一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構的製作方法
2023-07-04 04:13:01
專利名稱：一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種同步的電路結構，尤其涉及一種實現細胞間振蕩子
(repressilator)同步的電路結構，該電路結構基於耦合機制和外部控制手段， 用於實現細胞間repress ilator電路同步，屬於合成生物學4支術領域。
(二)
背景技術：
過去的幾個世紀，分子生物學和細胞生物學方面的發展呈現了爆發式的增 長，對於生命的理解也趨向於統一，就是人類可以完整認識生命過程並加以預 測，甚至精確控制細胞活動。隨著分子生物學技術的累積，基因工程的發展以 及生物學與工程技術的大量結合，合成生物學開始出現並快速發展起來。基因 電路作為合成生物學研究的領域之一，通過設計和構建生命體中不存在的生物 組件和系統，有助於解決能源、材料、健康和環保等問題。
基因電路將複雜的生物學功能抽象成分子濃度的變化，把注意力集中於系 統的輸入輸出，並由此合成了多種單元電路。隨著基因調控網絡複雜度的不斷 提高，如何協調各單元電路的時間、空間特性，使其完成特定的生物學功能， 成為限制基因電路發展的重要問題，repressilator電路的同步更是近年來基因電 路研究的熱點。而且對基因電路同步性的研究，有助於理解生物體體現出的各 種自然節律現象，比如心臟在竇房結處的搏動、上視束交叉核處的晝夜節律時鐘等。
在基因電路的同步性方面，國外的學者的研究大多集中在時鐘電路原型的建 立和性能分析上。Elowitz最先構建了一個由三個抑制子構成的振蕩基因網絡， 稱為repressilator。它不屬於生物體內的自然振蕩網絡，如果動力學參數合理匹 配的話，系統會以規律的周期和幅度振蕩，並隨細胞的分裂向外傳播。Basu構 建了一個人工多細胞系統，接收細胞內含有衝激信號產生電路，周圍的發送細 胞產生信號分子之後，接收細胞可以對此信號產生短暫的響應。衝激信號的幅 度和響應時間不僅取決於誘導物最後的濃度，同樣取決於誘導物增加的速率，
3這樣就賦予了系統獨特的時空特性。Vilar等人也利用生物體內以24小時為周期 的自然時鐘網絡構造了細胞間的振蕩系統。之後的研究對于振蕩電路的模型改 進、性能提升、噪聲抑制方面都有很大改進。目前，實現細胞間基因電路的同 步的常用方法有耦合機制和外部控制兩種。Garcia-Ojalvo借筌革蘭氏陰性菌中 的群體感應機制，利用耦合機制實現了細胞間repressilator的同步。外部控制手 段可以是周期變化的光照、溫度或者周期注入的抑制蛋白，前兩者雖然是自然 界中普遍存在的時鐘同步的方式，但是無論是模型還是可操作性都存在許多未 知的方面。Wang在Garcia-Ojalvo同步電路的基礎上，通過周期注入的自體i秀導 分子，限制多細胞網絡動力特性趨向一致，對周期和幅度變化範圍大的系統同 樣適用。但是，這種系統的缺點就是它以轉錄因子作為各振蕩子之間的時鐘信 號，這就要求網絡內所有門控的啟動子都對同一個轉錄因子敏感，限制了振蕩 子的數目；由於自然界中轉錄因子的抑制子是比較少的，因此效率也不是很高。 或者時鐘也可以是由實驗者由外部提供的控制信號。以終止基因表達為基礎的 開關電路就是這樣一種系統。網絡中的轉錄因子和其他信號蛋白均由外加的位 於啟動子和基因之間的終止子控制。這種系統很好的滿足了系統對於時鐘全局 性、易操作性、靈活性的要求，然而終止子和反終止子分別作用於系統內不同 電路時它們之間的相互影響也是不可避免的。
此外，基因電路是與電子電路相對而言的，由於分子生物固有的複雜性和 我們對於基因電路動力學參數依然存在許多不了解的方面，在對基因電路分析 的過程中可以借鑑電子電路中許多成熟的理論和方法。Alexandre在他的論文中 建立了 一個類似於基因電路中振蕩器的模擬電路，通過比較全局匹配和全局外 部控制的效果，分析多個振蕩子之間的同步性。
發明內容
1、 目的本發明的目的是提供一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構，該 電路克服了現有技術的不足，它是基於耦合機制和外部控制兩種方法，揚長避 短，優化組合設計而成。其仿真結果顯示，相同條件下同步效果更好，可操作 性更強。
2、 技術方案本發明一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構，其設計的電 路結構如下該電路由repressilator電路模塊、同步信號生成模塊以及連接 repressilator沖莫塊與同步信號生成模塊的細胞間通訊才莫塊三部分組成；所述
4repressilator電路才莫塊，由PLteto廣cI、入Pr- lacl 、 PLlac1-tetR三個反相器構成， cl基因取自入噬菌體，lacl基因取自大腸桿菌，tetR基因取自四環素可抑制轉 位子TnlO, PLtet1、 APR 、 PuadM分別是cI基因、lacl基因、tetR基因可抑制的 啟動子，PUetoi~cI的輸出接入PR- lacl的輸入，入PR- lacl的輸出接PLiac1 -tetR的
輸入，Puac(n-tetR的輸出接PLtet(h"Cl的輸入，首尾相接構成迴路，其中A PR-lad
反相器同時與細胞間通訊模塊的AHL-LuxR連接；所述同步信號生成才莫塊，由
PBAD啟動子和n基因構成，n基因取自A噬菌體，PBAD啟動子來自阿拉伯糖操縱
子，外部周期注入的L-阿拉伯糖作為該模塊的輸入，該模塊的輸出信號N蛋白 作用於細胞間通訊模塊的化3終止子；所述細胞間通訊模塊，由Ptrp-luxl反相器 及兩者之間的tu終止子、高斯氨酸內酯(AHL)、 LuxR蛋白構成，AHL是一種 可自由出入細胞膜的小分子物質，Pt^-luxl反相器的輸出信號Luxl蛋白是AHL 生成所必需的酶，AHL生成後與LuxR蛋白的複合物AHL-LuxR是該才莫塊的輸 出信號，對repressilator電路模塊中的入PR- lacl反相器起誘導作用。
各模塊之間的連接是同步信號生成模塊的輸入為外部控制，即L-阿拉伯
糖濃度，它作為終止信號生成電路的輸入，誘導PBAD啟動子啟動n基因的表達，
輸出的N蛋白濃度作用於細胞間通訊模塊的tu終止子，發揮反終止作用，控制 各細胞之間耦合的有無及耦合力的大小，細胞間通訊模塊的輸出信號AHL-LuxR 複合物，可以誘導repressilator模塊中lacl基因的表達，由此三個模塊構成了完 整的細月包間repressilator同步電路。
工作原理是本發明涉及的細胞間repressilator同步電路，通過控制外部周 期注入的L-阿拉伯糖，從而控制N蛋白的產生與否，而在N蛋白濃度為低時， 由於tu的終止作用，Luxl蛋白的表達幾乎全被終止，因此各細胞內repressilator 之間幾乎沒有影響，它們以各自的周期和幅度振蕩。當細胞內N蛋白濃度為高 時，Luxl蛋白的表達迅速增加，在Luxl酶的催化作用下，細胞內產生高斯氨 酸內酯(AHL)的小分子物質，這種物質可以通過擴散的方式自由出入細胞膜， 從而通過AHL的濃度變化在細胞之間建立起一種通信機制。而AHL與LuxR 蛋白結合之後對於LacI蛋白的表達具有誘導作用，當細胞內AHL濃度發生變 化時，相應的會改變Lacl蛋白的濃度，也就改變了 repressilator振蕩的周期和 相位。仿真結果證實，改變外部注入的周期、幅度、佔空比等參數均會對同步 性能的好壞產生一定影響，也就可以得到同步性能較好時，各參數的範圍。
從以上細胞間repressilator同步電路的工作原理中可以看出，不僅利用了細 胞間耦合機制在實現同步時的高效性，同時也借鑑了外部控制手段在實現同步時的靈活、可操作性，綜合兩種方法，彌補了耦合;^幾制在repressilator周期、相 位差別較大時的耦合不足，減弱了單純外部控制時，對噪聲的敏感。
圖1是細胞間r印ressilator同步電路的示意圖。通過控制外部周期注入的L-阿拉伯糖，從而控制N蛋白的產生與否，而在N蛋白濃度為低時，Luxl蛋白 的表達幾乎全被終止，因此各細胞內repressilator之間幾乎沒有影響，它們以各 自的周期和幅度振蕩。當細胞內N蛋白濃度為高時，LuxI蛋白的表達迅速增加， 在LuxI酶的催化作用下，細胞內產生高斯氨酸內酯(AHL)的小分子物質，這 種物質可以通過擴散的方式自由出入細胞膜，從而通過AHL的濃度變化在細胞 之間建立起一種通信機制。而AHL與LuxR蛋白結合之後對於CI蛋白的表達 具有誘導作用，當細胞內AHL濃度發生變化時，相應的會改變CI蛋白的濃度， 也就改變了 repressilator振蕩的周期和相位。
圖2是repressilator電路的示意圖。笫一個抑制蛋白lacl，抑制第二個基因 tetR的轉錄，它的蛋白產物可以抑制第三個基因cl的表達，而CI蛋白又抑制 lacl基因的表達，/人而構成一個迴環。Repressilator中的三個基因來自於不同的 物種，說明這個基因網絡並不是自然界中存在的時鐘網絡，而是人工合成的， 是人工基因電路的典型代表。
圖3是細胞間通訊模塊示意圖，此模塊是附加在repressilator電路上的，目 的是在大量包含repressilator的電路之間建立耦合機制，這裡釆用的方法就是群 體感應。由革蘭氏陰性菌中的群體感應可知，該種群細胞釋放出一種信號分子， 可自由出入細胞膜，當環境中該信號分子的濃度累積到一定程度，此信號分子 便於受體蛋白結合形成複合物。該複合物的生成促進了一種酶基因的表達，而 這種酶是後續基因的表達所必須的。
圖4是同步信號生成電路模塊，由一個可誘導啟動子和n基因構成。啟動 子PBAD可以被L-阿拉伯糖誘導，同時也受AraC轉錄因子和環腺苷酸(cAMP) 調控。當細胞內葡萄糖水平為低時，可滿足後兩個條件，此時，控制L-阿拉伯 糖的濃度即可以控制N蛋白的表達與否。N蛋白濃度高時，RNA聚合酶通過反 終止蛋白特異性地識別RNA的結構，或與終止子位點的相互作用後，無法識別 終止子，從而繼續轉錄。這個過程類似於門控機制，細胞內不存在反終止蛋白 時，RNA聚合酶轉錄到終止子處，停止轉錄，即"開關"打開，基因無法表達； 反之，細胞內反終止蛋白濃度達到一定範圍後，終止子的功能幾乎全部被抑制， RNA聚合酶通讀終止子，即"開關"關閉，基因得以順利表達。
3、優點及功效200910076690.8
說明書第5/7頁
(1) 本發明所涉及的利用耦合機制和外部控制手段實現細胞間repressilator電路同步的方法，克服了耦合機制無法控制同步起始的問題；
(2) 本發明所涉及的同步電路，改善了外部控制手段魯棒性差的缺點，相同條件下同步效果更好；
(3) 本發明所涉及的同步電路，從同步性能參數RX).9時，外部注入的周期、幅度、佔空比等參數的範圍，可知該電路具有較好的抗幹擾能力；
(4) 本發明所涉及的同步電路，各模塊均來自與相對研究比較深入的領域，對模型的仿真基本可以準確反映電路的性能。
(四)
圖1細胞間repressilator同步電路示意2細胞間通訊;漠塊示意3反終止作用機制示意4 repressilator結構示意中符號說明如下
'Puetoi、人Pr、 Puacoi、 P衝、PsAD代表各啟動子；cl、 lacl、 tetR、 luxl、 n代表各基因；luxR是一種群體感應調控蛋白；AHL是高絲氨酸內酯。
(五)
具體實施例方式
見圖1、圖2、圖3、圖4所示， 一種實現細胞間振蕩子(repressilator)同步的電路結構，具體實施如下
本發明一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構，其設計的電路結構如下該電路由repressilator電路模塊、同步信號生成模塊以及連接repressilator模塊與同步信號生成模塊的細胞間通訊模塊三部分組成；所述repressilator電路模塊，
由PLtet0廣cI、人Pr曙lad 、 PuaeO廣tetR三個反相器構成，cl基因取自入逸菌體，
lacl基因取自大腸桿菌，tetR基因取自四環素可抑制轉位子TnlO,PLtet(H、 XPR 、Puacoi分別是cl基因、lacl基因、tetR基因可抑制的啟動子，PLtet1~cI的輸出接入PR- lacl的輸入，入PR- lacl的輸出接PUacoi-tetR的輸入，PUac1-tetR的輸出接PLtetoi"Cl的輸入，首尾相接構成迴路，其中XPR- lacl反相器同時與細胞間通訊模塊的AHL-LuxR連接；所述同步信號生成模塊，由PsAD啟動子和n基因構成，n基因取自入謹菌體，PBAD啟動子來自阿拉伯糖操縱子，外部周期注入的L-阿拉伯糖作為該模塊的輸入，該模塊的輸出信號N蛋白作用於細胞間通訊模塊的
tL3終止子；所述細胞間通訊模塊，由P的-1UXI反相器及兩者之間的tu終止子、
高斯氨酸內酯(AHL)、 LuxR蛋白構成，AHL是一種可自由出入細胞膜的小分子物質，P昨-luxI反相器的輸出信號LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生成後與LuxR蛋白的複合物AHL-LuxR是該模塊的輸出信號，對repressilator電路模塊中的入PR- lacl反相器起誘導作用。
各模塊之間的連接是同步信號生成衝莫塊的輸入為外部控制，即L-阿拉伯
糖濃度，它作為終止信號生成電路的輸入，誘導PBAD啟動子啟動n基因的表達，輸出的N蛋白濃度作用於細胞間通訊模塊的tL3終止子，發揮反終止作用，控制
各細胞之間耦合的有無及耦合力的大小，細胞間通訊模塊的輸出信號AHL-LuxR複合物，可以誘導repressilator模塊中lacl基因的表達，由此三個模塊構成了完整的細胞間repressilator同步電路。
圖1是細胞間repressilator同步電路的示意圖。通過控制外部周期注入的L-阿拉伯糖，從而控制N蛋白的產生與否，而在N蛋白濃度為低時，Luxl蛋白的表達幾乎全被終止，因此各細胞內repressilator之間幾乎沒有影響，它們以各自的周期和幅度振蕩。當細胞內N蛋白濃度為高時,LuxI蛋白的表達迅速增加，在LuxI酶的催化作用下，細胞內產生高斯氨酸內酯(AHL)的小分子物質，這種物質可以通過擴散的方式自由出入細胞膜，從而通過AHL的濃度變化在細胞之間建立起一種通信才幾制。而AHL與LuxR蛋白結合之後對於CI蛋白的表達具有誘導作用，當細胞內AHL濃度發生變化時，相應的會改變CI蛋白的濃度，也就改變了 repressilator振蕩的周期和相位。
圖2是repressilator模塊的示意圖。R印ressilator是人工基因電路的典型代表，它所涉及到的基因來自於不同的物種，包括PUe n-cI、 JVPR- lacl 、Puaco廠tetR三個反相器，XPR啟動子啟動lacl基因的表達，PLtet01啟動子啟動cl
基因的表達，Puac(M啟動子啟動tetR基因的表達，同時，各基因的表達受到抑制
蛋白的抑制作用。人PR-lacI的產物lacI蛋白，抑制P^c(n-tetR的轉錄；PUacrtetR的蛋白產物TetR可以抑制PLtet01~cI的表達;PLtet1"Cl的產物CI蛋白抑制人PR- lacl的表達，從而構成一個迴環。當各反相器參數匹配得當，repressilator處於非穩態時，Lacl蛋白、CI蛋白、TetR蛋白的濃度會以一定的周期和幅度振蕩。
圖3是細胞間通訊模塊示意圖，P怖啟動子啟動luxl基因的表達，但是由於tL3終止子的終止作用，無法經翻譯生成Luxl蛋白，也就無法生成AHL,輸出的AHL-LuxR濃度也為低。當N反終止蛋白濃度大於75nM時，RNA聚合酶在轉
8錄的過程中忽略終止子，繼續轉錄並翻譯生成Luxl蛋白。Luxl蛋白對AHL的 生成有催化作用，生成AHL之後，由於擴散作用，AHL可自由出入細胞膜，細 胞內的AHL與LuxR蛋白結合後的複合物濃度隨AHL濃度的升高隨之增高，直 到飽和。
圖4是同步信號生成模塊示意圖，由PBAD啟動子和n基因構成。啟動子PBAD
可以被L-阿拉伯糖誘導，同時也受AraC轉錄因子和環腺苷酸(cAMP )調控。 當細胞內葡萄糖水平為低時，可滿足後兩個條件，此時，控制L-阿拉伯糖的濃 度即可以控制N蛋白的表達與否。外部控制手段，即L-阿拉伯糖濃度高時，誘 導n基因表達，細胞內N蛋白濃度為高，反之，則細胞內N蛋白濃度為低。
從以上細胞間repressilator同步電路可以看出，它不僅利用了細胞間耦合機 制在實現同步時的高效性，同時也借鑑了外部控制手段在實現同步時的靈活、 可操作性，綜合兩種方法，彌補了耦合機制在repressilator周期、相位差別較大 時的耦合不足，減弱了單純外部控制時，對噪聲的敏感。
9
權利要求
1、一種實現細胞間振蕩子同步的電路結構，其特徵在於該電路由repressilator電路模塊、同步信號生成模塊以及連接repressilator模塊與同步信號生成模塊的細胞間通訊模塊三部分組成；所述repressilator電路模塊，由PLtet01-cI、λPR-lacI、PLlac01-tetR三個反相器構成，cI基因取自λ噬菌體，lacI基因取自大腸桿菌，tetR基因取自四環素可抑制轉位子Tn10，PLtet01、λPR、PLlac01分別是cI基因、lacI基因、tetR基因可抑制的啟動子，PLtet01-cI的輸出接λPR-lacI的輸入，λPR-lacI的輸出接PLlac01-tetR的輸入，PLlac01-tetR的輸出接PLtet01-cI的輸入，首尾相接構成迴路，其中λPR-lacI反相器同時與細胞間通訊模塊的AHL-LuxR連接；所述同步信號生成模塊，由PBAD啟動子和n基因構成，n基因取自λ噬菌體，PBAD啟動子來自阿拉伯糖操縱子，外部周期注入的L-阿拉伯糖作為該模塊的輸入，該模塊的輸出信號N蛋白作用於細胞間通訊模塊的tL3終止子；所述細胞間通訊模塊，由Ptrp-luxI反相器及兩者之間的tL3終止子、高斯氨酸內酯AHL、LuxR蛋白構成，AHL是一種可自由出入細胞膜的小分子物質，Ptrp-luxI反相器的輸出信號LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生成後與LuxR蛋白的複合物AHL-LuxR是該模塊的輸出信號，對repressilator電路模塊中的λPR-lacI反相器起誘導作用；各模塊之間的連接是同步信號生成模塊的輸入為外部控制，即L-阿拉伯糖濃度，它作為終止信號生成電路的輸入，誘導PBAD啟動子啟動n基因的表達，輸出的N蛋白濃度作用於細胞間通訊模塊的tL3終止子，發揮反終止作用，控制各細胞之間耦合的有無及耦合力的大小，細胞間通訊模塊的輸出信號AHL-LuxR複合物，可以誘導repressilator模塊中lacI基因的表達，由此三個模塊構成了完整的細胞間repressilator同步電路。
全文摘要
一種實現細胞間振蕩子(repressilator)同步的電路結構，它由repressilator電路模塊、同步信號生成模塊以及細胞間通訊模塊組成；所述repressilator電路模塊，由PLtet01-cI、λPR-lacI、PLlac01-tetR三個反相器構成，PLtet01-cI的輸出接λPR-lacI的輸入，λPR-lacI的輸出接PLlac01-tetR的輸入，PLlac01-tetR的輸出接PLtet01-cI的輸入，首尾相接構成迴路；所述同步信號生成模塊，由PBAD啟動子和n基因構成，外部周期注入的L-阿拉伯糖作為該模塊的輸入，該模塊的輸出信號N蛋白作用於細胞間通訊模塊的tL3終止子；所述細胞間通訊模塊，由Ptrp-luxI反相器及兩者之間的tL3終止子、AHL、LuxR蛋白構成，Ptrp-luxI反相器的輸出信號LuxI蛋白是AHL生成所必需的酶，AHL生成後與LuxR蛋白的複合物AHL-LuxR是該模塊的輸出信號。其仿真結果顯示，該電路在相同條件下同步效果更好，可操作性更強。
文檔編號C12M1/42GK101475907SQ200910076690
公開日2009年7月8日 申請日期2009年1月15日 優先權日2009年1月15日
發明者劉志英, 翔 王 申請人:北京航空航天大學