殼聚糖組合物的製作方法

2023-08-03 22:05:41

專利名稱：殼聚糖組合物的製作方法
殼聚糖組合物本發明涉及殼聚糖組合物，特別是由具有低脫乙醯度並在6-10的pH範圍內共價 交聯的殼聚糖製成的殼聚糖凝膠。
背景技術：
本發明涉及生物相容性多糖凝膠組合物，特別是疫苗中的殼聚糖組合物，用於藥 物遞送、組織填充、細胞培養、有活力細胞的包囊、美容用途、矯形外科用途，用作生物材料、 傷口癒合裝置，用作食品工業中的增稠劑和添加劑，用作膠、潤滑劑、鑽孔和維護液。該凝膠 是通過具有低脫乙醯度的共價交聯的殼聚糖凝膠製備的。通過選擇特定脫乙醯度的殼聚糖 和使用有效的交聯條件，可以獲得具有有趣和意想不到的生物和物理性質的凝膠。這與由 標準殼聚糖和使用典型的交聯方案製得的其他交聯殼聚糖水凝膠完全不同。本發明的凝膠 可以製備成只具有非常低的毒性，它們可以製備成能夠快速降解。所述凝膠的另一種顯著 特徵是，當在中性和鹼性條件下時它們不會沉澱。它們也具有剛性，這使得可以用於其他機 械處理而成為，例如可注射的所謂「碎凝膠」，可以用於很多的用途。水凝膠可以定義為其中水是分散介質的膠態凝膠。水凝膠廣泛用於很多領域，在 數個地區已經變成了數十億美元的產業。典型地，水凝膠是由水溶性聚合物製成的，所述聚 合物是從自然來源分離的，或者可以通過合成或天然聚合物的化學修飾來獲得。根據它們 的物理和生物性質來選擇這些化合物，根據所期望的產品性質，單獨或聯合使用。一些聚合 物具有使得它們適合醫學應用的物理性質，而其他則用於食品工業、機械加工和製造工業， 作為潤滑劑、鑽孔和維護液，用於美容、生物材料用途，用於生物技術例如細胞支架等等。不 同的用途需要不用品質的聚合物，很多技術用途是基於低成本下可用的粗製塊狀品質，而 醫學用途則需要高純度的品質，通常也是高成本的。有時聚合物溶液的物理性質，例如粘性 是人們關注的主要參數，而在其他用途中，生物學和毒理學性質則對於其預期的應用功能 變得更為突出。一些聚合物在組織填充組合物中用於填充目的，其中凝膠單獨或與固體珠一起使 用。在其他用途例如，傷口癒合、藥物遞送、疫苗載體中，需要具有其他性質的其他聚合物來 滿足醫療需求。一般而言，性質例如粘性、抗微生物活性、粘連或水吸收/保持能力是必須 考慮的全部性質。水分保持能力和溶脹在食品用途中是典型的重要重點，其中聚合物用作 增稠劑或作為其他試劑的增溶劑和穩定劑。在醫學產品中發現有種類廣泛的聚合物，包括 合成和天然來源的聚合物。在很多應用中，重要的是，聚合物降解和清除，而不會導致不希 望有的副作用。儘管生物可降解性不總是必要的，但是，良好的生物相容性是非常重要的， 以避免副反應例如炎症、免疫反應或物質排斥。因此，在醫學產品中使用天然產生的無毒 性多糖也就毫不奇怪了，因為它們具有優良的物理性質，同時還有人們感興趣的生物學和 醫學性質，一般可以高純度和低成本使用。一般使用的多糖是例如，纖維素、海藻酸鹽、殼聚 糖、透明質酸、澱粉或其衍生物。在醫學中，凝膠和軟膏用於，例如，遞送藥物，美容目的，或者提供抗菌屏障以避免 感染。水凝膠通常具有適當的溶解性和生物學性質，因此可以用於很多產品。形成凝膠的 多糖例如透明質酸、纖維素的衍生物等已經變成了有利可圖的工業領域。透明質酸是聚合物的一個例子，它可以使用的原因在於，當在生理學PH下在低濃度的水溶液中使用時它能 自發形成水凝膠。其他聚合物例如纖維素不能這樣使用，必須經化學修飾產生需要的性質。 當由多糖製備水凝膠時，典型的方案包括該聚合物以低濃度(通常0.5-3% (w/w))溶於水 溶液。當需要較高粘性時，可以通過，如果溶解性允許，向溶液中加入更多聚合物，或者通過 使聚合物交聯來實現。交聯得到了更高分子量的聚合物，因此得到了更高的粘性。交聯可 以使用共價、離子或疏水性策略，通過不同的方法來進行，可以使用很多的途徑。一般而言， 當交聯反應的產物打算用於醫學用途時，需要保持儘可能低的交聯水平，因為有向該交聯 劑引入免疫反應的危險，同時也會危害生物可降解性。免疫學和變態反應。免疫系統可以分為先天免疫和適應性免疫。先天或非特異性 免疫是對沒有被感染或接種所免疫的物種所顯現的固有的抵抗力。適應性或獲得性免疫是 這樣一類免疫，其中對刺激它的抗原有可變的反應性並產生抗原特異性免疫記憶。免疫可 以是主動的，即，是獲得性感染或接種的結果，或者它可以是被動的，例如，是從抗體的轉移 獲得的。抗體的被動接種有幾個缺點注射異物會引起對所注射抗體的免疫應答。單克隆 抗體必須大量地注射，這使得該療法非常昂貴。必須持續治療以維持其功能。主動接種誘 導抗體產生和免疫記憶是最常優選的。大部分天然免疫原是分子量在5kDa以上的蛋白質。 甚至免疫原分子不會產生所期望的免疫水平。為了增強免疫應答的強度，將免疫原與佐劑 組合。佐劑是這樣一種試劑，它增強免疫應答而不會產生不希望有的抗佐劑的抗體。如果 免疫原仍然不能產生可接受的免疫應答，可以將它與致免疫性更強的載體結合。分子量範 圍0. l_2kDa的小分子通常太小而不能被免疫系統識別，因此難於在免疫接種中使用。克服 這一點的一種途徑是將它們共價結合到較大的載體分子上。接種可以是經口服、鼻、皮下、 黏膜下、舌下或肌內。T-和NK細胞對外源細胞的識別和破壞稱之為細胞介導的免疫(THl免疫應答)。 體液免疫與B-細胞有關(TH2免疫應答)。據報導，氫氧化鋁選擇性地激活TH2細胞，而弗氏 完全佐劑則激活THl細胞。殼聚糖也顯示出可以增強體液和細胞介導的免疫應答(Vaccine 3，379-384，1985)。先天免疫系統識別廣譜的病原體，而不需要預先接觸。負責先天免疫的主要細胞 是單核細胞/巨噬細胞和嗜中性粒細胞，它們吞噬微生物病原體並觸發先天性、炎性和適 應性免疫應答。Toll-樣受體(TLRs)是一類與識別範圍廣泛的微生物有關的I型跨膜蛋 白。它們在先天免疫系統中發揮關鍵作用。TLRs是模式識別受體(PRRs)的一種類型，識 別病原體廣泛共有但與宿主分子可識別開的分子，統稱為病原體相關分子模式(PAMPs)。 巨噬細胞受體也被認為是模式識別受體。巨噬細胞甘露糖受體識別具有碳C3和C4位的 中軸位羥基的己糖，這使得它可以識別甘露糖、果糖、N-乙醯葡糖胺和葡萄糖(Curr. Opin. Immunol. 10，50-55，1998)。變態反應是一種非常常見的疾病，在工業國家中影響了約四分之一到三分之一的 人口，例如，超過5000萬的美國人患有變態反應性疾病。現在，最常用的治療策略是靶向變 態反應的效應機理，例如，通過口服攝取抗組胺類或通過局部用皮質激素。抗組胺類或皮質 激素治療可以有效地緩解變態反應症狀，但是它們的使用導致整個身體暴露於藥品，它們 可以產生令人不快或者甚至有害的副作用。變應原-特異性免疫治療是靶向於潛在的變態 反應原因，並長效緩解症狀的唯一在使用的治療。因此，認為它是變態反應性疾病唯一的根治療法。這種治療是以皮下注射或舌下給藥給予的。通過實行皮下注射變應原浸出物，很 多文獻記載了它具有的效果，同時舌下給藥的變應原特異性免疫治療的效力則較少記載。變態反應性疾病例如哮喘和鼻炎是由對否則無害的周圍抗原，即變應原不適當的 免疫應答所導致的。最常見的形式是免疫球蛋白(Ig)E-介導的變態反應，特徵在於存在變 應原特異性IgE。現在有兩種治療IgE-介導的變態反應的常用策略，分別是藥理學治療和 變應原特異性免疫治療。藥理學治療包括用局部用皮質激素治療，特別是在變應性哮喘和 溼疹的情況下。但是，10-20%的變應性哮喘患者對於類固醇治療沒有應答。其他常用的抗 變態反應藥物靶向於Ig E-介導的變態反應的效應機理，例如是抗組胺類、抗白三烯類和色 酮類。Ig E-介導的變態反應的唯一一種治癒性療法，即長效緩解症狀的唯一療法是變應原 特異性免疫療法(ASIT)。與藥理學治療相反，ASIT也已經顯示出可以減輕氣道炎症並起保 護作用，防止發展成為慢性哮喘(J Allergy Clin Immunol. 1998102(4 Pt 1)，558-62)。該 治療是基於重複施用變應原，以誘導變應原特異性無應答性。目前，在ASIT中一般使用由 天然來源製備並吸附到氫氧化鋁(alum)中的變應原浸出物。Alum延遲了變應原的釋放，並 發揮佐劑的作用。但是，會出現一些與使用變應原浸出物和alum有關的缺點。在3-5年的 時間裡需要以較低變應原劑量進行很多次注射。為了解決問題例如引入新的致敏作用和浸 出物的有害副作用，有人提出將重組變應原用於ASIT (Adv Immunol. 2004 ；82 105-53，Nat Rev Immunol. 2006，10月；6 (10) :761_71)。為了實現更安全和更有效的ASIT方案，可以以 不同的方法修飾重組變應原。這些新策略的例子是建立所謂低變應原，即與I gE結合能力 降低但保持T-細胞活性的變應原；用變應原衍生的多肽接種或者將變應原與免疫調節劑 例如包含CpG基序的免疫刺激寡核苷酸偶合(Nat Rev Immunol. 2006 Oct ；6 (10) :761_71， Curr OpinImmunol. 2002 Dec ； 14 (6) :718_27)。已知Alum會在注射位點導致肉芽腫，而且 主要刺激Th2應答。因此，ASIT需要可替代的佐劑。佐劑是增強抗原引發免疫應答能力的物質。儘管人們做了多方面的努力，試圖發 展出人用疫苗的新佐劑，但是唯一廣泛使用的佐劑仍然只有氫氧化鋁。據顯示，鋁佐劑會導 致神經元死亡。需要發展出新的佐劑以使新疫苗的效力最大化。理想的佐劑應當長效表達 功能活性的抗體，引發細胞介導的免疫並增加對抗原具有高度特異性的免疫反應性的記憶 性T和B淋巴細胞的產生。它應當立即提供防禦，並對抗原的未來攻擊提供保護。它也應 當是生物可降解的，無毒性的，並且不會直接對佐劑本身產生免疫應答。接種應當提供長期效果，快速產生抗體並具有較高的抗體滴度。在US 4，372，883和US 4，814，169中已經提及了將甲殼質和殼聚糖用作佐劑。在 US 5，554，388，US 5，744，166，和WO 98/42374中已經描述了殼聚糖在溶液、分散體、粉末 或微球形式的疫苗中的用途。殼聚糖的交聯開啟了從TH2至混合型TH1/TH2應答的免疫應 答。殼聚糖溶液與抗原混合用於免疫，顯示了殼聚糖與弗氏不完全佐劑是等效的，優於氫氧 化鋁(Vaccine 11，2085-2094，2007)。藥物遞送。藥物遞送是一個非常深入的研究領域，今天，在發現新的和改善的遞送 藥物活性成分例如低分子量藥物、基因和更具特異性的疫苗，同時使不希望有的副作用最 低的製劑方面花費了大量的資金。老藥在新的和改善的製劑中變成了新藥。殼聚糖的性質，包括物理和生理學性質使得它非常適合遞送藥物活性組分，並作 為遞送載體用於，例如疫苗、基因片段和微-RNA。殼聚糖有用且重要的特徵是，它與所有活組織結合，具有黏膜附著性質，可降解，而且能打開細胞之間的緊密連接。通過利用這 些性質，可以顯著改善跨黏膜的藥物遞送。現在，基於殼聚糖技術的藥物製劑正在發展 用於不同目的，例如，作為疫苗載體、延遲釋放的水凝膠、膜、紗布等。殼聚糖已經顯示出 可以用於，例如胰島素的結腸遞送(H. Tozaki等人，J. Pharm, ScL，86，1016-1021，1997) 和鼻內遞送(US 5，744，166)。殼聚糖也已經用作基因遞送的載體(MacLaughlin，等人， J. ControlledRelease,56，259—272，1998)。一些製劑設計用於經時持續釋放，而其他的釋放則更為瞬時。當使用殼聚糖的水 凝膠時，發現交聯是優選的，因為無交聯劑的凝膠有溶解的趨勢。使用交聯的其他優點是， 從凝膠中的釋放速率可以通過使用不同程度的交聯來調節。殼聚糖可以用於發展新的制 劑，用於例如口服、經皮、皮下、頰、舌下、鼻、直腸、陰道和肌內施用。通過常規的全身途徑以未修飾方式施用的很多藥物難以以有效濃度到達靶器官， 或者在一定時間後由於輕易代謝而不再有效。通過使用藥物遞送系統(DDS)，能夠克服這些 問題。癌症藥物通常的特點是，血漿半衰期較短和/或顯著的副作用。減輕這些問題的 一種方法是通過病灶施用，即，通過植入/注射包含化療劑的DDS，在癌症位點局部遞送藥 物。與全身性施用相比，副作用的程度將會降低，而藥物的總效果則會提高。當發展用於癌症局部療法的DDS時，必須考慮幾個技術因素，即生物相容性；生物 可降解(重要性取決於疾病、應用位點和劑量施用的次數)；無菌/滅菌；與藥物和藥學賦 形劑相容；易於施用(優選通過注射器)；劑量、藥物負載、給藥位置的靈活性；控制藥物釋 放的能力和患者的接受程度，以及對調節障礙、CoG(產品成本)和IPRs的考慮。通過注射含藥物的DDS使得較大量的負載藥物定位於腫瘤位點，由此改善了癌症 治療並降低了化療劑的有害的非特異性副作用。組織填充。組織填充可以用於醫學和美容目的。醫學應用是，例如，填充組織以得 到組織的功能改善。可以通過注射填充劑強化的組織的例子是聲帶、食管、尿道或直腸。在 美容手術的領域，軟組織填充可以用於校正缺陷例如疤痕和皺紋，並增大例如嘴唇或乳房。 很多不同的物質_生物不可降解的和生物可降解的_已經用於修復或填充軟組織。用於長 期的軟組織填充的物質的例子是矽酮、Gore-Tex和ePTFE。生物可降解的物質的例子是膠 原、自體脂肪、交聯透明質酸和合成型聚合物。矽酮是永久的軟組織填充最常用的物質。液體可注射矽酮的有害反應包括肉芽腫 性反應、炎性反應和漂移。這些反應可以在初始治療後數年內發生。此外，由於可注射的矽 酮是永久的填充物，上述併發症會變成嚴重的問題，因為該物質不會代謝，儘管治療但該反 應仍會持續。膠原是最常用的可注射物質之一，用於美容應用，並作為填充劑用於例如尿失禁。 但是，膠原有一些缺點。它迅速降解，約3 %的人顯示延遲的超敏反應，這使得必須在注射前 一段時間進行變態反應試驗。此外，來源於牛的膠原會傳染病毒性疾病。自體脂肪的注射是公知的。這些物質也有缺點。注射到面部線條和皺紋中的脂肪 會導致一些患者視力損失和栓塞。此外，自體脂肪易被身體吸收。交聯透明質酸產品用於美容治療，以及作為填充劑用於治療，例如尿失禁(UI)和 膀胱輸尿管反流(VUR)。
設計填充劑的共同方法是使用分散在生物學可降解的載體中的生物不可降解的 物質的球。例子包括葡聚糖凝膠中的碳-包衣的珠，羧甲基纖維素中的羥磷灰石球，聚 四氟-乙烯顆粒和聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球。顆粒注射的一個風險是顆粒可能 遷移到遠端的器官例如腦和肺中。現有的物質並不是最佳的，需要繼續研究用於組織填充用途的新物質，通過細針 可注射、生物可相容的、無毒性的並且在組織內有適當駐留時間的物質。已經描述了用於軟組織填充的殼聚糖凝膠(W0 97/04012，EP 1333869)。例如 Biomaterials. 2000 ；21 (21) :2165_61，J Biomed Mater ResA. 2007 ；83 (2) 521-9，和Biochimie. 2006 ；88 (5) :551_64所述，殼聚糖凝膠也已經用於細胞培養和引入有 活力的細胞以用於，例如軟骨組織處理。在美容中，殼聚糖已經用於，例如皮膚用乳膏(US 20060210513, US 20040043963)，和減輕刮臉導致的皮膚刺激(US 6，719，961)。殼聚糖也可以用作潤滑劑(Nature. 2003，425 :163-165)。在例如Environ Sci Technol. (2002)36(16) :3446_54 和 Nanotechnology (2006) 173718-3723 中已經描述了殼 聚糖用作增稠劑。它也已經用作膠(Biomacromolecules. 1 (2) =252-8(2000)和Fertil Steril, 84, 75-81 (2005))和膳食增補劑(US 5,098,733，US 5,976,550，US 6，238，720 和 US 6, 428, 806)除了醫學用途，粘彈性的殼聚糖水凝膠可以用作假塑性體、包含殼聚糖的剪切稀 化液體，在例如US 6，258，755中描述了一種增強該液體的熱穩定性的方法。甲殼質是地球上僅次於纖維素的最豐富的多糖。在堅硬結構和強壯物質中發現了 它，它在其中具有強固棒的功能。它與鈣鹽、一些蛋白質和液體一起，構成了海產生物例如 甲殼類和節肢動物的外骨骼。也在一些細菌和海綿的細胞壁上發現了它，它構成了昆蟲堅 硬的外殼和翅膀。在商業上，甲殼質是從甲殼動物的外殼分離的，甲殼動物的外殼是魚類工 業的廢品。殼聚糖是一種線性多糖，由1，4-β-連接的D-葡糖胺和N-乙醯基-D-葡糖胺 殘基構成。甲殼質本身不是水溶性的，這極大地限制了其用途。但是，用強鹼處理甲殼質使 其部分脫乙醯化，得到了水溶性的衍生物殼聚糖，它具有很多不同物理形式，例如，薄膜、海 綿、珠、水凝膠、膜。鹼形式的殼聚糖，特別是高分子量和/或高度N-乙醯化的殼聚糖幾乎 不溶於水，但是其與一價酸的鹽將變成水溶性的。葡糖胺殘基的平均PKa是約6. 8，該聚合 物與例如HC1、乙酸和羥乙酸形成水溶性鹽。殼聚糖的溶解性取決於若干因素，包括內在例 如鏈長、脫乙醯度、鏈內乙醯基分布，也取決於外部條件例如離子強度、ΡΗ、溫度和溶劑。由 文獻已知，約50%的乙醯化程度對於溶解性是最佳的。當在酸性環境中製備凝膠和水溶液 時，具體殼聚糖的溶解性實際上設置了限制，取決於其分子量及其N-脫乙醯程度。但是，基 於液體介質的重量，水性介質中殼聚糖的量典型地在1-10%或1-5%重量的範圍內，如果 使用低分子量的殼聚糖，該量趨向於該範圍的上限(Carbohydr. Polym. 25,65-70,1994)。殼聚糖的固有性質是生物可降解、無毒性和抗菌，以及其陽離子性質和親水性質， 這使得它在藥物製劑中是有吸引力的。但是，它在生理條件下溶解性較差限制了它的實際 用途。科學家通過製備在生理PH下具有良好溶解性的化學修飾的殼聚糖衍生物，例如硫酸 化的殼聚糖、N-羧甲基殼聚糖、0-羧甲基殼聚糖和N，0-羧甲基殼聚糖克服了其溶解性的 缺點(Int J Biol Macromol. (4), 177-80,1994, Carbohydr Res. 302(1-2) :7_12，1997)。
在殼聚糖上引入化學取代基的結果是改變了生物學性質，例如，改變了降解速率， 並有引入對生物相容性和毒性有不利影響的基團的風險。該問題已經在US 6，344，488中 解決，其中將甘油磷酸用作增溶劑，由此允許在生理PH下製備殼聚糖水凝膠，而不修飾殼 聚糖結構。殼聚糖溶液可以在酸性條件，典型地在適合Shiff鹼形成的pH(pH4_5)下交聯， 形成水凝膠。已經使用了大量的具有不同結構和反應性的不同交聯劑。已經使用了數種 交聯劑來由液體殼聚糖形成凝膠，例如葡萄糖胺聚糖例如透明質酸和硫酸軟骨素(Arm， Pharm. Fr. 5847-53，2000)、戊二酸(Ind. Eng. Chem. Res. 36 :3631_3638，1997)、乙二酸(US 5，489，401)、方酸二乙酯(Macromolecules 31 :1695_1601，1998)、二環氧化物例如二環 氧甘油醚(US5770712)、三聚磷酸鹽(J ApplPolym Sci 74 :1093_1107，1999)、genipin(J Polym Sci A =Polym Chem38 :2804_2814，2000，Biomaterials. 23 :181_191，2002)、甲酸 (J. Polym. Sci. Part A =Polym. Chem. 38，474，2000，Bull. Mater. Sci.，29，233—238，2006)。 當水凝膠是所需的產物時，強制殼聚糖及其衍生物保留在溶液中，並避免其沉澱。試圖調節 交聯殼聚糖水凝膠的PH至生理可接受的水平，會導致限制其使用的沉澱和不溶物。需要 保持儘可能低的交聯程度，這也出於毒理學原因，因為高度交聯會完全改變殼聚糖的行為 (Eur J Pharm Biopharm. 2004,57(1) 19—34. Review)。一類特別的水凝膠是粘彈性的凝膠，該凝膠是粘性的，同時顯示了彈性。粘彈性的 凝膠在所使用的剪切應力的影響下會變形和流動，但是當去除應力後，液體會從某種程度 的變形中緩慢恢復。這可以用於，例如，眼科學、組織填充和美容手術。凝膠的粘彈性允許 進行機械處理，包括製備碎膠。透明質酸的粘彈性凝膠，例如，用於眼外科、皺紋填充或治療 尿失禁。殼聚糖是一種天然的聚合電解質。聚合電解質在水性環境中的三維定向取決於， 例如其天然/化學組成、大小、濃度和電荷密度，即電荷的數量和其荷電基團之間的距離。 任何聚合電解質在溶液中的空間相互作用可以通過焓來控制，該分子將努力適應低能態， 在低能態下其最穩定。這種能量最小化過程涉及不同類型的相互作用，包括分子內(相同 分子內)或分子間(分子間)。分子內相互作用的例子是氫鍵、疏水性相互作用和聚合物上 荷電基團之間的相互作用。典型的分子間相互作用是溶劑相互作用和與其他分子的相互作 用。無論涉及哪種類型的相互作用，這些相互作用的驅動力是發現聚合電解質的能量上有 利的構象。當聚合電解質包含具有相同類型電荷，例如正電荷的荷電基團時，這些基團將相 互排斥。為了減小其內能，聚合電解質分子將努力儘可能多地分離其內電荷，產生了伸長的 聚合物鏈。這些伸長的聚合物不僅有更多的「空間需求」，它們也具有相對高的駐留在原子 之間的強制連接中的能態。另一方面，如果聚合電解質包含相反標記的電荷，它們將相互吸引，形成內鹽橋， 產生了聚合物不同的三維定向，即聚合物的不同部分彼此更加靠近。在沒有任何電荷的聚 合物中，沒有離子相互作用，因此其三維定向取決於分子內和與周圍分子和介質形成穩定 的氫鍵能力和疏水性相互作用。與聚合電解質相反，不包含任何高能斥力的不荷電聚合物， 形成了某種類型的「隨機螺旋」結構，其中它們的內能已經最小化，它們的相對能函低於聚 合電解質。
就物理上而言，離子相互作用(荷電)要強得多，涉及比其他相互作用例如氫鍵、 範德華力和疏水性相互作用更多的能力。因此前者對分子定向的相對影響更大，在很多情 況下會掩蓋所涉及的其他類型的力的影響。具有N-乙醯葡糖胺和葡糖胺殘基的混合的殼聚糖聚合物理論上是中性聚合物， 但是在大多數實際和生物學相關情況下，它是質子化的，因此葡聚糖中葡糖胺的PKa值是 約6. 8。但是，與具有不變荷電基團的聚合電解質相反，殼聚糖聚合物的電荷密度可以改變， 這直接取決於水溶液的PH。實際上，當pH是約6以上時，大多數市售和未修飾的殼聚糖在 水溶液中是不溶的，在該PH以上時它們會從水溶液中沉澱出來。沉澱是能量驅動的，因為 殼聚糖分子在其分子骨架上需要大量電荷以形成能量上有利的溶劑化態。如果這不能實 現，分子將從溶液中沉澱出來，形成更穩定的沉澱。在沉澱中，殼聚糖鏈集中在一起，這使得 可以通過殼聚糖分子之間或分子內的相互作用實現能量優化。為了增強殼聚糖溶液的粘性，可以使用化學交聯。在該反應中，殼聚糖鏈連接在一 起，形成更大的網樣凝聚物。在該反應期間，粘性成功地增強，溶液的結構變得更像凝膠。描 述了很多的交聯方法可以用於溶液中的殼聚糖，它們的共同點是，將殼聚糖溶於酸性水相。 在低PH，典型地是4-5下發生交聯反應。使用低pH暗示，殼聚糖鏈是其質子化形式，因此， 當交聯時它們是「伸長」形式。然後，所得到的交聯凝膠是在技術上巨大結構的質子化和伸 長的殼聚糖鏈。當將這種巨網引入中性或鹼性條件下時，一般會喪失其電荷，斷裂，最後沉 澱。這在某種程度上正是所期望的，因為當將標準殼聚糖(脫乙醯度約80-95%)引入pH 6以上時，它們會沉澱。本身的交聯產生了甚至更大的電解質結構，從能量的觀點來看，這甚 至更需要在水溶液中將其穩定。這是因為，正電荷在鏈之間的連接點更緊密地在一起，因此 甚至更難以用水分子溶劑化來穩定。因此，當以較差的能量優化方法，例如升高PH來改變 溶液條件時，它們甚至比個體鏈更易於沉澱。通過交聯，巨大的凝膠結構已經鎖定在了伸長 和能量不利的狀態，物理上不允許重排成螺旋和能成為能量上更有利的構象而產生高穩定 性的系統的其他構象。通過將交聯的殼聚糖凝膠塊置於pH大於7或甚至更高值，即PH7-14下，很容易實 驗證明在酸性條件下形成的殼聚糖凝膠的沉澱。當將這樣的塊狀物置於較高PH的緩衝液 中時，該塊狀物的表面立即變白，形成薄層的沉澱，隨著持續的分散，該塊狀物變得越來越 白，直至完全沉澱。但是，令人驚奇地，我們已經發現，交聯殼聚糖凝膠巨大結構的這種斷裂可以通過 使用特定脫乙醯度的低脫乙醯化的殼聚糖，並以能量較低的強制構象交聯殼聚糖鏈來克 服。根據該方法製備的凝膠可以用IM氫氧化鈉處理而不會形成沉澱。當用IM NaOH處理 時，相應的非交聯凝膠將會沉澱。通過使用高溶解性的這些特別的殼聚糖，在交聯反應期間pH可以升得更高。這 樣做的優點很多。首先，殼聚糖鏈的質子化變弱，該殼聚糖聚合物在PH 8以上時幾乎是中 性的，這使得可以在溶液中形成強制性更小和更隨機的螺旋樣網狀結構。當殼聚糖在該條 件下進行交聯時，所得到的凝膠結構是通過柔性更高的各殼聚糖鏈產生的，這使得當條件 改變時它們更易於轉變成能量上更有利的巨大結構。其次，就實質上增加葡糖胺殘基上的 氨基的反應性而言，使用更高的PH是可行的。這使得可以更有效的偶合，並能使用濃度低 得多的交聯試劑來達到規定程度的交聯。另一個好處是，副反應保持在低水平。與在低PH下，由標準級殼聚糖(脫乙醯度80-95% )製備的殼聚糖凝膠相比，這些交聯的凝膠具有若 幹優點。它們不會在生理條件下沉澱的事實意味著，它們更易受導致凝膠快速降解的降解 酶的影響，並且具有本說明書所述的其他性質。發明簡述因此，本發明提供一種可交聯的殼聚糖組合物，包含脫乙醯度30-75%的殼聚糖， 其中殼聚糖隨機脫乙醯化的，和交聯劑，其中基於交聯劑中官能團的數量和殼聚糖中易接 近的氨基的數量，交聯劑和殼聚糖的摩爾比是0.2 1或更小。本發明能在生理pH下形成交聯的、粘彈性的殼聚糖水凝膠，而無須使用其他增溶 劑，例如磷酸甘油。本發明的一個目的是由殼聚糖提供一種粘彈性的凝膠，其可以在生理pH下遞送 而不會沉澱。本發明的一個目的是提供一種粘彈性的凝膠，通過化學交聯已經得到了一定物理 強度，這使得它可以進一步處理成更小的、各自分離的凝膠片段，例如碎凝膠。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，它可以通過細注射器針 頭遞送，典型地是用於注射，例如用於接種。本發明的另一個目的是提供碎的粘彈性的殼聚糖水凝膠，其暴露出較大的表面 積，因此當在體內使用時，易用於酶和侵入的細胞。本發明的另一個目的是提供快速降解的粘彈性的殼聚糖水凝膠。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性、低毒性的殼聚糖水凝膠，通過使用低濃 度的交聯劑，優選低毒性或無毒性的試劑，減小或完全避免了不希望有的免疫或毒理性反 應。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，其允許在製備期間共價 或非共價地摻入抗原和免疫原。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，其具有固有的佐劑性 質。本發明的另一個目的是提供生物可降解的，粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於免疫用 途。本發明的另一個目的是提供一種載體，用於遞送抗原和免疫原，以進行免疫。本發 明提供一種免疫試劑，包含本文所述的殼聚糖水凝膠和抗原，其中抗原任選與殼聚糖共價結合。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，其使得可以共價摻入導 致免疫應答的分子。所述分子可以是低或高分子量，例如，小分子例如肽類、脂類、類固醇和 抗生素，或者大分子，例如蛋白質、基因片段、微-RNA、糖類聚合物和合成型聚合物。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，包含一種以上的致免疫 物質。該凝膠可以製備成包含兩種或更多的低和/或高分子量的抗原分子或抗原的混合 物。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，其允許共價或非共價地 摻入其他試劑，例如防腐劑，和其他聚合物。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，通過用陰離子聚合物包衣可以進一步改變其釋放性質。通過依次使用陽離子和陰離子聚合物，可以構成多層包衣 的粘彈性的凝膠結構。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於佐劑免疫療法，以 非特異性地增強免疫應答。本發明的另一個目的是提供一種製劑，通過在粘彈性的殼聚糖水凝膠摻入生物活 性劑或抗原(例如，變應原)，給予所述生物活性劑或抗原的持續釋放。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於組織填充，單獨使 用或與固體珠一起使用。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於治療例如，尿失禁 (UI)和膀胱輸尿管反流(VUR)。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用作填充劑。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，作為細胞培養支架。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於向宿主生物體提供 活細胞。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於口服、鼻、皮下、粘 膜下、舌下、角膜、直腸、陰道和肌內藥物遞送。本發明提供一種藥物組合物，包含如本文所 述的殼聚糖水凝膠和藥物活性成分。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，允許摻入和釋放藥物， 例如用於如上文所述的病灶癌症治療。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，允許在製造藥物期間共 價或非共價地摻入藥物。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用作傷口癒合裝置。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於粘性手術。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用於美容用途。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用作潤滑劑。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用作膠。本發明的另一個目的是提供一種粘彈性的殼聚糖水凝膠，用作鑽孔或維護液。現在，參考附圖來描述本發明，其中

圖1顯示的是皮下注射本發明的粘彈性殼聚 糖凝膠和對照凝膠24小時後，小鼠注射位點的組織切片。發明詳述本發明一般涉及由殼聚糖製備的水凝膠，意欲，例如用於人或獸醫學。更具體地， 本發明的目的是如前文所述應用的具有粘彈性的殼聚糖水凝膠。因此，本發明提供一種組 合物，包含殼聚糖或不同脫乙醯度的殼聚糖的組合物，所述殼聚糖不會在生理條件下沉澱， 同時暴露出較大表面積，因此易於進一步進行生物學處理。與現有技術的殼聚糖溶液相比， 本發明的粘彈性的水凝膠的表面積要大數個數量級。與現有技術的殼聚糖溶液(Vaccine 11，2085-2094，2007)相比，當皮下注射於小鼠時，本發明的粘彈性水凝膠的這種特徵使得 細胞滲透更快，免疫應答更迅速。這使得使用較低劑量的免疫原成為可能。這可以通過提供可交聯的殼聚糖組合物來實現，該組合物包含脫乙醯度30-75% 的殼聚糖，其中殼聚糖隨機脫乙醯化的，和交聯劑，其中基於交聯劑中官能團的數量和殼聚糖中易接近的氨基的數量，交聯劑和殼聚糖的摩爾比是0.2 1或更小。製備本發明的殼 聚糖水凝膠，包括提供該可交聯的殼聚糖組合物的水溶液，將該組合物交聯，分離所得到的 殼聚糖水凝膠。本發明也提供通過該方法可得到的水凝膠。殼聚糖的溶解性取決於若干因素，包括內在例如鏈長、脫乙醯度、鏈內乙醯基分 布，也取決於外部條件例如離子強度、PH、溫度和溶劑。已經做了很多嘗試來製備醫用殼 聚糖生理溶液和凝膠，但是通常大多數都結果較差。大多數市售的殼聚糖的脫乙醯度超過 80%，當製備溶液和凝膠時，需要低pH以溶解該聚合物，典型地使用乙酸或鹽酸的酸性溶 液。升高這些溶液的PH的嘗試會導致當pH超過約6時，殼聚糖聚合物沉澱。這個問題可 以通過使用水溶性更大的殼聚糖衍生物或者使用添加劑例如磷酸甘油來克服。我們已經發 現，低脫乙醯度例如50%的殼聚糖可以用於在生理條件下製備水凝膠，可以製備的殼聚糖 濃度高達若干百分比。低脫乙醯度的殼聚糖市售的很有限，但是在文獻中描述了這些殼聚 糖的製備。製備低脫乙醯度的殼聚糖的一種方法是在酸性條件下將殼聚糖重新乙醯化，然 後脫乙醯。另一種途徑是在強鹼和較冷的條件下由置於溶液中的甲殼質開始脫乙醯。低脫 乙醯度例如50%的殼聚糖並不僅僅比脫乙醯度較高的殼聚糖更易溶解，它們也更快速和更 容易被水解酶分解，其中該水解酶需要N-乙醯基識別分解位點。將殼聚糖凝膠和溶液升 至生理PH水平的較不明顯但是同樣重要的優點是，聚合鏈中葡糖胺殘基的反應性伴隨性 增強。在某些情況下，這可以用於抑制不希望有的副反應並減小潛在的交聯劑的影響，因此 它們的濃度可以保持在比產生氨基反應性增強的效果時低得多，而這種效果會產生更有效 的偶合。這種情況的一個實例是當在酸性條件下通過使用大量過量的方酸二乙酯交聯殼聚 糖時。在pH約4. 75下進行該反應，在兩個反應位點之一水解約50%的所加試劑，得到方 酸取代的殼聚糖鏈，其不會進一步交聯。當在PH 7以上進行相同反應時，反應會增強數個 級別，抑制了競爭性的副反應，產生單純且有效的反應，最少化了實現期望的交聯網狀結構 所需的試劑。當該殼聚糖凝膠結構意欲用於免疫用途時，這是最重要的。這是出於幾個理 由。首先，對交聯劑總是有發生不希望有的免疫反應的風險，其次，降解動力學改變的風險， 再次，這些交聯劑一般是高反應性的，如果不完全消耗會導致毒性副反應，因此將這些試劑 的水平保持在儘可能低是非常重要的。我們優選使用低毒性的交聯試劑，使用不會去除某 些基團的交聯劑，其中所述基團在粘彈性的水凝膠的生物學應用前必須除去。FDA確認了 方酸二丁酯可以用作局部免疫調節劑，在Ames試驗中不會誘變。另一類常用的交聯劑是基 於超氧化物化學的反應性物質。二環氧甘油醚常用於各種交聯反應，其中它們與羧酸、醇鹽 和胺反應。當二環氧甘油醚或類似衍生物已經用於殼聚糖的交聯目的時，所使用的交聯劑 與殼聚糖的氨基官能團為適當高比例。這在Journal ofBiomedical Materials Research Part A,2005,75A,3,742-753Eur. J. Pharm. Biopharm. 2004,57 ，19-34，US 5, 770, 712, WO 02/40070中有說明。我們也根據文獻試驗了其他交聯方法。戊二醛交聯產生了有色水凝膠， 該水凝膠當遇到鹼性介質時沉澱。本發明的粘彈性的水凝膠易於用，例如陰離子聚合物來 包衣，以改變生物學處理速率。當本發明的粘彈性的水凝膠透析過鹼性介質時，凝膠的表面 保持澄清，而現有技術的凝膠透析則使殼聚糖沉澱，可見到不透明的凝膠表面。非交聯和交 聯水凝膠之間沉澱有引人注目的差異。令人驚奇地，這些凝膠能用IMNaOH處理而不沉澱。粘彈性的凝膠的結構可以通過所使用的殼聚糖溶液濃度和交聯劑的量來影響。我 們優選較高濃度的殼聚糖和較低濃度的交聯劑，以得到所期望性質的凝膠。在本文中，交聯分子具有至少兩個反應位點，它們是親電子的，設計在中性或微鹼性條件下易與胺類反應。 當交聯劑具有兩個反應位點時，它是雙功能的，因此可以與不同殼聚糖鏈中的兩個氨基，例 如兩個葡糖胺單元反應。有很多市售的具有該性質的交聯劑，有時反應基團之間的距離通 過「間隔分子」來增大。該間隔子通常是脂肪族鏈或聚醚構造例如聚或寡乙二醇。優選地， 交聯劑是雙、三或四功能的，儘管優選雙或三功能，最優選雙功能的。我們優選使用雙功能 的交聯劑，其易於在中性到弱鹼性的條件下以高收率反應，並且其中交聯分子高度消耗。我 們也優選，交聯分子不會形成使用前必須除去的副產物。很多交聯劑被設計用於在反應時 除去離去基團。在這些情況下，我們優選除去無毒性組分的交聯劑。這些交聯功能的典型 例子是反應性的酯、Michael受體和環氧化物。優選的交聯分子是方酸的酯類衍生物、丙烯 醯胺的二環氧化物和衍生物。最優選的是方酸二乙酯(3，4_ 二乙氧基-3-環丁烯-1，2-二 酮)和與其結構密切相關的類似物。其他優選的交聯劑是1，4_ 丁二醇二環氧甘油醚、丙烯 醯胺的衍生物及與它們結構密切相關的類似物。同樣重要的是減少交聯劑的量，並產生有效且清潔的偶合反應，如果有副產物的 話也只產生一點。我們優選使用的殼聚糖中交聯劑與氨基官能團的數量的摩爾比較低。 我們優選0.2 1或更小的摩爾比，更優選使用0.16 1或更小的摩爾比，最優選使用 0.1 1或更小的摩爾比。所述摩爾比是基於交聯劑和殼聚糖上可交聯基團的數量。就交 聯劑而言，它取決於功能性(雙、三或四功能等)，而對於殼聚糖則取決於氨基的易接近性 (僅脫乙醯的氨基是反應性的)。很明顯，可用氨基的數量是由殼聚糖的脫乙醯度決定的。我們優選殼聚糖的脫乙醯度小於75%，更優選脫乙醯度小於70%，甚至更優選脫 乙醯度小於65%，甚至更優選脫乙醯度小於60%，最優選脫乙醯度小於55%。甲殼質完 全不溶於水溶液，當脫乙醯度為30%或更大時，會變得一定程度可溶。我們優選脫乙醯度 大於35%，優選脫乙醯度大於40%，最優選脫乙醯度大於45%。殼聚糖的溶解性也取決 於參數例如分子量、鏈內乙醯基的分布和平衡離子。殼聚糖本身是多元分散系，即，包含不 同鏈長的混合物。市售殼聚糖的特徵在於它們的粘性和平均分子量是給定的。當在25°C 的溫度下使用具有以20rpm旋轉的梭的旋轉粘度計，測定乙酸水溶液中的1 % w/v溶 液時，我們優選粘性高達15，OOOmPas,優選2_10，OOOmPas,更優選5_2，OOOmPas,最優選 10-1，OOOmPas0溶液的粘性指示殼聚糖平均分子量，應當理解，殼聚糖是具有不同鏈長的分 子分布的聚合物。我們優選使用的殼聚糖溶液濃度為3%或更小。更優選使用2%或更小 的濃度。我們優選濃度大於0.3% (w/w) 0殼聚糖的脫乙醯模式對於其性質也是重要的。本發明的殼聚糖必須是隨機脫乙醯 的。也就是說，避免使用大塊的殼聚糖類聚合物，因為這些物質具有變得難溶的趨勢。相反， 本發明的殼聚糖具有隨機模式的乙醯化和脫乙醯化的單糖單元。確定單糖性質的一種方法 是用NMR確定最近鄰頻率，並與統計模型獲得的頻率進行比較，參見WO 03/011912。市售殼聚糖典型地具有非隨機的塊狀結構。其原因在於，甲殼質是從甲殼動物的 外殼中以固相方法分離的，這些方法中，外殼在整個過程中都保持不溶，用強鹼處理外殼， 得到了部分脫乙醯的殼聚糖。但是，由於甲殼質最初是甲殼動物外殼的形式，鹼的氫氧根離 子優先作用於外殼表面上的單糖單元；相對厚的外殼中心內的單糖單元不會遇到氫氧根離 子，因此保持N-乙醯基取代的模式。為了避免這些甲殼質類塊狀物，應當在溶液中處理甲殼質/殼聚糖多糖鏈。這使得多糖鏈能進入溶液，喪失外殼結構。這能產生隨機脫乙醯模式。這可以通過在小心控制的 條件下在溶液中處理甲殼質，或者通過使甲殼質完全脫乙醯化，然後在溶液中重乙醯化以 得到需要的脫乙醯度來實現。參見T. Sannan等人，Makromol. Chem. 177，3589-3600，1976， X. F. Guo 等人，Journal of Carbohydrate Chemistry 2002，21，149-61 和 K. Μ· Varum 等人， Carbohydrate Polymers 25，1994，65-70。本發明的殼聚糖優選可以通過在溶液相中將殼 聚糖乙醯化和/或脫乙醯化以提供隨機脫乙醯模式來得到。當進行低脫乙醯化殼聚糖的交聯時，我們優選反應條件為PH大於6且殼聚糖不沉 澱。甚至更優選PH大於6. 5，最優選pH大於7. O。同時優選不會通過水解或消去反應較大 程度地破壞交聯劑的PH。所述反應的典型條件是鹼性條件，我們優選pH小於10，更優選pH 小於9. 5，甚至更優選pH小於9. O。優選地，存在的水為97-99.7%。也可以使用其他溶劑， 例如乙醇，比如以0.2% (ν/ν) 0在交聯反應中使用的交聯劑的濃度優選是0.01-0. 2% (ν/ ν)，更特別地約0.02% (ν/ν) 0本發明的粘彈性的水凝膠是以塊狀物得到的，其可以分離而無須進一步處理。然 後用本領域已知的常規技術處理該水凝膠，以得到更小的塊或片段。所得到的「碎膠」可以 通過細針頭注射。如實施例16所述，該凝膠的粘性可以用流變儀來測定。現在，通過但不限於下列實施例來解釋本發明。
實施例除非另有說明，在實施例中使用下列物質低度N乙醯化的殼聚糖基本上是根據下列文獻的原理製備的=Sarman Τ, Kurita K, Iwakura Y. S tudies on Chitin,1. DieMakromolekulare Chemie 1975;0:1191-5, Sannan Τ, Kurita K, IwakuraY. Studies on Chitin,2. Makromol. Chem. 177, 3589-3600, 1976, Guo X, Kikuch, Matahira Y, Sakai K, Ogawa K. Water soluble chitinof low degree of deacetylation. Journal of Carbohydrate Chemistry2002 :149—61 禾口 WO 03/011912。實施例1將殼聚糖(1. llg, N-脫乙醯度50%，麗145kD)懸浮於70mL蒸餾水中，滴加2M HCl (aq)以溶解殼聚糖。用IM氫氧化鈉將該溶液的pH調節至7. 4。用蒸餾水調節體積至 100mL。加入3，4_ 二乙氧基-3-環丁烯-1，2-二酮(122yL的20% (ν/ν)乙醇溶液)，將 該溶液攪拌3小時。將該溶液的pH調節至8.3，體積調節至111!^。將該溶液放置在40°C 的加熱箱中3天。固化的凝膠指定為1-1。重複該方法，但不加入3，4-二乙氧基-3-環丁 烯-1，2-二酮。該凝膠指定為1-2。實施例2將殼聚糖(0. 50g，N-脫乙醯度72%，麗145kD)懸浮於35mL蒸餾水，滴加2M HCl (aq)以溶解殼聚糖。用IM氫氧化鈉將該溶液的pH調節至6. 2。用蒸餾水調節體積至 50mL。該凝膠指定為2-1。向20mL的上述溶液中加入3，4_ 二乙氧基_3_環丁烯_1，2_ 二 酮(40yL的12% (ν/ν)乙醇溶液)，將該溶液劇烈攪拌10分鐘。調節該溶液的pH至7. 5。 將該溶液放置在40°C的加熱箱中3天。固化的凝膠指定為2-2。實施例3
在100°C下，殼聚糖(0. 50g，N-脫乙醯度72%，麗145kD)與戊二醛(6g)在5OmL IM HOAc (aq)中交聯。反應條件如 J. Control. Releaselll (2006)所述。實施例4將實施例1-4的各Ig凝膠用IM NaOH(aq)處理。凝膠1_2，2_1，和3 (對比)的殼 聚糖沉澱，而交聯凝膠1-1和2-2 (本發明)保持澄清。實施例5將鹽酸殼聚糖(0. 50g，N-脫乙醯度55%，麗145kD)溶於45mL水中。用稀氫氧化 鈉將該溶液的PH調節至7. 3。加入3，4-二乙氧基-3-環丁烯-1，2-二酮(102μ 的12% (ν/ν)乙醇溶液)，將該溶液攪拌3小時。調節該溶液的ρΗ至8.3，調節體積至50!^。將較 多的貓變應原，Fel dl (5. 9mg)加入到3g的上述溶液中，將該混合物轉移到5mL玻璃瓶中， 在40°C下放置6天。機械處理所得到的凝膠，轉移到ImL注射器中。實施例6將透明質酸(50mg)溶於MES緩衝液(20mL，20mM，pH 6. 5)中。向該透明質酸溶液 中加入實施例5的粘彈性水凝膠(4mL)，放置在定軌振蕩板上90分鐘。將該包衣的凝膠以 2，300rpm離心2x10分鐘，用PBS緩衝液洗滌，並轉移到注射器中。該透明質酸包衣的殼聚 糖凝膠可以凍幹並再水合，得到粘彈性的凝膠。當把實施例5的水凝膠加入到不含透明質 酸的PBS緩衝液中時，該絲狀片段會變得發白和膠粘，不易分離，因此不能再水合。實施例7將鹽酸殼聚糖(0. 30g，N-脫乙醯度55%，麗145kD)溶於25mL水中。用稀氫氧化 鈉將該溶液的PH調節至8. 3，體積調節至3. 0g。加入3，4- 二乙氧基-3-環丁烯-1，2- 二 酮(61 μ L的12% (ν/ν)乙醇溶液)，將該溶液攪拌3小時，然後在40°C下放置6天。向該 溶液中加入6mg Feld 1，並攪拌該混合物。然後將該混合物轉移到ImL注射器中。實施例8 (對比)將鹽酸殼聚糖(0.90g，N_脫乙醯度81%，麗145kD)懸浮於27g蒸餾水中。該溶 液的PH是3. 6。加入PBS (2.0ml，25mM，pH 7.4)。用稀氫氧化鈉調節pH至5. 8，調節體積 至60mL。將2. 27mg Fel d 1與1. ImL的上述溶液混合，並轉移到ImL注射器中。實施例9用100 μ L實施例5、7和8的溶液給數組的BALB/c小鼠在頸部皮下注射。然後1、 7和21天後，在不同時間點處死小鼠。通過吸入CO2來處死小鼠。收集注射位點的皮膚，置 於冰上的histocon中，然後在丙酮浴中冷凍該皮膚樣品。在組織切片前將該冷凍的皮膚活 組織檢查物保持在-80°C下。然後分析組織切片的細胞滲透。該組織檢查表明在注射實施 例5和7的凝膠1天後，細胞已經大量的滲透。實施例8的凝膠的組織檢查顯示，在細胞表 面覆蓋了鏡片狀的凝膠，但是凝膠中沒有細胞。在凝膠5和7中，24小時後細胞已經滲透 到整個物質中。7天後，實施例5和7的凝膠中殼聚糖的量減少。2周後，即第21天時，幾 乎沒有注射物質的蹤跡，相反，實施例8的凝膠顯示的細胞遷移要慢得多，同時降解也慢得
^^ ο圖1顯示了分別用實施例5的粘彈性的殼聚糖凝膠(圖1 (a))和實施例8的參照 殼聚糖(圖1(b))皮下注射24小時後，小鼠注射位點的組織切片。結果表明，與參照凝膠 相比，免疫細胞更迅速且更大程度地滲透到本發明的凝膠中。甚至在3周後，參照殼聚糖仍然沒有完全被滲透，與本發明的凝膠相比，觀察到參照殼聚糖凝膠的降解速度更緩慢。實施例10用100 μ L實施例5、7和8的溶液給數組的BALB/c小鼠在頸部皮下注射。在首 次注射後9周後，即第64天，給予加強注射。然後在注射後1、2、3、9和10周從尾部動脈 抽取血樣。通過ELISA測定Fel d 1_特異性血清IgG1和IgE的水平。所有凝膠都引發了 IgG1-抗體應答。實施例11將殼聚糖(2. 05g, N-脫乙醯度50%，麗145kD)懸浮於160mL的蒸餾水中，加入 2M HCl (aq)，直至殼聚糖溶解。通過滴加IM NaOH(aq)將pH調節至7. 9。用蒸餾水調節體 積至200mL。向50mL的上述溶液中滴加1，4_ 丁二醇二環氧甘油醚(166 μ L的5% (ν/ν) 乙醇溶液)。在室溫下劇烈攪拌該混合物10分鐘，然後放置在加熱箱(50°C )中過夜。實施例12將殼聚糖(2. 25g，N-脫乙醯度55%，麗145kD)懸浮於130mL的蒸餾水中，加入 2M鹽酸水溶液，直至殼聚糖溶解。用IM氫氧化鈉將pH調節至6. 75，並調節體積至160mL。 向50mL的上述溶液中加入3，4-二乙氧基-3-環丁烯-1，2-二酮(120 μ 1，12%乙醇溶液)， 將該溶液在室溫下攪拌2小時。將雙氯芬酸(773mg)溶於25mL的蒸餾水，並加入到上述溶 液中。用IM氫氧化鈉將該溶液的pH調節至8. 1，聲處理該溶液1小時，然後加熱至40°C過 夜。將所得到的凝膠(Ig)與透明質酸(4g，0. 25%，在蒸餾水中)混合。將該凝膠置於配有 截留分子量為2000Da的Spectra/Por過濾器並充滿PBS緩衝液的Franz cell中。在2小 時後釋放出38%的雙氯芬酸，5小時後釋放出60%，24小時後則為72%。實施例13用放射性75SeSEWrFel d 1重複實施例5的方法。基本上如以前Der ρ 2 (Febs J 2005 ；272 3449-60)所述，但是用Sel-標記的rFeld 1的構造、製備和精製條件 (Chembiochem 2006 ；7 :1976_81)，用原位標記Sel-標記的rFel d 1中的硒代半胱氨酸殘 基來進行75SeSEWrFeI d 1的製備。實施例14如以前(FebsJ 2005 ；272 3449-60, Methods Enzymol 1981 ；77 :64_80)所述， 進行與殼聚糖偶合或吸附到氫氧化鋁上的IOOyg放射性標記的[75Se]rFel d 1 (2 μ Ci) 的體內示蹤。簡言之，用殼聚糖-[75Se]rFel d 1或alum-[75Se]rFel d 1給小鼠(n = 2/ 組)s. c.注射，24小時或1周後殺死。冷凍小鼠並處理以進行帶切片放射自顯影術。將 切片(60 μ m)壓到 X-光片(Structurix，Agfa, Mortsel, Belgium)上並用 D19 (Kodak， Rochester, USA)產生顯影。結果24小時後，放射性已經代謝，在例如肝和脾中檢測到放射性。模式與氫氧化 鋁類似。分別1和2周後僅可以檢測到痕量的放射性。實施例15殼聚糖(3. 6g，N-脫乙醯度52%，)懸浮於250mL的蒸餾水中，加入2M HCl (aq)， 直至殼聚糖溶解。通過滴加IM NaOH(aq)將pH調節至7.0。用蒸餾水調節體積至300mL。 該溶液指定為溶液X(l. 2%殼聚糖)。向IOOmL的溶液X中加入50mL的水，該溶液指定為 溶液Y (0.8%殼聚糖)。分別將16mL的溶液X和溶液Y加入到2個燒杯中。根據下表，分別加入不同量的3，4_ 二乙氧基-3-環丁烯-1，2-二酮(10% (ν/ν)乙醇溶液)。X-I 20 μ LΧ-2 59 μ LΧ-3 118 μ LY-I 29 μ LΥ-2 88 μ LΥ-3 176 μ L在室溫下劇烈攪拌該混合物10分鐘，然後將各4g的溶液轉移到Petri培養皿(d =35mm)中，密封，並放置到加熱箱(40°C )中4天。從Petri培養皿中取出直徑6mm，高2. 65士0. 55mm的圓柱體，用配有100N測壓計 的Instron 3345壓成凝膠盤。對樣品進行Imm/分鐘的壓縮。應當注意的是，基於0. 8%殼聚糖溶液(Y-l，Y-2，Y_3)的凝膠在技術上更難以處 理，因為與基於1.2%殼聚糖溶液(X-l，Χ-2，Χ-3)的凝膠相比，它們剛性結構較弱，因此分 析精密度降低。儘管這是對比分析數據時需要考慮的問題，但是對凝膠並沒有不利的影響 (的確，剛性結構較弱會使凝膠更易粉碎)。基於1. 2%凝膠(X-l，Χ-2，Χ-3)的測定值的 分析數據表明，當交聯劑的量從2%增加到12% (用交聯劑和單糖單元的比計算)時平均 E-係數從4. 7增加到14. IMpa0實施例16殼聚糖(4g，N-脫乙醯度55%，)懸浮於350mL的蒸餾水中，加入2M HCl (aq)，直 至殼聚糖溶解。通過滴加IM NaOH(aq)將pH調節至7.0。用蒸餾水調節體積至400mL。向 包含50mL殼聚糖溶液的兩個不同的燒瓶中，滴加兩種不同體積的3，4- 二乙氧基-3-環丁 烯-1，2-二酮(60(樣品1)和185yL(樣品2)的12% (ν/ν)乙醇溶液)。在室溫下劇烈 攪拌該混合物5分鐘，然後將其中SmL轉移到塑料注射器(IOmL)中。密封注射器並放置在 加熱箱(40°C )中72小時。然後通過矽管(d = 3mm)對它們進行壓縮，將所形成的凝膠轉 移到新注射器(5mL注射器)中。在測量前，將注射器在4°C下儲藏。為進行流變學研究，使用Bohlin Gemini VOR裝置，用於測定40mm直徑的圓錐平 板幾何學和錐度為4度的單元。所有的測量都在25°C下進行。在振動剪切實驗中研究儲存和丟失係數G'和G"。這些流變學參數分別反應固 體和液體的粘彈性。這兩種凝膠樣品都在牽拉掃描測定中顯示了粘彈性的軟固體的性質，G' >G"， 即彈性組分大於液體對應物。在穩定的線性區域內，樣品1的G' (IHz)為約450Pa，相角 為約1°。對於樣品 ，相應的數據為G'約900Pa，相角為1°。在相同的製品上進行的第二類的振動測定是恆定變形0. 5的頻率掃描。獲得了下 列觀察樣品2的凝膠具有更高的凝膠強度，彈性係數G'大於樣品1的凝膠，這兩種樣品 在0. l-20Hz的研究範圍內，顯示了明顯頻率非依賴性的彈性係數。可以在凝膠樣品的碎片上進行可再現的粘彈性測定。這兩種凝膠樣品在其破碎狀 態下顯示了基本相同的粘彈性。與樣品1相比，凝膠樣品2的凝膠強度增強。實施例17將殼聚糖(lg，N_脫乙醯度55% )懸浮於80mL的蒸餾水中，加入2MHCl(aq)，直至殼聚糖溶解。通過滴加IM NaOH(aq)將pH調節至6. 8。用蒸餾水調節體積至100mL。攪拌 下將PEG1600 (2. 5g，40%，溶於水中)和3，4- 二乙氧基_3_環丁烯_1，2- 二酮(183 μ L的 1% (ν/ν)乙醇溶液)滴加到7. 5的該殼聚糖溶液中。將該溶液放置在40°C的加熱箱中3 天，得到透明的粘彈性凝膠。實施例18將殼聚糖(1. 5g，N-脫乙醯度55% )懸浮於80mL的蒸餾水中，加入2M HCl (aq)， 直至殼聚糖溶解。通過滴加IM妝0!1(叫)將？!1調節至6.5。用蒸餾水調節體積至100mL。 將溶於23g水的尼泊金甲酯(0. 2g)和尼泊金丙酯(0. 03g)加入到67g的該殼聚糖溶液中， 並在室溫下攪拌18小時。向上述溶液中滴加3，4-乙氧基-3-環丁烯-1，2- 二酮(24. 6 μ L 的11% (ν/ν)的乙醇溶液)。如實施例17所述，將該溶液放置在加熱箱中。
權利要求
可交聯的殼聚糖組合物，包含脫乙醯度30 75％的殼聚糖，其中殼聚糖是隨機脫乙醯化的，和交聯劑，其中基於交聯劑中官能團的數量和殼聚糖中脫乙醯化的氨基的數量，交聯劑和殼聚糖的摩爾比是0.2∶1或更小。
2.如權利要求1要求保護的可交聯的殼聚糖組合物，其中所述殼聚糖的脫乙醯度為 35-55% ο
3.如權利要求1或2要求保護的可交聯的殼聚糖組合物，其中在交聯前，所述殼聚糖中 重量平均分子量是10-500kDa。
4.如前述任一權利要求要求保護的可交聯的殼聚糖組合物，其中所述交聯劑是雙功能的。
5.如前述任一權利要求要求保護的可交聯的殼聚糖組合物，其中所述交聯劑具有選自 酯、Michael受體、環氧化物及其組合的官能團。
6. 一種製備殼聚糖水凝膠的方法，包括提供如前述任一權利要求要求保護的可交聯的 殼聚糖組合物的水溶液，將該組合物交聯並分離所得到的殼聚糖水凝膠。
7.如權利要求6要求保護的方法，其中所述交聯是在6-10的pH下進行的。
8.通過權利要求6或7的方法可以得到的殼聚糖水凝膠。
9.碎凝膠形式的權利要求8要求保護的的殼聚糖水凝膠。
10.如權利要求8或9要求保護的殼聚糖水凝膠，用作疫苗，用於藥物遞送，用於組織填 充，用作細胞培養支架，用於有活力細胞的包囊，用於傷口癒合裝置，用於矯形術，用作生物 材料，用於治療尿失禁或膀胱輸尿管反流，用於粘性手術，用於為宿主生物體提供活細胞， 用作美容品，用作填充劑，用作增稠劑，用作食品工業中的添加劑，用作膠，用作潤滑劑或者 用作鑽孔維護液。
11. 一種藥物組合物，包含如權利要求8或9要求保護的殼聚糖水凝膠和藥學活性成分。
12. 一種免疫劑，包含如權利要求8或9要求保護的殼聚糖水凝膠和抗原，其中所述抗 原任選與殼聚糖共價結合。
全文摘要
本發明涉及可交聯的殼聚糖組合物，包含脫乙醯度30-75％的殼聚糖，其中殼聚糖是隨機脫乙醯化的，和交聯劑，其中基於交聯劑中官能團的數量和殼聚糖的易接近的氨基的數量，交聯劑和殼聚糖的摩爾比是0.2∶1或更小。本發明也提供由其形成的殼聚糖水凝膠及其用途。
文檔編號C08B37/00GK101903408SQ200880121859
公開日2010年12月1日 申請日期2008年10月30日 優先權日2007年10月30日
發明者M·安德森 申請人:粘凝膠股份公司