CCAP)的菌種。
[0058] 在另一個具體的實施方案中，所述藍細菌顫藍細菌屬菌種是淡水藍細菌。具體 說，所述藍細菌顫藍細菌屬菌種可以是出現在Lake Varese，Italy中的藍細菌。例如，所 述藍細菌可以是 Oscillatoria Planktothrix FPl 菌種，如 Pomati 等，J. Phycol. 2000 ; 36 : 553-562, Macagno 等，J Exp Med. 2006;203 (6): 1481_92，Jemmett 等，Infect Immun. 2008 ;76 (7) :3156-63,以及Thorgersen等，Mol Immunol. 2008 ;45 (13) :3553-7 中所 述。
[0059] 根據所述發明的糖脂是一種極性糖脂。具體是，包含於所述組合物中的極性糖脂 可以是脂多糖（LPS)。
[0060] 所述包含極性糖脂的組合物可以是，例如，級分、提取物、糖脂混合物、製備物，和/ 或藥物組合物。
[0061] 可用於獲得這種包含來自藍細菌顫藍細菌屬菌種（CyP)的細胞的極性糖脂 的組合物的方法被本領域技術人員所熟知，並且描述於，例如，Yi等，Analyst. 2000 ; 125(4):651-6，Macagno 等，J Exp Med. 2006 ;203 (6):1481_92，Jemmett 等，Infect Immun. 2008 ;76 (7) : 3156-63,以及 Thorgersen 等，Mol Immunol. 2008 ;45 (13) : 3553-7 中。 [0062] 在一個具體的實施方案中，所述極性糖脂可以從藍細菌顫藍細菌屬菌種提取。
[0063] 具體地，所述包含極性糖脂的組合物可為從藍細菌產藍細菌屬通過第一種方法可 獲得的，所述方法包括：
[0064] (a)提供所述藍細菌；
[0065] (b)從所述藍細菌提取極性糖脂；
[0066] (C)沉澱來自步驟（b)的極性糖脂；並且
[0067] (d)純化來自步驟（C)的經提取並沉澱的極性糖脂。
[0068] 在另一個實施方案中，步驟（b)包括用包含促溶劑和非質子有機溶劑如氯仿的變 性溶液的處理。
[0069] 在另一個實施方案中，所述用於獲得包含極性糖脂的組合物的方法包括如下步 驟：
[0070] (i)提供藍細菌的濃縮物，如從培養基通過離心法收集藍細菌後獲得的經冷凍幹 燥的濃縮物；
[0071] (ii)將所述濃縮物懸浮於溶液中；
[0072] (iii)任選地用微波和/或液體/固體分離如通過離心處理，並收集液相（稱為上 清）；
[0073] (iv)將藍細菌的懸浮液或所述上清與包含促溶劑和非質子有機溶劑如氯仿的變 性溶液混合；
[0074] (V)將步驟（iv)獲得的溶液進行溫育；
[0075] (vi)進行液體/液體分離，優選通過離心進行，並收集水性液相；
[0076] (vii)沉澱糖脂級分，例如通過向所述上清添加鹽和有機溶劑如丙酮；
[0077] (viii)將沉澱物重懸於水溶液中；
[0078] (ix)任選地用有機溶劑如異丙醇來處理在（viii)獲得的溶液，離心，並收集液 相，如通過離心進行；並且
[0079] (X)通過離子交換柱並收集包含所述極性糖脂的級分。
[0080] 在另一個具體的實施方案中，所述極性糖脂可以從顫藍細菌屬菌種的培養物制 備，如專利申請WO 2010/094693(其通過本申請中的提述特定地併入）中所述。在這個第 二方法中，細菌的沉澱首先用變性劑處理，如有機溶劑和促溶劑的混合物，例如苯酚和硫氰 酸胍的混合物，以及用去蛋白劑（deproteinizing agents)處理。其過程進一步特徵為用 核酸酶處理直到達到核酸汙染水平低於或等於總重量的5%，如低於或等於總重量的3%， 或低於或等於總重量的2%，以及在截留為30KDa的設備上進行分子分離的步驟，然後是回 收更高分子量的級分。在一個實施方案中，所述包含極性糖脂混合物的組合物顯示蛋白質 汙染水平低於或等於總重量的2%。具體地，所述組合物沒有蛋白質汙染物。
[0081] 具體來說，所述包含極性糖脂的組合物可從藍細菌顫藍細菌屬菌種通過如下方法 獲得或可獲得的，所述方法包括用變性促溶劑提取，用核酸酶處理所述提取物直到達到核 酸汙染水平低於或等於總重量的5%，例如低於或等於總重量的3%，在截留為30KDa的設 備上進行分子分離，然後是回收更高分子量的級分。
[0082] 更精確地說，包含從顫藍細菌屬菌種的培養物獲得的極性糖脂的組合物例如可如 下製備。
[0083] 藍細菌在培養基中，例如 BG-Il 培養基（Sigma-Aldrich, Cat No. C3061)，於 25°C 的溫度和冷白光下以5umol. πΓ2. set1的光強度並且在連續24小時光照方案中生長。在達 到穩定生長期時沉積（sedimented)所述藍細菌培養物，例如通過離心（沉澱）；其沉積物 (或沉澱）可以在提取之前冷凍或冷凍乾燥。在融化或再水化（在冷凍乾燥的情況中）後， 所述沉積物通過如下步驟加工：
[0084] (a)通過稀釋來重懸所述沉澱，如用包含的水溶劑或水的體積1:1-1:2 ;
[0085] (b)獲得含有所述糖脂混合物的細胞提取物（也稱為上清），將所述重懸後的沉 澱如上所述與適當體積的含有變性劑的溶液混合，例如，如Chomczynski P.和Mackey (Bio techniques, 1995, 19(6) :942-5)中所述，例如其包含基於極性質子有機溶劑的試劑，如苯 酚，以及促溶劑（如硫氰酸胍），例如Trireagent? (Sigma Cat. N T3934)或類似的試劑如 Trizol? (Invitrogen)，以及非質子有機溶劑，如氯仿，以約1體積的藍細菌的水性懸液、 2-4體積的提取溶液如約3體積的提取溶液、以及約0. 5-1體積的氯仿的比例，來進行混 合；
[0086] (c)將所述細胞提取物在室溫溫育至少5分鐘或更久，如至少10分鐘但不超過50 分鐘的時長；
[0087] (d)離心，例如以約2000xg，並收集所述含有極性糖脂級分的上清（水相）。這種 上清能通過例如電泳和銀染或通過生物活性測定法來測量，如在LPS存在下在源自單核細 胞/巨噬細胞的THPl細胞系中TNF-α生成的抑制、或對ATP合酶（ATP-SX)的結合或其活 性的抑制。通過（d)中離心所獲得的沉澱能通過添加水或水性緩衝液（以約等於所收集體 積的量）來重提取，然後是再次離心所述樣品。這第二次的上清與此前的上清合併，然後將 匯集的樣品進行進一步的步驟，包括：
[0088] (e)通過添加鹽（例如醋酸鈉（5_20mM最終的））和有機溶劑（如丙酮，例如也以 約2體積的量）來沉澱，然後是在與上述相同的條件下離心，然後是用在水中稀釋的乙醇 (例如70%乙醇）來洗滌沉澱至少1或2次，
[0089] (f)將沉澱重懸於溶液，如緩衝水溶液，如50mM TRIS中，
[0090] (g)通過用內切和/或外切核酸酶（例如DNA酶和RNA酶）來對核酸酶汙染物進 行酶處理，然後是通過用蛋白酶（例如蛋白酶K，例如以lOOyg/ml進行充足時間（在37°C 至少1小時））消化來對蛋白質汙染物進行酶處理。
[0091] 在酶消化後再次離心所述樣品，收集上清,並通過添加鹽（例如醋酸鈉,約IOmM最 終的）和適當體積（例如2體積）的有機溶劑（如丙酮）來進一步沉澱所述上清，再次離 心，然後是在水或含有至少一種表面活性劑（如脫氧膽酸鹽（DOC))並且還含有例如陽離子 表面活性劑如四乙銨的水溶液中重懸所述沉澱；用如（b)節所述的（變性的）提取溶液再 次提取其物質，然後用醋酸鈉/丙酮如上所述進一步沉澱，用70%乙醇洗滌，重懸於水或水 溶液中，並通過使用截留為30kDa的濾器（或其他合適的設備）進行分子分離，從而消除了 通過濾器的物質，並在水或緩衝水溶液中回收滲餘物中的高分子量的糖脂級分，其核酸汙 染水平低於總重量的5%。
[0092] 所述包含極性糖脂的組合物因而可從藍細菌顫藍細菌屬菌種的細胞通過包括變 性促溶劑的方法獲得或可獲得的，其中所述提取步驟如下述步驟（b)中所述進行，核酸酶 處理如下述步驟（g)中所述進行，分子分離如下述步驟（k)中所述進行，並包括進一步的如 下步驟（a)、（c)_f)、e)、（h)_j)和⑴-m):
[0093] (a)用水溶液以包括例如1:1-1:2的體積比重懸藍細菌顫藍細菌屬菌種 (No. 1459/45)的濃縮物，所述濃縮物也任選地為冷凍乾燥濃縮物；
[0094] (b)將藍細菌的懸浮物與2-4體積（例如約3體積）的變性溶液進行混合，所述變 性溶液包含促溶劑、極性質子有機溶劑，如苯酚、以及非質子有機溶劑，如氯仿；
[0095] (c)溫育短於60分鐘的時間；
[0096] ⑷離心並收集液相，稱為上清；
[0097] (e)通過向所述上清添加鹽和有機溶劑（如丙酮）來沉澱糖脂級分，並用經水稀釋 的乙醇來洗滌沉澱物（或沉澱）；
[0098] (f)將沉澱重懸於水溶液，如緩衝溶液中；
[0099] (g)用核酸酶，如內切核酸酶和/或外切核酸酶處理，並且隨後用蛋白酶，如蛋白 酶K處理；
[0100] (h)通過添加鹽和有機溶劑，如丙酮來沉澱糖脂相；
[0101] (i)任選步驟為用經水稀釋的乙醇來洗滌沉澱，並重懸於包含離子表面活性劑 (如脫氧膽酸鈉）以及季銨鹽的水溶液中；
[0102] (j)如步驟（b)-(f)所述從水溶液中再提取；
[0103] (k)在截留為30KDa的設備上進行分子分離；
[0104] (1)用水或緩衝水溶液來回收高分子量極性糖脂級分並評估核酸或蛋白質汙染的 水平；
[0105] (m)回收並使用具有低於總重量5% (例如低於3% )的核酸汙染的級分。
[0106] 如此獲得的糖脂級分的活性能夠通過生物測試和/或通過生化測定法，例如電泳 來測量，所述生物測試基於在產生細胞因子如IL-6、IL-8、TNF-a和/或IL-Ιβ的細胞，例 如THPl中由LPS(來自牙齦卟啉單胞菌（P. gingivalis)或大腸桿菌）誘導的促炎症活性的 抑制。可選擇的是，如此獲得的糖脂級分的活性可例如通過測量其在經工程改造以穩定地 共表達人TLR-4基因和NF-kB可誘導的SEAP報告基因的細胞中對於由LPS誘導的TLR4介 導的NF-kB活性的抑制效果來評估。所述糖脂級分活性也可通過在人類肺實質上進行LPS 溫育後測量其對於TNF-α釋放的抑制效果來觀察，如實施例7中。
[0107] WO 2010/094693進一步描述了根據所述發明的包含糖脂的提取物的分析特徵，所 述提取物通過上述方法獲得。
[0108] 對極性糖脂級分的糖類的分析說明，糖類組分中（視為100% )，鼠李糖通常為 20-40%，葡萄糖（Glc)為20-40%，木糖（Xyl)為5-10%，甘露糖（Man)為3-5%，半乳糖 (Gal)為3-5%，葡糖胺（GlcN)為0.5-1%，半乳糖醛酸（GalA)為1-6%，其中這些糖可為單 糖或更通常地它們為複合糖（complex sugars)和/或糖類衍生物。對於所述糖殘基的定性 和定量分析能通過在用甲醇-鹽酸（HCI lM/MeOH)於80°C將所述糖脂混合物水解20小時， 提取於己烷中，並用吡啶和乙酸酐來乙醯化之後，對乙醯化甲基糖苷（acetylated methyl glycosides)的GC-MS分析來進行；和/或通過在用2M三氟乙酸在120°C處理1小時，然後 是用硼氫化鈉處理1小時，隨後用吡啶和乙酸酐來乙醯化之後獲得的糖醇乙酸酯（alditol acetates)的分析來進行。
[0109] 對所述糖脂混合物中主要糖脂組分的分析性分析顯示了如下的相對組成（重量/ 重量的百分比）：
[0110] -糖類：鼠李糖51%，半乳糖醛酸15%，甘露糖11%，半乳糖11%，木糖4%，葡萄 糖4%，葡糖胺4% ;以及
[0111] -脂肪酸：十八酸，（C 18:0, 55 %);十六酸及3-羥基十六烷酸 (C16:0+C16(30H))，35% ) ;3-羥基^-一烷酸（C15 (30H))，10% )。
[0112] 元素分析顯示存在碳41 %，氫6. 5 %，以及氮4 %。
[0113] 因此，所述極性糖脂特徵在於其包含至少1個單元的鼠李糖或其衍生物，以及特 徵為分子量大於30kDa，例如30-40kDa，如32-34kDa (約33kDa)，所述分子量能夠通過例如 DOC-PAGE然後用銀鹽染色來確定。
[0114] 具體來說，所述發明中的組合物可包含極性糖脂的混合物，其中所述極性糖脂包 含硬脂酸（C18:0,十八酸）和/或棕櫚酸（C16:0,十六酸）作為主要糖脂組分的脂肪酸， 其中它們的至少一種與包含至少一個單元的鼠李糖或其衍生物的糖類有關。
[0115] 這些脂肪酸，例如以它們的飽和形式存在，並且它們通常以各自包含（當總脂質 級分為100)50% -80%硬脂酸和/或15% -40%棕櫚酸的量（分別相對於所述糖脂混合物 的總脂質級分）存在，並且甚至更典型地這些脂肪酸分別以包含的65-75%和20-32%的量 存在。其他脂肪酸鏈可以不超過15%的量存在且通常以不超過10%，例如不多於脂質級分 的5 %的量包含3-羥基十一烷酸或月桂烯酸（或十二烯酸（C12:1))。對脂肪酸的分析可 在用甲醇-鹽酸（HCI lM/MeOH)於80°C將所述化合物水解20小時並在己烷相中作為甲酯 提取後通過GC-MS來進行，如WO 2010/094693中所述。
[0116] 所述糖脂混合物通常沒有磷脂和游離脂質（free lipids)。此外，所述極性糖脂也 可沒有低分子量糖脂如甘油的脂肪酸衍生物（單半乳糖甘油二酯（MGDG)、雙半乳糖甘油二 酯（DGDG)、硫代異鼠李糖醯甘油二酯（SQDG))，這是藍細菌類囊體膜特有的，其分子量通常 低於lkDa。
[0117] 藥物組合物
[0118] 所述化合物的完全水溶性使得以含水性賦形劑和稀釋劑的藥物組合物形式的治 療用途成為可能，所述水性賦形劑和稀釋劑是本領域的專家熟知的，特別是對於液體配製 物。所述糖脂提取物可以在水和非質子溶劑（如DMS0)中稀釋，並且在水溶液中是穩定的。 而且，其也是熱穩定的。
[0119] 因此，所述糖脂可以配製成藥物組合物。根據所述發明的組合物如以包括 0. 1-100 μ g/ml，例如1-50 μ g/ml，如4-20 μ g/ml的濃度包含來自顫藍細菌屬菌種的糖脂 提取物。
[0120] 對於口服，靜脈內（i.v.)和局部施用，對患者施用的每日糖脂提取物劑量通常包 括 0· 01_50mg，例如 0· l_5mg，如 0· 3_3mg。
[0121] 而且，在一個具體的方面，這些組合物包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或 其他活性成分和穩定劑。具體來說，所述糖脂提取物能夠與藥學上可接受的載劑（carrier) 結合，所述載劑適於口服、靜脈內（i.v.)、吸入或局部施用。
[0122] 如本申請所使用的，術語"藥學上可接受的載劑"包含溶劑、分散介質、塗覆物、等 滲劑和吸收延遲劑等，其在對動物或人酌情施用時，不產生不利或其他不良反應。
[0123] 口服劑型包括，例如，固體形式、粘合片劑、生物膜或乳劑（cream)、軟膏劑 (ointment)和糊劑（paste)。在一個實施方案中，形式為片劑，如美國專利No. 5,244,663 中所述的那些。
[0124] 載劑可進一步包括但不限於崩解劑、粘合劑、潤滑劑、調味劑、色素、防腐劑。 合適的崩解劑包括幹澱粉、碳酸I丐、聚氧乙烯山梨聚糖脂肪酸酯（polyoxyethylene sorbitan fatty acid esters)、十二燒基硫酸鈉 （sodium lauryl sulfate)、硬脂酸單 甘油酯（stearic monoglyceride)、乳糖、以及交聯的聚乙烯批咯燒酮（cross-linked polyvinylpyrrolidones)如交聚維酮（crospovidone)(例如 Polyplasdone?. XL，其可 從 GAF 獲取）、交聯的竣甲基纖維素（cross-linked carboxylic methylcelluloses)如 Croscarmelose (例如Ac-di-sol?，其可從FMC獲得），海藻酸，和羧甲基澱粉鈉 （sodium carboxymethyl starches)(例如 Explotab?，其可從 Edward Medell Co.，Inc.獲得）、甲 基纖維素、瓊脂膨潤土（agar bentonite)和海藻酸。粘合劑，若使用的話，為增強粘合的那 些。這些粘合劑的例子包括但不限於澱粉、明膠和糖類如鹿糖、右旋糖（dextrose)、糖蜜、和 乳糖。優選的潤滑劑是硬脂酸酯（鹽）和硬脂酸。
[0125] 乳糖、甘露醇、和Croscarmelose是優選的賦形劑。
[0126] 對於本領域技術人員，可以併入劑型的其他組分是已知的或會是明顯的，參見 Remington:The Science and Practice of Pharmacy,第19版（Mack Publishing, 1995)〇
[0127] 在一個具體的實施方案中，所述藥物組合物是液體形式。
[0128] 對於水性懸液的製備，可採用多種甜味劑和調味劑、著色物質，以及（如果需要的 話）乳化和/或懸浮劑，連同稀釋劑如水、乙醇、丙二醇、甘油及其多種組合。優選為甘油。
[0129] 根據進一步的方面，所述混合物也適於製備用於獸醫用途的所述組合物，有與上 述相同的治療目的。 實施例
[0130] 實施例1 :材料與方法
[0131] VB3323
[0132] VB3323 從 Bluegreen Biotech (Milano, Italy)獲得。VB3323 對應於包含脂多糖 (LPS)的糖脂級分的組合物，所述糖脂級分是從以登錄號No. 1459/45保藏在藻類和原生動 物培養物保藏中心（CCAP)的顫藍細菌屬菌株中提取的。三個不同批次的VB3323的NMR概 貌在圖7中顯不。
[0133] 用於疼痛和COPD的模型
[0134] 實施例1至6中所用的動物模型為本領域中所熟知。實驗用標準步驟進行。坐骨 神經結紮小鼠模型和傷害性測試在下文進一步描述。實施例7和8中使用的細胞模型在相 應的實施例中描述。
[0135] 坐骨神經結紮
[0136] 重量為28 ± 3g的C57BL/6N，Cr I BR小鼠（野生型）用戊巴比妥鈉（65mg/kg，腹 腔注射（i. P.))進行麻醉並進行手術程序。簡言之，將總坐骨神經暴露於大腿中部以及坐 骨神經三根分叉部近端，用4根結紮線鬆弛地繞其打結，留下Imm的間隙從而保留神經弓上 的循環（epineural circulation)。在小鼠中，將結紮線打結直至看到各條後肢短暫顫搐。 用假的動物（坐骨神經暴露而無結紮線）作為對照。
[0137] 傷害性測試
[0138] 根據 Hargreave 法（足底測試），使用特定的儀器（Ugo Basile, Varese, Italy), 通過記錄對福射熱刺激的縮爪潛伏期（paw withdrawal latencies)來評估熱痛覺過敏 (Hargreaves等，1988)。將動物置於玻璃平臺上的乾淨丙烯酸類的盒中，並允許其適應環 境。通過平臺將強度恆定的福射加熱源應用於後爪的妬面（plantar surface)。通過檢測 縮爪並顯示潛伏期秒數的光電管來記錄對刺激的反應。於CFA注射後7和14天（最後一 次藥物處理後24小時）在之前注射的和對側後爪中評估熱痛覺過敏，或在CCI模型中在不 同的時間進行評估。
[0139] 根據von Frey (Villetti等，2003)所述的方法，使用測量對機械性刺激的反應的 儀器（足底觸覺計，Ugo Basile, Italy)來評估機械性痛覺超敏。簡言之，將小鼠放置在金 屬網桌上並在適應環境後將電子針以漸增的機械力（50g在20秒時間中）向蹠足表面推壓 直到小鼠縮爪。通過在FCA注射後7和14天（最後一次藥物處理後24小時）在之前注射 的和對側後爪中測量縮回的閾值（按克計）來評估機械性痛覺超敏，或對於CCI模型在不 同的時間評估。
[0140] 實施例2 :VB3323在FCA處理的小鼠中強力地且劑量依賴性地減少熱痛覺過敏和 機械性痛覺超敏
[0141] 足底內（intraplantar)注射弗氏完全佐劑（FCA)後14天，小鼠在FCA處理的爪 中在熱縮回潛伏期和機械性痛覺超敏閾值方面顯示顯著的下降（約50% )。
[0142] 在施用FCA後第14天口服VB3323(30和100mg/kg)，在VB3323的施用後2小時 (恢復28和67% )和6小時（分別恢復15%和69% )顯著且劑量依賴性地抑制機械性 痛覺超敏。在同一個實驗中，VB3323在2小時（恢復19和80% )和6小時（恢復39%和 38% )顯示對於熱痛覺過敏的活性。與100mg/kg劑量類似，VB3323以10mg/kg腹腔注射 (ip)能夠減少機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏。
[0143] 實施例3 :VB3323以30mg/kg慢性治療顯著減少機械性痛覺超敏
[0144] 在用足底內弗氏完全佐劑（FCA)處理的小鼠中，用VB3323慢性口服治療（30mg/ kg，7天），在施用FCA後第14天顯著減少機械性痛覺超敏（59%恢復）。此效果在最後一 次VB3323處理後24小時評估。
[0145] 實施例4 :通過總體形態學評估，VB3323慢性治療不誘導任何顯著的體重變化和 器官改變
[0146] 從VB3323處理開始每日監測小鼠體重。在最後一次VB3323處理後24小時處死 的動物中評估通過總體形態學評估的器官改變和脾重量。
[0147] VB3323慢性治療不誘導任何上述參數的變化。
[0148] 實施例5 :VB3323顯著減少機械性痛覺超敏和熱痛覺過敏
[0149] 在坐骨神經的慢性壓縮（constriction)損傷（一種慢性神經性疼痛的模型）後 14天，小鼠在結紮的爪中在熱縮回潛伏期和機械性痛覺超敏閾值方面顯示顯著的下降（約 50% )。口服VB3323(10和30mg/kg/天，8天）在其最後一次施用2h時顯著地抑制痛覺超 敏（恢復45%和50% )和熱痛覺過敏（恢復42%和43% )。
[0150] 在這個模型中VB3323在單施用後對痛覺超敏沒有效果，並且其對熱痛覺過敏效 果不足。VB3323在重複施用後活性明顯，表明了重要的治療活性。
[0151] 實施例6 :VB3323慢性治療減少了由慢性疼痛誘導的體重減輕
[0152] 由坐骨神經結紮引起的神經性疼痛誘導了小鼠體重的減少（從基礎體重的Λ % 為約4)。
[0153] VB3323慢性治療（10和30mg/kg/天，8天）減少了慢性疼痛誘導的體重減輕。
[0154] -並考慮，實施例1至6的結果證明了 VB3323能夠治療疼痛，並具體為神經性和 /或慢性疼痛。
[0155] 實施例7 :VB3323在人支氣管實質中抑制LPS誘導的TNF α釋放
[0156] 人實質肺組織是從San Gerardo Hospital, Monza, Italy的經受癌瘤切除術的患 者獲得的。患者沒有接受放療或以類固醇、阿片類或化療的慢性治療。所有實質組織的樣本 是從遠離腫瘤的位點獲得的。研究經San Gerardo Hospital Monza Italy制度倫理委員 會批准，並且所有志願者給出了知情同意。在用Kreb's緩衝液（(nM組成：NaCl 118. 4, KCl 4. 7, CaCl22. 5, KH2PO4L 2, NaHC0325,葡萄糖11. 7)數次洗滌過程中，將切下的肺組織上的腫 瘤、大的氣道、胸膜和可見的血管切除，並用解剖剪精細地切成2_碎片。六個外植塊（總 重量約30mg)在培養生物反應器（Synthecon/NASA USA)中用包含1%青黴素、1%鏈黴素、 以及1%慶大黴素的1?^1-164培養基在371：在5%二氧化碳/空氣中溫育16小時。然後 或是用l〇〇ng/ml LPS(Sigma-Aldrich)來刺激組織，或是單獨在細胞培養基中將組織維持 4小時。為了中和TNF，在用100ng/ml LPS刺激之前，用0. 01、0. 1、或ΙμΜ的VB3323將組 織溫育1小時。收穫肺組織碎片及上清並均儲存於_80°C直至分析。稱量所述組織碎片以 確定總組織重量而將釋放的細胞因子水平標準化（normalize)。上清中TNFa的水平通過 酶聯免疫吸附測定法（ELISA)和按組織重量校正的濃度來測量。人TNF-特異性的ELISA試 劑盒（檢測極限為〇.2pg/mg的組織）購自Pirce，對於每個ELISA都遵從製造商的規程。
[0157] VB3323,在人類支氣管實質組織培養物中（IC50為0. ΙμΜ)濃度依賴性地 (0. 01，0. 1，或1 μ Μ)抑制由大腸桿菌-LPS誘導的TNF α的釋放。與同濃度的參考標準的 地塞米松（69% )相比，VB3323在1 μ M時更為強力（89% )地抑制TNFa釋放。
[0158] 地塞米松是用於在人中治療COPD的藥物。此處，發明人發現VB3323比地塞米松 更為強力。因此，VB3323是一種非常有前途的治療COPD的藥物。
[0159] 實施例8 :VB3323在小鼠支氣管實質中抑制LPS誘導的TNF a釋放
[0160] 所述動物（BALB/c雄性小鼠，體重20_22g)用頸脫位法處死。打開胸廓切斷肋骨。 用手術鑷夾住心臟，用手術剪將肺和心臟從胸腔切下，並放進冷的Krebs溶液（nM組成： 似(：1118.4，1((：14.7，〇&(：1 22.5，腿2?041.2，似!1(：0325，葡萄糖11.7)。大的氣道和可見的血 管被切下。將肺分為30mg的碎片（約5片/小鼠）並用解剖刀精細地切碎（六片，每個碎 片約2mm 3)。六個外植體（總重量30mg)在24孔板的每個孔（2. Ocm2)用Iml的RPMI-1640 基質（RPMI-1640+抗菌抗真菌溶液lOOx，Sigma-Aldrich)在37°C在5%二氧化碳/空氣溫 育16小時。然後所述基質用新鮮基質替換，並用化合物處理組織1小時。在1小時後，用 100ng/ml LPS大腸桿菌055:B5(Sigma-Aldrich)來刺激組織。LPS刺激4小時後，收穫上清 並儲存在_80°C直至ELISA分析。六個外植體中的三個在10%福馬林緩衝液中固定以用 於組織學/免疫組化分析。另外三個組織外植體置於RNA保存緩衝液（RNA-later buffer) 中過夜，然後儲存在_80°C。
[0161] 小鼠 TNF特異的ELISA試劑盒（檢測極限為0· 2pg/mg的組織）購自Pirce，對於 每個ELISA都遵從製造商的規程。
[0162] VB3323在ΙμΜ時在小鼠支氣管實質組織培養物中抑制由大腸桿菌LPS誘導的 TNFa釋放。68%的活性與同濃度的參考標準的地塞米松的活性（67% )相似。
[0163] 所述實驗確認了 VB3323是一種非常有前途的治療COPD的藥物。
[0164] 實施例9 : 口服VB3323的對小鼠中COro模型的效果
[0165] 組合的香菸煙霧/臭氧暴露：
[0166] 使用的動物為Balb/CBYJ小鼠（雌性，15-17周齡）。將動物暴露於香菸煙霧和 臭氧的組合。簡言之，在第一次對香菸煙霧（CS)適應3天後，將4種研究香菸的主流煙霧 (2R4F)和臭氧（O 3)與I. 7LPM(升/分鐘的空氣）稀釋空氣混合，並將動物暴露於CS+0320 分鐘。在這之後是1小時的恢復期。此步驟再重複2次（每日總暴露為1小時）。05+0 3暴 露的總持續期為14天。
[0167] 動物的處理：
[0168] 在整個暴露期間將動物進行處理（CS適應及CS+03暴露）。每天在第一次CS或 CS+03暴露前1小時給予VB3323 (10mg/kg/天）。假的（未處理的）和CS+03對照的動物用 空介質（vehicle)處理。
[0169] 測量參數：
[0170] 測量了不同的參數：
[0171] -每日測量體重變化。
[0172] -實現肺功能檢查（Buxco)以在最後一次CS+03暴露後18-24小時測量靜態和動態 的肺功能（FRC (功能餘氣量））、TLC (總肺活量）、FEV2(I/FVC ([20秒內用力呼氣體積]/ [用 力呼氣值])
[0173] -通過在最後一次CS+03暴露後5小時進行支氣管肺泡灌洗來測量肺炎。評估總 細胞數和中性粒細胞數。
[0174] 結果：
[0175] 在圖8中，TLR4拮抗劑VB3323處理顯示了對05+03暴露誘導的體重減少僅輕微但 顯著的效力。
[0176] 在圖9中，TLR4拮抗劑VB3323處理顯著改善了 CS+03暴露誘導的肺水腫。
[0177] 進行了其他實驗並顯示用TLR4拮抗劑處理對於靜態和動態的肺功能參數沒有效 力，這對於肺氣腫/肺充氣過度和氣道阻塞是預測性的。
[0178] 口服施用TLR4拮抗劑VB3323(每天10mg/kg，2周）引起香菸煙霧/臭氧誘導的 體重減輕的輕度減少，並顯著改善CS+0 3暴露誘導的肺水腫。
[0179] 口服施用VB3323對於在支氣管肺泡灌洗流體中評估的CS+03誘導的氣道發炎是 無效的。這個結果可通過低劑量測試的和/或VBR322通過口服施用而非通過吸入的事實 來解釋。
【權利要求】
1. 一種包含極性糖脂的組合物，所述極性糖脂可從藍細菌顫藍細菌屬菌種 (cyanobacterium Oscillatoria species, CyP)的細胞獲得，所述組合物用於治療和/或預 防疼痛和 / 或慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmonary Disease, COPD)。
2. 根據權利要求I的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂是脂多糖（LPS)。
3. 根據權利要求1或2的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂是從藍細菌顫藍 細菌屬菌種中提取的。
4. 根據權利要求1至3任一項的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂可從藍細 菌顫藍細菌屬菌種通過如下方法獲得，所述方法包括： (a) 提供所述藍細菌； (b) 從所述藍細菌提取極性糖脂； (c) 沉澱步驟（b)的極性糖脂；並且 (d) 純化步驟（c)的經提取並沉澱的極性糖脂。
5. 根據權利要求4的用於所述用途的組合物，其中步驟（b)包括用包含促溶劑和非質 子有機溶劑如氯仿的變性溶液的處理。
6. 根據權利要求1至5任一項的用於所述用途的組合物，其中所述方法包括如下步 驟： (i) 提供藍細菌的濃縮物，如通過離心從培養基收集藍細菌後獲取的經冷凍乾燥的濃 縮物； (ii) 將所述濃縮物懸浮於溶液中； (iii) 任選地用微波和/或液體/固體分離如通過離心處理，並收集液相（稱為上 清）； (iv) 將藍細菌的懸浮液或所述上清與包含促溶劑和非質子有機溶劑如氯仿的變性溶 液混合； (V)將步驟（iv)獲得的溶液進行溫育； (vi) 進行液體/液體分離，優選通過離心並收集水性液相； (vii) 沉澱糖脂級分，例如通過向所述上清添加鹽和有機溶劑如丙酮； (viii) 將沉澱物重懸於水溶液中； (ix) 任選地用有機溶劑如異丙醇來處理在（viii)獲得的溶液，離心，並收集液相，優 選通過離心進行；並且 (X)通過離子交換柱並收集包含所述極性糖脂的級分。
7. 根據權利要求1至3任一項的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂可從藍細 菌顫藍細菌屬菌種通過如下方法獲得，所述方法包括用變性促溶劑提取，用核酸酶處理所 述提取物直到核酸汙染水平低於或等於總重量的5%，在截留為30KDa的設備上進行分子 分離，然後是回收更高分子量的級分。
8. 根據權利要求7的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，其可從藍細菌顫藍細菌 屬菌種的細胞通過包括用變性促溶劑提取的方法來獲得，其中所述提取步驟是如下述步驟 (b)所述進行，核酸酶處理是如下述步驟（g)所述進行，分子分離是如下述步驟（k)所述進 行，並包括進一步的下述步驟（a)、（c)-(f)、（h)-(j)和（l)-(m): (a)用水溶液懸浮藍細菌顫藍細菌屬菌種的濃縮物，任選地為冷凍乾燥濃縮物，其體積 比優選包含1:1-1:2 ; (b) 將藍細菌的懸浮物與2-4體積（優選約3體積）的變性溶液進行混合，所述變性溶 液包含促溶劑、極性質子有機溶劑（優選苯酚）、以及非質子有機溶劑如氯仿； (c) 溫育短於60分鐘的時間； (d) 離心並收集液相，稱為上清； (e) 通過向所述上清添加鹽和有機溶劑（優選丙酮）來沉澱糖脂級分，並用水稀釋過的 乙醇來洗滌沉澱物（或沉澱）； (f) 將沉澱重懸於水溶液中，優選緩衝的水溶液； (g) 用核酸酶處理，優選內切核酸酶和/或外切核酸酶，並且隨後用蛋白酶，優選蛋白 酶K處理； (h) 通過添加鹽和有機溶劑，優選丙酮來沉澱糖脂相； (i) 任選地用水稀釋過的乙醇來洗滌沉澱，並重懸於包含離子表面活性劑，優選脫氧膽 酸鈉，以及季銨鹽的水溶液中； (j) 如步驟（b)-(f)所述從所述水溶液中重新提取； (k) 在截留為30KDa的設備上進行分子分尚； (l) 用水或緩衝的水溶液來回收高分子量極性糖脂級分並評估核酸或蛋白質汙染的水 平； (m) 回收並使用具有低於總重量5%的核酸汙染的級分。
9. 根據權利要求1至7任一項的用於所述用途的組合物，其中所述組合物包含極性糖 脂的混合物，所述混合物包含硬脂酸（C18:0,十八酸）和/或棕櫚酸（C16:0,十六酸）作 為主要糖脂組分的脂肪酸，其中它們的至少一種與包含至少一個單元的鼠李糖或其衍生物 的糖類有關。
10. 根據權利要求9的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂的混合物包含相對 於所述糖脂混合物的總脂質級分50%-80%的硬脂酸（C18:0,十八酸）和/或15%-40% 的棕櫚酸（C16:0,十六酸）。
11. 根據權利要求9或10的用於所述用途的組合物，其中所述極性糖脂的混合物包含 了相對於所述糖脂混合物的總脂質級分65-75%的硬脂酸（C18:0,十八酸）和/或20-32% 的棕櫚酸（C16:0,十六酸）。
12. 根據權利要求1至11任一項的用於所述用途的組合物，其中所述藍細菌顫藍 細菌屬菌種是以登錄號No. 1459/45保藏在藻類和原生動物培養物保藏中心（Culture Collection of Algae and Protozoa, CCAP)的顫藍細菌屬菌種。
13. 根據權利要求I至12任一項的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，用於治療 和/或預防疼痛。
14. 根據權利要求13的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，用於治療和/或預防 神經性疼痛。
15. 根據權利要求13的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，用於治療和/或預防 周圍神經性疼痛、中樞神經性疼痛、或混合（周圍和中樞）神經性疼痛。
16. 根據權利要求13的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，用於治療和/或預防 由糖尿病、獲得性免疫缺陷症候群或癌症引起的神經性疼痛。
17. 根據權利要求1至12任一項的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，用於治療 和 / 或預防慢性阻塞性肺病（chronic obstructive pulmonary disease, COPD)。
18. 根據權利要求I至17任一項的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，其中所述 組合物進一步包含藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑和/或其他穩定劑。
19. 根據權利要求1至18任一項的用於所述用途的包含極性糖脂的組合物，其中所述 組合物用於口服、靜脈內（i.v.)、通過吸入或局部施用。
【文檔編號】C12P19/04GK104321066SQ201380026466
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月13日 優先權日:2012年3月21日
【發明者】T·克洛西, F·瓜格尼尼, E·扎裡尼 申請人:賽諾菲