利用腸桿菌科的菌株生產L－胺基酸的方法,該菌株過表達編碼半乳糖質子同向轉運蛋白...的製作方法

2023-08-03 13:44:01

專利名稱：利用腸桿菌科的菌株生產L－胺基酸的方法,該菌株過表達編碼半乳糖質子同向轉運蛋白 ...的製作方法
技術領域：
本發明提供一種利用過表達galP基因的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)的菌株生產L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸，的方法。
背景技術：
L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸，用於人類醫學，和用於製藥工業、食品工業和特別是動物營養。
已知可以通過發酵腸桿菌科的菌株，尤其是大腸桿菌(E.coli)和粘質沙雷氏菌(Serratia marcescens)，來製備L-胺基酸。由於其極為重要，因此不斷地努力改進生產方法。方法的改進可能涉及比如攪拌和供氧這樣的發酵工程措施，或涉及比如發酵過程中的糖濃度這樣的營養培養基組成，或涉及通過例如離子交換層析來逐步形成產物形式，或涉及微生物自身的內在生產性能。
利用誘變、選擇和突變體選擇的方法來改進這些微生物的生產性能。用這種方法，獲得了對於比如蘇氨酸類似物α-氨基-β-羥基戊酸(AHV)這樣的抗代謝物有抗性，或者是對重要的調控代謝物為營養缺陷型，且能生產比如L-蘇氨酸這樣的L-胺基酸的菌株。
一段時間以來，通過擴增單個胺基酸生物合成基因並測試其對生產的效應，已經將重組DNA遺傳工程方法用於對生產L-胺基酸的腸桿菌科的菌株進行菌株改良。可以在Neidhardt(編者)Escherichiacoli and Salmonella，Cellular and Molecular Biology，第二版，ASM Press，Washington，D.C.，USA，(1996)中找到涉及大腸桿菌和沙門氏菌屬(Salmonella)細胞生物學和分子生物學的信息的概述。
發明目的本發明人設立的目的是提供用於改進的L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸的發酵生產的新措施。
發明概述本發明提供，利用來自腸桿菌科的微生物，尤其是那些已能生產L-胺基酸且其中編碼galP基因的核苷酸序列過表達的微生物，來發酵生產L-胺基酸尤其是L-蘇氨酸的方法。
發明詳述galP基因編碼的基因產物在現有技術中已知為，尤其是「半乳糖質子同向轉運蛋白」或「半乳糖通透酶」。
通常，將由核苷酸序列，即基因或等位基因所編碼的蛋白質，或所編碼的核糖核酸稱作基因產物。
等位基因通常理解為給定的基因的替代形式。這些形式的特徵在於核苷酸序列中的差異。
以下提到L-胺基酸或胺基酸的任何地方，都意指選自如下的一或多種胺基酸，包括它們的鹽L-天冬醯胺、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、L-穀氨酸、L-甘氨酸、L-丙氨酸、L-半胱氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-異亮氨酸、L-亮氨酸、L-酪氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-賴氨酸、L-色氨酸和L-精氨酸。特別優選L-蘇氨酸。
本文中，用語「過表達」描述，通過例如將基因的拷貝數提高至少一個(1)拷貝或使用強啟動子以及可選地將這些方法相結合，導致微生物中由相應DNA編碼的一或多種酶或蛋白質的細胞內活性或濃度的提高。
調節過表達這一方法通常使相應蛋白質的活性或濃度相對於野生型蛋白質或起始微生物中的蛋白質活性或濃度提高至少10％、25％、50％、75％、100％、150％、200％、300％、400％或500％，最多提高至1000％或2000％。起始微生物或親本菌株理解為將對其實施本發明方法的微生物。
本發明提供通過發酵來自腸桿菌科的重組微生物來生產L-胺基酸的方法，其特徵在於a)在使培養基或細胞中富集所希望的L-胺基酸的條件下，於培養基中培養產生所希望的L-胺基酸的微生物，該微生物中galP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達的，和b)分離所希望的L-胺基酸，其中所有或部分(≥0至100％)發酵液體培養基組分和/或生物質可選地保留在所分離的產物中或者被完全除去。
這些同樣由本發明提供的(尤其是重組的)微生物，能夠從葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜，可選地從澱粉，可選地從纖維素或從甘油和乙醇生產L-胺基酸。它們是選自埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、普羅威登斯菌屬(Providencia)和沙雷氏菌屬(Serratia)的腸桿菌科的代表。埃希氏菌屬和沙雷氏菌屬是優選的。對於埃希氏菌屬，特別提到大腸桿菌，對於沙雷氏菌屬，特別提到粘質沙雷氏菌。
通常通過利用含有所希望的基因的載體進行轉化、轉導或結合來製備重組微生物。
埃希氏菌屬中的適宜菌株，尤其是那些生產L-蘇氨酸的菌株，特別是大腸桿菌的菌株，例如是-大腸桿菌H4581 (EP-A 0 301 572)-大腸桿菌KY10935 (Bioscience Biotechnologyand Biochemistry 61(11)1877-1882(1997)-大腸桿菌VNIIgenetika MG442 (US-A-4278,765)-大腸桿菌VNIIgenetika M1 (US-A-4,321,325)-大腸桿菌VNIIgenetika 472T23 (US-A-5,631,157)-大腸桿菌BKIIM B-3996(US-A-5,175,107)-大腸桿菌kat 13 (WO98/04715)-大腸桿菌KCCM-10132 (WO00/09660)沙雷氏菌屬中的適宜菌株，尤其是那些生產L-蘇氨酸的菌株，特別是粘質沙雷氏菌的菌株，例如是-粘質沙雷氏菌HNr21 (Applied and EnvironmentalMicrobiology38(6)1045-1051(1979))-粘質沙雷氏菌TLr156 (Gene57(2-3)151-158(1987))-粘質沙雷氏菌T-2000 (Applied Biochemistry andBiotechnology 37(3)255-265(1992))來自腸桿菌科的生產L-蘇氨酸的菌株優選具有，尤其是一種或多種選自以下的遺傳或表型特徵α-氨基-β-羥基戊酸抗性，硫代賴氨酸抗性，乙硫氨酸抗性，α-甲基絲氨酸抗性，二氨基琥珀酸抗性，α-氨基丁酸抗性，疏螺旋體素抗性，環戊烷甲酸抗性，利福平抗性，對於例如纈氨酸異羥肟酸鹽(Valinehydroxamate)這樣的纈氨酸類似物的抗性，對於例如6-二甲基-氨基嘌呤這樣的嘌呤類似物的抗性，需要L-甲硫氨酸，可選地部分且可補償地需要L-異亮氨酸，需要中二氨基庚二酸，對含有蘇氨酸的二肽為營養缺陷，L-蘇氨酸抗性，蘇氨酸精煉物抗性，L-高絲氨酸抗性，L-賴氨酸抗性，L-甲硫氨酸抗性，L-穀氨酸抗性，L-天冬氨酸抗性，L-亮氨酸抗性，L-苯丙氨酸抗性，L-絲氨酸抗性，L-半胱氨酸抗性，L-纈氨酸抗性，對氟代丙酮酸的敏感性，缺陷的蘇氨酸脫氫酶，可選地能夠利用蔗糖，蘇氨酸操縱子過表達，高絲氨酸脫氫酶I-天冬氨酸激酶I過表達(優選為反饋抗性形式)，高絲氨酸激酶過表達，蘇氨酸合酶過表達，天冬氨酸激酶過表達(可選地為反饋抗性形式)，天冬氨酸半醛脫氫酶過表達，磷酸烯醇丙酮酸羧化酶過表達(可選地為反饋抗性形式)，磷酸烯醇丙酮酸合酶過表達，轉氫酶過表達，RhtB基因產物過表達，RhtC基因產物過表達，YfiK基因產物過表達，丙酮酸羧化酶過表達，乙酸形成減少。
人們發現，過表達galP基因後，腸桿菌科的微生物以改良的方式生產L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸。
來自大腸桿菌的該基因的核苷酸序列是現有技術的部分，且可以從由Blattner等人公開的大腸桿菌基因組序列獲得(Science 2771453-1462(1997))。
尤其是利用以下信息來描述galP基因名稱糖類轉運蛋白，半乳糖質子同向轉運蛋白功能作為膜整合蛋白，將2-脫氧-D-半乳糖和質子和一個質子同向轉運進細胞參考文獻Macpherson等人；The Journal of BiologicalChemistry258(7)4390-4396(1983)，Venter等人；The Biochemical Journal 363(Pt2)243-252(2002)登錄號 AE000377鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)中的半乳糖通透酶尤其描述於以下參考文獻中Postma PW；Journal of Bacteriology 129(2)630-639(1977)；Nagelkerke和Postma；Journal of Bacteriology 133(2)607-613(1978)。
核酸序列可以從國家醫學圖書館(Bethesda，MD，USA)的國家生物技術信息中心(NCBI)的資料庫、歐洲分子生物學實驗室(EMBL，Heidelberg，Germany和Cambridge，UK)的核苷酸序列資料庫或日本的DNA資料庫(DDBJ，Mishima，Japan)獲得。
為更加清楚的描述，大腸桿菌galP基因的核苷酸序列示為SEQ IDNO3，由該基因編碼的半乳糖質子同向轉運蛋白的胺基酸序列示為SEQ ID NO4。
根據本發明可以使用在所引用的參考文獻中描述的基因。此外，可以使用通過遺傳密碼簡併或功能中性有義突變製得的這些基因的等位基因。優選使用內源基因。
「內源基因」或「內源核苷酸序列」理解為存在於某一物種群體中的基因或等位基因或核苷酸序列。
含有功能中性有義突變的等位基因包括那些在由其編碼的蛋白質中導致至少一個保守胺基酸交換的等位基因。
對於芳香族胺基酸，保守交換是指苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸相互取代。對於疏水胺基酸，保守交換是指亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸相互取代。對於極性胺基酸，保守交換是指穀氨醯胺和天冬醯胺相互取代。對於鹼性胺基酸，保守交換是指精氨酸、賴氨酸和組氨酸相互取代。對於酸性胺基酸，保守交換是指天冬氨酸和穀氨酸相互取代。對於含羥基的胺基酸，保守交換是指絲氨酸和蘇氨酸相互取代。
同樣，可以使用那些編碼所提及的蛋白質的變體的核苷酸序列，這些蛋白質變體在N-或C-末端另外加長或縮短了至少一個(1)胺基酸。這一延長或縮短不超過50、40、30、20、10、5、3或2個胺基酸或胺基酸基團。
為了產生過表達，例如可以提高相應基因的拷貝數，或者可以使位於結構基因上遊的啟動子和調控區域或核糖體結合位點發生突變。整合在結構基因上遊的表達盒以同樣的方式起作用。可以使用的啟動子尤其包括已知名為lac和trp啟動子的大腸桿菌乳糖和色氨酸操縱子的啟動子。包含在lac啟動子的-10區域和trp啟動子的-35區域內的雜合啟動子是tac啟動子(DeBoer等人；Proceedings of theNational Academy of Sciences of the United States of America8021-25(1983))。其它可以使用的啟動子是λ噬菌體的左向PL啟動子和T7噬菌體啟動子，它們與已經提到的lac、trp和tac啟動子起作用的方式一樣與阻遏蛋白相互作用，其中轉錄克隆的基因可以被特異性地開啟或關閉。通過利用可誘導啟動子，還有可能提高L-蘇氨酸發酵生產過程中的表達。還可以通過採用延長m-RNA壽命的措施來提高表達。此外，還通過防止酶蛋白質的降解來提高酶活性。基因或基因構建體可以以不同拷貝數存在於質粒中，或在染色體中整合併擴增。此外，作為選擇，可以通過改變培養基組成和培養管理來實現相關基因的過表達。
本領域技術人員，尤其可以在Chang和Cohen(Journal ofBacteriology 1341141-1156(1978))、Hartley和Gregori(Gene13347-353(1981))、Amann和Brosius(Gene40183-190(1985))、de Broer等人(Proceedings of the National Academy of Sciencesof the United States of America 8021-25(1983))、LaVallie等人(BIO/TECHNOLOGY 11187-193(1993))、WO98/04715、Llosa等人(Plasmid26222-224(1991))、Quandt和Klipp(Gene 80161-169(1989))、Hamilton等人(Journal of Bacteriology 1714617-4622(1989))、Jensen和Hammer(Biotechnology andBioengineering 58191-195(1998))以及熟知的有關遺傳學和分子生物學的教科書中找到與此有關的指導。
可以使用可在腸桿菌科細菌中複製的質粒載體，比如源自pACYC184的克隆載體(Bartolomé等人；Gene10275-78(1991))、pTrc99A(Amann等人；Gene69301-315(1988))或pSC101-衍生物(Vocke和Bastia；Proceedings of the National Academy ofSciences USA 80(21)6557-6561(1983))。在本發明的方法中，可以使用用質粒載體轉化了的菌株，其中質粒載體包含至少一個編碼galP基因的核苷酸序列。
表達轉化理解為宿主(微生物)接受一種分離的核酸。
還有可能通過序列交換(Hamilton等人；Journal ofBacteriology 1714617-4622(1989))、結合或轉導來轉換不同菌株中影響特定基因表達的突變。
對遺傳學和分子生物學中所使用的這些概念的更詳細的說明可以在熟知的遺傳性和分子生物學教科書中獲得，比如Birge的教科書(Bacterial and Bacteriophage Genetics，第4版，Springer Verlag，New York(USA)，2000)，或Berg、Tymoczko和Stryer的教科書(Biochemistry，第五版，Freeman and Company，New York(USA)，2002)，或Sambrook等人的手冊(Molecular Cloning，ALaboratoryManual，(3卷套)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor(USA)，2001)。
此外，利用這樣的腸桿菌科的菌株，即該菌株除了過表達galP基因之外還過表達一種或多種在熟知的蘇氨酸生物合成途徑中的酶或anoplerotic代謝中的酶，或產生還原型煙醯胺腺嘌呤二核苷酸磷酸的酶，或糖酵解中的酶，或PTS酶，或硫代謝中的酶，對於生產L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的。通常優選利用內源基因。
因此，可以同時過表達，例如一或多種選自以下的基因·編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶(US-A-4,278,765)的thrABC操縱子，·來自穀氨酸棒桿菌(Corynebacterium glutamicum)的、編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因(WO99/18228)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因(Molecular andGeneral Genetics 231(2)332-336(1992))，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因(Gene31279-283(1984))，·編碼轉氫酶的pntA和pntB基因(European Journal ofBiochemistry 158647-653(1986))，·賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因(EP-A-0 994 190)，·編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因(WO02/06459)，·賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因(EP-A-1 013 765)，·來自穀氨酸棒桿菌的、編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因(WO01/92545)，·編碼穀氨酸脫氫酶的gdhA基因(Nucleic Acids Research115257-5266(1983)；Gene 23199-209(1983))，·編碼葡糖激酶的glk基因(Journal of Bacteriology 1791298-1306(1997)，·編碼DNA結合蛋白HLP-II的hns基因(WO03/004671)，·編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因(WO03/004598)，·編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因(WO03/004664)，·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉移酶系統PTS中的磷酸組氨酸蛋白己醣磷酸轉移酶的ptsH基因(WO03/004674)，
·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉移酶系統PTS中的酶I的ptsI基因(WO03/004674)，·來自ptsHIcrr操縱子的、編碼磷酸轉移酶系統PTS中的葡萄糖-特異性IIA組分的crr基因(WO03/004674)，·編碼葡萄糖-特異性IIBC組分的ptsG基因(WO03/004670)，·編碼亮氨酸調節子中的調控蛋白的lrp基因(WO03/004665)，·編碼全局調控蛋白Csr的csrA基因(Journal ofBacteriology 1754744-4755(1993)，·編碼fad調節子中的調控蛋白的fadR基因(Nucleic AcidsResearch 167995-8009(1988))，·編碼中央中間代謝中的調控蛋白的iclR基因(Journal ofBacteriology 1722642-2649(1990))，·編碼10KDa陪伴蛋白的mopB基因(WO03/004669)，已知其名稱還為groES，·來自ahpCF操縱子的、編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因(WO03/004663)，·來自ahpCF操縱子的、編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因(WO03/004663)，·編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因(WO03/006666)，·編碼cys調節子中的調控蛋白的cysB基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的黃素蛋白的cysJ基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的血蛋白的cysI基因(WO03/006666)，·來自cysJIH操縱子的、編碼腺苷醯硫酸還原酶的cysH基因(WO03/006666)，·來自phoBR操縱子的、編碼pho調節子中的正調控蛋白PhoB的phoB基因(WO03/008606)，·來自phoBR操縱子的、編碼pho調節子中的傳感蛋白的phoR基因(WO03/008606)，·編碼細胞外膜中的E蛋白的phoE基因(WO03/008608)，·編碼受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因(WO03/008609)，·編碼6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因(WO03/008610)，·編碼麥芽糖轉運中的周質結合蛋白的malE基因(WO03/008605)，·編碼超氧化物歧化酶的sodA基因(WO03/008613)，·來自rseABC操縱子的、編碼具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因(WO03/008612)，·來自rseABC操縱子的、編碼σE因子中的全局調控蛋白的rseC基因(WO03/008612)，·來自sucABCD操縱子的、編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因(WO03/008614)，·來自sucABCD操縱子的、編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶E2亞基的sucB基因(WO03/008614)，·來自sucABCD操縱子的、編碼琥珀醯-CoA合成酶的β-亞基的sucC基因(WO03/008615)，·來自sucABCD操縱子的、編碼琥珀醯-CoA合成酶的α-亞基的sucD基因(WO03/008615)，·編碼腺苷酸激酶的adk基因(Nucleic Acids Research13(19)7139-7151(1985))，·編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質蛋白的hdeA基因(Journal of Bacteriology175(23)7747-7748(1993))，·編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質蛋白的hdeB基因(Journal of Bacteriology 175(23)7747-7748(1993))，·編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因(Journal of BiologicalChemistry 262(22)10422-10425(1987))，·編碼周質、結合半乳糖的轉運蛋白的mglB基因(Molecularand General Genetics 229(3)453-459(1991))，·編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶的lpd基因(European Journal ofBiochemistry 135(3)519-527(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶複合物的E1組分的aceE基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(1)155-162(1983))，·編碼丙酮酸脫氫酶複合物的E2組分的aceF基因(EuropeanJournal of Biochemistry133(3)481-489(1983))，·編碼氨肽酶B的pepB基因(Journal of Fermentation andBioengineering 82392-397(1996))，·編碼醛脫氫酶(E.C.1.2.1.3)的aldH基因(Gene99(1)15-23(1991))，·編碼鐵貯藏同型蛋白(細菌鐵蛋白)的bfr基因(Journal ofBacteriology 171(7)3940-3947(1989))，·編碼尿苷磷酸化酶的udp基因(Nucleic Acids Research 17(16)6741(1989))，和·編碼具有σE因子活性的調控蛋白的rseB基因(MolecularMicrobiology 24(2)355-371(1997))。
此外，除過表達galP基因外，衰減尤其是關閉或減少一個或多個選自下列的基因的表達，對於生產L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的·編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因(Journal of Bacteriology1694716-4721(1987))，·編碼蘋果酸脫氫酶(E.C.1.1.1.37)的mdh基因(Archivesin Microbiology 14936-42(1987))，·開放閱讀框(ORF)yjfA的基因產物(國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登錄號AAC77180，WO02/29080)，·開放閱讀框(ORF)ytfP的基因產物(國家生物技術信息中心(NCBI，Bethesda，MD，USA)的登錄號AAC77179，WO02/29080)，·編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因(WO02/29080)，
·編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因(WO02/36797)，·編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因(WO02/081722)，·編碼磷酸轉移酶系統中的DgsA調控蛋白的dgsA基因(WO02/081721)，已知其名稱也為mlc基因，·編碼果糖阻遏蛋白的fruR基因(WO02/081698)，已知其名稱也為cra基因，·編碼38-因子的rpoS基因(WO01/05939)，已知其名稱也為katF基因，·編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因(WO03/008603)，和·編碼蘋果酸合酶A的aceB基因(WO03/008603)。
本文中的表達「衰減」描述了，通過例如利用弱啟動子或編碼具有較低活性的相應酶或蛋白質的基因或等位基因，或者使相應酶或蛋白質或基因失活，以及可選地結合這些方法，微生物中一或多種由相應DNA編碼的酶或蛋白質的細胞內活性或濃度的減少或關閉。
由於衰減措施，使相應蛋白質的活性或濃度通常降低至起始微生物中的野生型蛋白質活性或濃度的0至75％、0至50％、0至25％、0至10％或0至5％。
此外，除了過表達galP基因之外，還關閉不希望的副反應對於生產L-胺基酸，尤其是L-蘇氨酸，可能是有利的。(Nakayama「Breeding of Amino Acid Producing Microorganisms」，inOverproduction of Microbial Products，Krumphanzl，Sikyta，Vanek(編者)，Academic Press，London，UK，1982)根據本發明生產的微生物可以用分批法、補料分批法或重複補料分批法培養。Chmiel的教科書(Bioprozesstechnik1.Einführung indie Bioverfahrenstechnik(Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，1991))或Storhas的教科書(Bioreaktoren und periphereEinrichtungen(Vieweg Verlag，Braunschweig/Wiesbaden，1994))中給出了已知培養方法的概述。
所欲使用的培養基必須以適宜方式滿足特定菌株的需要。美國細菌學協會的手冊「Manual of Methods for General Bacteriology」(Washington D.C.，USA，1981)中給出了有關不同微生物培養基的說明。
可以使用的適宜碳源有糖類和碳水化合物例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽糖、糖蜜、澱粉以及任選的纖維素，油和脂肪例如大豆油、葵花油、花生油和椰子脂，脂肪酸例如棕櫚酸、硬脂酸、亞油酸，醇類例如甘油和乙醇這樣的，和有機酸例如乙酸這樣的。這些物質可以分別或作為混合物使用。
可以使用的氮源有，有機含氮化合物例如蛋白腖、酵母提取物、肉提取物、麥芽提取物、玉米漿、大豆粉和尿素，無機化合物例如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、碳酸銨和硝酸銨。氮源可以分別或作為混合物使用。
可以使用的磷源有，磷酸、磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀或相應的含鈉鹽。培養基還可以包含比如硫酸鎂或硫酸鐵這樣的生長所需的金屬鹽。最後，除上述提到的物質外，還可以使用比如胺基酸和維生素這樣的基本生長物質。培養基中還可以添加適宜的前體。上述提到的原料可以以單個混合物的形式添加到培養物中或者可以在培養過程中以適宜的方式給料。
通常在pH5.5至9.0，尤其是6.0至8.0下完成發酵。以適宜的方式使用比如氫氧化鈉、氫氧化鉀、氨或氨水這樣的鹼性化合物或比如磷酸或硫酸這樣的酸性化合物來控制pH。可以使用比如脂肪酸聚乙二醇酯這樣的抗泡沫劑來控制泡沫形成。可以向培養基中添加以選擇性方式起作用的物質例如抗生素，以保持質粒的穩定性。為保持通氣條件，向培養基中導入氧氣或含氧氣體例如空氣。培養溫度通常為25℃至45℃，優選為30℃至40℃。連續培養至已經產生了最大量的L-胺基酸或L-蘇氨酸。這一目標通常在10小時至160小時內實現。
可以按照Spackman等人(Analytical Chemistry301190-1206(1958))所述通過在陰離子交換層析後進行茚三酮衍生來完成L-胺基酸的分析，或者可以按照Lindroth等人(Analytical Chemistry 511167-1174(1979))所述通過反相HPLC來完成。
根據本發明的方法用於發酵生產L-胺基酸，例如L-蘇氨酸、L-異亮氨酸、L-纈氨酸、L-甲硫氨酸、L-高絲氨酸和L-賴氨酸，尤其是L-蘇氨酸。
利用工作實施例，本發明在下文中得到了更為詳細的說明。
J.H.Miller(A short course in bacterial genetics(1992)，Cold Spring Harbor Laboratory Press)描述了大腸桿菌的基本培養基(M9)和完全培養基(LB)。根據Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual(1989)Cold Spring Harbor Laboratory Press)所描述的完成從大腸桿菌中分離質粒DNA以及所有涉及限制性、連接、Klenow和鹼性磷酸酶處理的技術。除非另外描述，根據Chung等人所述(Proceedings of the National Academy of Sciences of the UnitedStates of America 862172-2175(1989))完成大腸桿菌的轉化。
製備菌株和轉化體期間的培養溫度是37℃。
實施例1構建表達質粒pTrc99AgalP利用聚合酶鏈式反應(PCR)和合成的寡核苷酸來擴增來自大腸桿菌K12的galP基因。從大腸桿菌K12 MG1655中的galP基因核苷酸序列開始(登錄號AE000377，Blattner等人(Science 2771453-1474(1997))，合成PCR引物。(MWG Biotech，Ebersberg，Germany)。引物序列經過修飾從而產生限制酶的識別位點。選擇XbaI的識別序列用於galP1引物，選擇HindIII的識別位點用於galP2引物，它們在以下所示核苷酸序列中用下劃線表示galP15′-CACAATCTAGATAAACCATATTGGAGGGCATC-3′(SEQ ID No.1)galP25′-GGGAGGAAGCTTGGGGAGATTAATC-3′(SEQ ID No.2)根據生產商的說明，利用「Qiagen Genomic-tips100/G」(QIAGEN，Hilden，Germany)分離用於PCR的染色體大腸桿菌K12MG1655 DNA。用Vent DNA聚合酶(New England Biolabs GmbH，Frankfurt，Germany)，在標準PCR條件(Innis等人(1990)PCR Protocols.A Guide toMethods and Applications，Academic Press)下利用特異引物可以擴增出大約1450bp大小的DNA片段(SEQ ID No.3)。
用酶XbaI和HindIII切割所擴增的galP片段，並與已經用酶XbaI和HindIII消化過的載體pTrc99A(Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)連接。用連接混合物轉化大腸桿菌菌株TOP 10 One Shot(TOPOTA Cloning Kit，Invitrogen，Groningen，荷蘭)，在已經用50μg/ml氨苄青黴素處理過的LB瓊脂上選擇含有質粒的細胞。在質粒DNA分離後，經酶XbaI、HindIII和EcoRV的測試切割可以檢測到成功的克隆。該質粒稱作pTrc99AgalP(附

圖1)。
實施例2用菌株MG442/pTrc99AgalP生產L-蘇氨酸生產L-蘇氨酸的大腸桿菌菌株MG442描述於專利說明書US-A-4,278,765中，並保藏在俄羅斯國家工業微生物保藏所(VKPM，Moscow，Russia)，保藏號為CMIMB-1628。
用實施例1中描述的質粒pTrc99AgalP和用載體pTrc99A轉化菌株MG442，在含有50μg/ml氨苄青黴素的LB瓊脂上選擇含有質粒的細胞。在質粒DNA分離後，經酶HincII、BamHI和KpnI的測試切割可以檢測到成功的轉化。用這種方式製備菌株MG442/pTrc99AgalP和MG442/pTrc99A。然後，在具有以下組成的基本培養基上再次擴增所選擇出的單個克隆3.5g/l Na2HPO4*2H2O、1.5g/l KH2PO4、1g/l NH4Cl、0.1g/l MgSO4*7H2O、2g/l葡萄糖、20g/l瓊脂、50mg/l氨苄青黴素。在置於100ml錐形瓶中的10ml分批培養物中檢查L-蘇氨酸的生產。向其中添加具有以下組成的10ml預培養培養基2g/l酵母提取物、10g/l(NH4)2SO4、1g/l KH2PO4、0.5g/l MgSO4*7H2O、15g/lCaCO3、20g/l葡萄糖、50mg/l氨苄青黴素，接種，並於37℃在KühnerAG(Birsfelden，瑞士)的ESR培養器上以180rpm培養16小時。然後將這些預培養物各250μl接種到10ml生產培養基(25g/l(NH4)2SO4、2g/l KH2PO4、1g/l MgSO4*7H2O、0.03g/l FeSO4*7H2O、0.018g/l MnSO4*1H2O、30g/l CaCO3、20g/l葡萄糖、50mg/l氨苄青黴素)中，於37℃培養48小時。以同樣的方式檢查起始菌株MG442的L-蘇氨酸生產，然而其中在培養基內不添加氨苄青黴素。培養後，用Dr.Lange Co.(Düsseldorf，德國)的LP2W光度計在660nm的測量波長下測定培養物懸浮液的光密度(OD)。
最後，用Eppendorf-BioTronik(Hamburg，Germany)的胺基酸分析儀，通過離子交換層析和採用茚三酮檢測的柱後反應來測定在無菌過濾的培養物上清液中產生的L-蘇氨酸濃度。
表1給出了實驗結果。
表1
附圖簡述附圖1含有galP基因的質粒pTrc99AgalP圖譜涉及長度的數據視為近似數據。所使用的縮寫和名稱定義如下·Amp氨苄青黴素抗性基因·lacItrc啟動子中阻遏蛋白的基因·Ptrctrc啟動子區域，IPTG可誘導·galPgalP基因的編碼區域·5S5SrRNA區域·rrnBTrRNA終止子區域限制酶縮寫定義如下·BamHI來自解澱粉芽孢桿菌H(Bacillusamyloliquefaciens H)的限制性內切酶·EcoRV來自大腸桿菌B946的限制性內切酶·HincII來自流感嗜血桿菌(Haemophilus influence)RC的限制性內切酶·HindIII來自流感嗜血桿菌的限制性內切酶·KpnI來自肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)的限制性內切酶·XbaI來自巴氏黃單胞菌(Xanthomonas badrii)(ATTC11672)的限制性內切酶序列表110Degussa AG120利用腸桿菌科的菌株生產L-胺基酸的方法130020481 BT1604170PatentIn version 3.1210121132212DNA213合成序列220
221引物222(1)..(32)223galP14001cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc 32210221125212DNA213合成序列220
221引物222(1)..(25)223galP24002gggaggaagc ttggggagat taatc 2521032111446212DNA213大腸桿菌220
221DNA片斷222(1)..(1446)223PCR產物220
221CDS222(33)..(1427)223galP編碼區
4003cacaatctag ataaaccata ttggagggca tc atg cct gac gct aaa aaa cag53Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln1 5ggg cgg tca aac aag gca atg acg ttt ttc gtc tgc ttc ctt gcc gct101Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala10 15 20ctg gcg gga tta ctc ttt ggc ctg gat atc ggt gta att gct ggc gca149Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala25 30 35ctg ccg ttt att gca gat gaa ttc cag att act tcg cac acg caa gaa197Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln Ile Thr Ser His Thr Gln Glu40 45 50 55tgg gtc gta agc tcc atg atg ttc ggt gcg gca gtc ggt gcg gtg ggc245Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly Ala Ala Val Gly Ala Val Gly60 65 70agc ggc tgg ctc tcc ttt aaa ctc ggg cgc aaa aag agc ctg atg atc293Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile75 80 85ggc gca att ttg ttt gtt gcc ggt tcg ctg ttc tct gcg gct gcg cca341Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro90 95 100aac gtt gaa gta ctg att ctt tcc cgc gtt cta ctg ggg ctg gcg gtg389Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg Val Leu Leu Gly Leu Ala Val105 110 115ggt gtg gcc tct tat acc gca ccg ctg tac ctc tct gaa att gcg ccg437Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro120 125 130 135gaa aaa att cgt ggc agt atg atc tcg atg tat cag ttg atg atc act485Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr140 145 150atc ggg atc ctc ggt gct tat ctt tct gat acc gcc ttc agc tac acc533Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr155 160 165
ggt gca tgg cgc tgg atg ctg ggt gtg att atc atc ccg gca att ttg581Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu170 175 180ctg ctg att ggt gtc ttc ttc ctg cca gac agc cca cgt tgg ttt gcc629Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala185 190 195gcc aaa cgc cgt ttt gtt gat gcc gaa cgc gtg ctg cta cgc ctg cgt677Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg200 205 210 215gac acc agc gcg gaa gcg aaa cgc gaa ctg gat gaa atc cgt gaa agt725Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser220 225 230ttg cag gtt aaa cag agt ggc tgg gcg ctg ttt aaa gag aac agc aac773Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn235 240 245ttc cgc cgc gcg gtg ttc ctt ggc gta ctg ttg cag gta atg cag caa821Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val Leu Leu Gln Val Met Gln Gln250 255 260ttc acc ggg atg aac gtc atc atg tat tac gcg ccg aaa atc ttc gaa869Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu265 270 275ctg gcg ggt tat acc aac act acc gag caa atg tgg ggg acc gtg att917Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu Gln Met Trp Gly Thr Val Ile280 285 290 295gtc ggc ctg acc aac gta ctt gcc acc ttt atc gca atc ggc ctt gtt965Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val300 305 310gac cgc tgg gga cgt aaa cca acg cta acg ctg ggc ttc ctg gtg atg1013Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu Thr Leu Gly Phe Leu Val Met315 320 325gct gct ggc atg ggc gta ctc ggt aca atg atg cat atc ggt att cac1061Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr Met Met His Ile Gly Ile His
330 335 340tct ccg tcg gcg cag tat ttc gcc atc gcc atg ctg ctg atg ttt att1109Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile Ala Met Leu Leu Met Phe Ile345 350 355gtc ggt ttt gcc atg agt gcc ggt ccg ctg att tgg gta ctg tgc tcc1157Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser360 365 370 375gaa att cag ccg ctg aaa ggc cgc gat ttt ggc atc acc tgc tcc act1205Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr380 385 390gcc acc aac tgg att gcc aac atg atc gtt ggc gca acg ttc ctg acc1253Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr395 400 405atg ctc aac acg ctg ggt aac gcc aac acc ttc tgg gtg tat gcg gct1301Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala410 415 420ctg aac gta ctg ttt atc ctg ctg aca ttg tgg ctg gta ccg gaa acc1349Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr425 430 435aaa cac gtt tcg ctg gaa cat att gaa cgt aat ctg atg aaa ggt cgt1397Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg440 445 450 455aaa ctg cgc gaa ata ggc gct cac gat taa tctccccaag cttcctccc 1446Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp4602104211464212PRT213大腸桿菌4004Met Pro Asp Ala Lys Lys Gln Gly Arg Ser Asn Lys Ala Met Thr Phe1 5 10 15
Phe Val Cys Phe Leu Ala Ala Leu Ala Gly Leu Leu Phe Gly Leu Asp20 25 30Ile Gly Val Ile Ala Gly Ala Leu Pro Phe Ile Ala Asp Glu Phe Gln35 40 45Ile Thr Ser His Thr Gln Glu Trp Val Val Ser Ser Met Met Phe Gly50 55 60Ala Ala Val Gly Ala Val Gly Ser Gly Trp Leu Ser Phe Lys Leu Gly65 70 75 80Arg Lys Lys Ser Leu Met Ile Gly Ala Ile Leu Phe Val Ala Gly Ser85 90 95Leu Phe Ser Ala Ala Ala Pro Asn Val Glu Val Leu Ile Leu Ser Arg100 105 110Val Leu Leu Gly Leu Ala Val Gly Val Ala Ser Tyr Thr Ala Pro Leu115 120 125Tyr Leu Ser Glu Ile Ala Pro Glu Lys Ile Arg Gly Ser Met Ile Ser130 135 140Met Tyr Gln Leu Met Ile Thr Ile Gly Ile Leu Gly Ala Tyr Leu Ser145 150 155 160Asp Thr Ala Phe Ser Tyr Thr Gly Ala Trp Arg Trp Met Leu Gly Val165 170 175Ile Ile Ile Pro Ala Ile Leu Leu Leu Ile Gly Val Phe Phe Leu Pro180 185 190
Asp Ser Pro Arg Trp Phe Ala Ala Lys Arg Arg Phe Val Asp Ala Glu195 200 205Arg Val Leu Leu Arg Leu Arg Asp Thr Ser Ala Glu Ala Lys Arg Glu210 215 220Leu Asp Glu Ile Arg Glu Ser Leu Gln Val Lys Gln Ser Gly Trp Ala225 230 235 240Leu Phe Lys Glu Asn Ser Asn Phe Arg Arg Ala Val Phe Leu Gly Val245 250 255Leu Leu Gln Val Met Gln Gln Phe Thr Gly Met Asn Val Ile Met Tyr260 265 270Tyr Ala Pro Lys Ile Phe Glu Leu Ala Gly Tyr Thr Asn Thr Thr Glu275 280 285Gln Met Trp Gly Thr Val Ile Val Gly Leu Thr Asn Val Leu Ala Thr290 295 300Phe Ile Ala Ile Gly Leu Val Asp Arg Trp Gly Arg Lys Pro Thr Leu305 310 315 320Thr Leu Gly Phe Leu Val Met Ala Ala Gly Met Gly Val Leu Gly Thr325 330 335Met Met His Ile Gly Ile His Ser Pro Ser Ala Gln Tyr Phe Ala Ile340 345 350Ala Met Leu Leu Met Phe Ile Val Gly Phe Ala Met Ser Ala Gly Pro355 360 365
Leu Ile Trp Val Leu Cys Ser Glu Ile Gln Pro Leu Lys Gly Arg Asp370 375 380Phe Gly Ile Thr Cys Ser Thr Ala Thr Asn Trp Ile Ala Asn Met Ile385 390 395 400Val Gly Ala Thr Phe Leu Thr Met Leu Asn Thr Leu Gly Asn Ala Asn405 410 415Thr Phe Trp Val Tyr Ala Ala Leu Asn Val Leu Phe Ile Leu Leu Thr420 425 430Leu Trp Leu Val Pro Glu Thr Lys His Val Ser Leu Glu His Ile Glu435 440 445Arg Asn Leu Met Lys Gly Arg Lys Leu Arg Glu Ile Gly Ala His Asp450 455 460
權利要求
1.生產L-胺基酸尤其是L-蘇氨酸的方法，它通過以下步驟完成a)發酵腸桿菌科的微生物，該微生物中的galP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達的，且該微生物生產所希望的L-胺基酸，b)在培養基或微生物細胞中富集所希望的L-胺基酸，和c)分離所希望的L-胺基酸，其中一些或全部(≥0至100％)發酵液體培養基組分和/或生物質可選地保留在產物中。
2.根據權利要求1的方法，其中另外還使用過表達在所希望的L-胺基酸合成途徑中的其它基因的微生物。
3.根據權利要求1的方法，其中使用至少一些代謝途徑被關閉的微生物，所述代謝途徑減少所希望的L-胺基酸的生產。
4.根據權利要求1的方法，其中通過提高拷貝數來提高編碼galP基因的多核苷酸的過表達。
5.根據權利要求1的方法，其中通過改變啟動子來提高編碼galP基因的多核苷酸的過表達。
6.根據權利要求1的方法，其中發酵另外還同時過表達選自下列的一或多種基因的腸桿菌科微生物來生產L-胺基酸6.1編碼天冬氨酸激酶、高絲氨酸脫氫酶、高絲氨酸激酶和蘇氨酸合酶的thrABC操縱子，6.2編碼丙酮酸羧化酶的pyc基因，6.3編碼磷酸烯醇丙酮酸合酶的pps基因，6.4編碼磷酸烯醇丙酮酸羧化酶的ppc基因，6.5編碼轉氫酶的pntA和pntB基因，6.6賦予高絲氨酸抗性的rhtB基因，6.7編碼蘋果酸醌氧化還原酶的mqo基因，6.8賦予蘇氨酸抗性的rhtC基因，6.9編碼蘇氨酸輸出蛋白的thrE基因，6.10編碼穀氨酸脫氫酶的gdhA基因，6.11編碼葡糖激酶的glk基因，6.12編碼DNA結合蛋白HLP-II的hns基因，6.13編碼葡糖磷酸變位酶的pgm基因，6.14編碼果糖二磷酸醛縮酶的fba基因，6.15編碼磷酸組氨酸蛋白己醣磷酸轉移酶的ptsH基因，6.16編碼磷酸轉移酶系統中的酶I的ptsI基因，6.17編碼葡萄糖-特異性IIA組分的crr基因，6.18編碼葡萄糖-特異性IIBC組分的ptsG基因，6.19編碼亮氨酸調節子中的調控蛋白的lrp基因，6.20編碼全局調控蛋白Csr的csrA基因，6.21編碼fad調節子中的調控蛋白的fadR基因，6.22編碼中央中間代謝中的調控蛋白的iclR基因，6.23編碼10KDa陪伴蛋白的mopB基因，6.24編碼烷基氫過氧化物還原酶的小亞基的ahpC基因，6.25編碼烷基氫過氧化物還原酶的大亞基的ahpF基因，6.26編碼半胱氨酸合酶A的cysK基因，6.27編碼cys調節子中的調控蛋白的cysB基因，6.28編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的黃素蛋白的cysJ基因，6.29編碼NADPH亞硫酸鹽還原酶中的血蛋白的cysI基因，6.30編碼腺苷醯硫酸還原酶的cysH基因，6.31編碼pho調節子中的正調控蛋白PhoB的phoB基因，6.32編碼pho調節子中的傳感蛋白的phoR基因，6.33編碼細胞外膜中的E蛋白的phoE基因，6.34編碼受果糖刺激的丙酮酸激酶I的pykF基因，6.35編碼6-磷酸果糖激酶II的pfkB基因，6.36編碼麥芽糖轉運中的周質結合蛋白的malE基因，6.37編碼超氧化物歧化酶的sodA基因，6.38編碼具有抗-σE活性的膜蛋白的rseA基因，6.39編碼σE因子中的全局調控蛋白的rseC基因，6.40編碼2-酮戊二酸脫氫酶的脫羧酶亞基的sucA基因，6.41編碼2-酮戊二酸脫氫酶的二氫硫辛酸轉琥珀酸酶E2亞單位的sucB基因，6.42編碼琥珀醯-CoA合成酶的β-亞基的sucC基因，6.43編碼琥珀醯-CoA合成酶的α-亞基的sucD基因，6.44編碼腺苷酸激酶的adk基因，6.45編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質蛋白的hdeA基因，6.46編碼具有類似陪伴蛋白功能的周質蛋白的hdeB基因，6.47編碼異檸檬酸脫氫酶的icd基因，6.48編碼周質、結合半乳糖的轉運蛋白的mglB基因，6.49編碼二氫硫辛醯胺脫氫酶的lpd基因，6.50編碼丙酮酸脫氫酶複合物的E1組分的aceE基因，6.51編碼丙酮酸脫氫酶複合物的E2組分的aceF基因，6.52編碼氨肽酶B的pepB基因6.53編碼醛脫氫酶的aldH基因，6.54編碼鐵貯藏同型蛋白的bfr基因，6.55編碼尿苷磷酸化酶的udp基因，和6.56編碼具有σE因子活性的調控蛋白的rseB基因。
7.根據權利要求1的方法，其中為生產L-胺基酸發酵腸桿菌科的微生物，這些微生物中另外還衰減尤其是關閉了一個或多個選自下列的基因，或降低了它們的表達7.1編碼蘇氨酸脫氫酶的tdh基因，7.2編碼蘋果酸脫氫酶的mdh基因，7.3開放閱讀框(ORF)yjfA的基因產物，7.4開放閱讀框(ORF)ytfP的基因產物，7.5編碼磷酸烯醇丙酮酸羧激酶的pckA基因，7.6編碼丙酮酸氧化酶的poxB基因，7.7編碼異檸檬酸裂合酶的aceA基因，7.8編碼磷酸轉移酶系統中的DgsA調控蛋白的dgsA基因，7.9編碼果糖阻遏蛋白的fruR基因，7.10編碼σ38-因子的rpoS基因，7.11編碼天冬氨酸銨裂合酶的aspA基因，和7.12編碼蘋果酸合酶A的aceB基因。
8.來自腸桿菌科，尤其是來自埃希氏屬的微生物，其galP基因或編碼該基因的核苷酸序列過表達。
9.根據權利要求8的微生物，其中這些微生物產生L-蘇氨酸。
全文摘要
本發明提供生產L－胺基酸尤其是L－蘇氨酸的方法，它通過以下步驟完成a)發酵腸桿菌科的微生物，該微生物中的galP基因或編碼其的核苷酸序列是過表達的，且該微生物生產所希望的L－胺基酸，b)在培養基或細菌細胞中富集所希望的L－胺基酸，和c)分離所希望的L－胺基酸。
文檔編號C12N15/63GK1768147SQ200480008435
公開日2006年5月3日 申請日期2004年3月18日 優先權日2003年4月1日
發明者M·裡平戈 申請人:底古薩股份公司