硫醇基官能化試劑及其用途的製作方法

2023-07-25 00:58:46 4

專利名稱：硫醇基官能化試劑及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及官能化試劑以及利用它們修飾蛋白質和多肽的方法。本發明還涉及通過本發明方法製備的官能化多肽的用途。更具體而言，本發明應用與偶聯伴侶(coupling partner)共價連接的官能化試劑，所述官能化試劑包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環。典型地，所述偶聯伴侶(例如聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團)能夠改變多肽的性質。
背景技術：
現有技術中已知，可使聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)聚合物與治療性多肽共價連接，該過程稱為聚乙二醇化(PEG化)。通常典型地使用包含官能團(例如羥基、巰基、胺基或羧酸基團)的衍生物使多肽與PEG分子的反應性衍生物反應來進行PEG化。在 PEG化反應中，PEG分子的反應性官能團與多肽中存在的胺基酸的氨基、羧基或硫醇基基團或者與多肽的反應性N-末端或C-末端形成穩定的共價鍵。一般而言，PEG化反應需要使用反應性交聯劑，例如馬來醯亞胺。然而，還已知PEG化是相對不受控制的反應，主要是因為使用反應性交聯劑，並且因為PEG分子可以多種不同的方式與多肽中存在的多個官能團反應，從而產生不均一的產物。這意味著所得PEG化多肽可具有直鏈或支鏈結構和/或可具有可變數量的與每個多肽偶聯的PEG分子。該反應還受諸如蛋白質類型和濃度、反應時間、溫度和pH值的因素的影響，所有這些因素均對反應最終產物有影響。一般而言，進行PEG化以影響多肽(尤其是靜脈內施用的那些)的藥代動力學或免疫學特性。特別地，可對多肽進行改變以改善其穩定性、生物半衰期、水溶性和免疫學特性。認為對多肽進行PEG化使其質量增加(例如增加20-50kDa)意味著其更不容易通過腎臟排洩，因此在體內存在更長時間。此外，認為PEG化多肽被保護而不受內源性酶的降解。 這也有助於延長其體內半衰期。還認為延長體內半衰期和提高多肽藥物效力可導致降低患者需要的多肽的頻率或劑量，從而有助於降低針對多肽的免疫反應。PEG化還可有助於提高疏水性多肽的水溶性。然而，雖然PEG化多肽的特性是所期望的(尤其是對於治療性多肽而言)，但是在 PEG化反應中缺乏控制仍然是一個問題，因為這常常得到一系列具有多種不同特性的產物。 此外，因為多肽是複雜分子，所以難以使用保護基來控制反應的位點和/或程度，例如這在小分子化學中是可能的。多肽糖基化是翻譯後修飾的天然形式，其改變多肽的結構和功能。從本質上來說， 糖基化是由導致不同類型糖基化多肽的位點特異性修飾的酶促過程介導的。在N-連接的糖基化中，聚糖與天冬醯胺側鏈的醯胺氮相連，在0-連接的糖基化中，聚糖與絲氨酸和蘇氨酸側鏈的羥基氧相連。其它形式的糖基化包括與絲氨酸的羥基氧相連的糖胺聚糖、其中聚糖與神經醯胺相連的糖脂、不與蛋白質或脂質相連的透明質酸、以及通過聚糖連接使蛋白質與脂質相連的GPI錨定蛋白。
現有技術中存在的普遍問題是糖基化常添加到真核細胞中的多肽上，而很少添加到在常用治療性多肽重組表達的原核宿主中表達的多肽上。在原核宿主中產生的多肽缺少糖基化可導致所述多肽被識別為異物或者意味著它們具有不同於其天然形式的其它特性。 難以通過基因工程在多肽的非天然糖基化位點上進行糖基化以試圖將這用於調節多肽特性也是一個問題。WO 88/05433公開了用於製備多肽與信號產生或細胞毒性化學實體之綴合物的交聯劑。所述交聯劑由一系列含氮芳香雜環化合物組成，特別是2-、3_或4-乙烯基吡啶和乙烯基嘧啶，所述信號產生或細胞毒性化學實體可通過所述交聯劑中存在的活化酯取代基與所述含氮芳香雜環化合物相連。綴合反應在於使所述試劑的乙烯基與多肽中存在的硫醇基反應。WO 88/0M33中公開的化合物均包含吸電子取代基作為所述含氮芳香雜環的官能團。 還應當注意的是，WO 88/0M33未提供任何表明利用交聯劑使信號產生或細胞毒性化學實體與多肽相連的實施例。WO 2005/024041描述了用於蛋白質組學方法中的對兩個或更多個細胞群中蛋白質加質量標籤的方法。該加標籤方法包括使一個群中的半胱氨酸殘基與2-乙烯基吡啶反應，而另一個群中的半胱氨酸殘基與CV4烷基取代的2-乙烯基吡啶反應，從而產生具有可通過質譜區分之質量的加標籤蛋白質。Banas 等人(Biochimica et Biophysica Acta, 957 (2) 178—84，1988)研究了大腸桿菌(E. coli)磷酸果糖-1-激酶半胱氨酸殘基的反應性，利用乙烯基吡啶、溴代丙酮酸酯和二硫代硝基苯甲酸來確定多肽中存在的6個半胱氨酸殘基的相對反應性。Fullmer (Analytical Biochemistry, 142(2) :336_9，1984)描述了改進肽中胺基酸組成分析的方法，特別是半胱氨酸和色氨酸鑑定的方法。改進之一採用4-乙烯基吡啶來保護二硫鍵還原斷裂之後肽中存在的一半半胱氨酸殘基，因為所產生的半胱氨酸衍生物對酸水解穩定。現有技術中在改善用偶聯伴侶(如PEG分子和聚糖基團)衍生化多肽方面仍然存在問題。

發明內容
概括而言，本發明涉及用例如聚(亞烷基二醇)分子和聚糖基團的部分對多肽進行官能化的化合物及其使用方法。該化學是基於包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑之上的，所述乙烯基取代基能夠與多肽中天然存在的或被引入其中的一個或更多個硫醇基反應，例如通過使用一個或更多個半胱氨酸殘基的硫醇基。一般而言，所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基團共價連接，因此所述乙烯基與多肽中硫醇基之間的反應使得所述多肽與所述聚(亞烷基二醇)分子和/或所述聚糖基團共價連接。因此，在一個方面中，本發明提供了這樣的方法，其包括使具有至少一個反應性硫醇基的多肽與包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑反應，所述乙烯基取代基能夠與多肽中至少一個硫醇基反應，其中所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子和/ 或聚糖基團共價連接，以便所述官能化試劑的乙烯基取代基與所述多肽的硫醇基反應，從而使所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團與所述多肽共價連接。
在另一個方面中，本發明提供了對具有至少一個反應性硫醇基的多肽進行修飾 (例如PEG化或糖基化)的方法，所述方法包括使所述多肽與包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑反應，所述乙烯基取代基能夠與多肽中至少一個硫醇基反應，其中所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基團共價連接，以便所述官能化試劑的乙烯基取代基與所述多肽的硫醇基反應，從而使所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團與所述多肽共價連接。除了使所述官能化試劑與所述多肽反應以將它們連接在一起的步驟之外，本發明的方法還可包括一個或更多個步驟。例如，所述方法可包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑前體與所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團反應以產生所述官能化試劑的起始步驟。作為替代或者補充，所述方法可包括以下起始步驟確定多肽中反應性硫醇基的位置、選擇用於與本發明官能化試劑反應的一個或更多個硫醇基、以及任選地保護剩餘硫醇基中的一些。然後可使所述多肽與本文所述的官能化試劑反應。通過上文應當理解，所述乙烯基與所述多肽硫醇基的反應通常產生-CH2-CH2-S-基團，其使所述官能化試劑與所述多肽共價連接。在該反應中產生的硫醚鍵在生物條件下通常非常穩定。該穩定性可與現有技術中使用馬來醯亞胺作為交聯劑形成對比，使用馬來醯亞胺作為交聯劑具有潛在缺點，當用其對多肽進行衍生化時，多肽在儲存過程中發生反應，例如開環。在其中所述多肽不包含合適的硫醇基或者所述多肽鏈的所期望位置中不包含合適的硫醇基的本發明實施方案中，本發明可包括對母體多肽進行修飾的起始步驟，例如通過化學反應或定點突變產生在所述多肽的一個或更多個期望位置上具有硫醇基的變體多肽。優選地，這是通過用半胱氨酸殘基替代所述多肽中一個或更多個胺基酸來實現的。在涉及多肽糖基化的本發明實施方案中，可對所述母體多肽的天然糖基化位點進行修飾，例如對天冬醯胺、蘇氨酸或絲氨酸殘基進行修飾，以引入之後可與包含一個或更多個聚糖基團的官能化試劑反應的硫醇基。這是可以進行的，例如當母體多肽的該位點未糖基化時(例如作為其所產生之方式的結果)，或者當糖基化已被除去時。作為替代或者補充，本發明方法可包括對與反應性硫醇基空間上接近的胺基酸殘基進行修飾以提高硫醇基對官能化試劑的反應活性。例如，可對空間上接近的胺基酸殘基進行修飾來改變所述反應性硫醇基周圍的局部PH、氫鍵相互作用、水化(waters of hydration)、或空間可接近性。優選地，所述反應性硫醇基(不論其是天然存在於多肽中還被引入的)是半胱氨
酸胺基酸殘基的一部分。在進行上文所述的方法後，然後可在一個或更多個其它步驟中對所述PEG化或糖基化多肽進行純化或分離。在又一個方面中，本發明提供了下式所示的用於用聚(亞烷基二醇)或聚糖基團對多肽進行官能化的化合物
權利要求
1.一種用於修飾具有至少一個反應性硫醇基的多肽的方法，所述方法包括使所述多肽與包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑相接觸，所述乙烯基取代基能夠與所述多肽的至少一個硫醇基反應，其中所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團共價連接，使得所述官能化試劑的乙烯基取代基與所述多肽的硫醇基反應，從而使所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團與所述多肽共價連接。
2.一種方法，其包括使具有至少一個反應性硫醇基的多肽與包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑相接觸，所述乙烯基取代基能夠與所述多肽的至少一個硫醇基反應，其中所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團共價連接，使得所述官能化試劑的乙烯基取代基與所述多肽的所述硫醇基反應，從而使得所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團與所述多肽共價連接。
3.權利要求1或權利要求2的方法，還包括使包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑前體與所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團反應來產生所述官能化試劑的初始步驟。
4.前述權利要求中任一項的方法，其中所述聚(亞烷基二醇)分子是聚乙二醇(PEG) 分子。
5.前述權利要求中任一項的方法，其中所述含氮芳香雜環是吡啶環、嘧啶環或疊氮環。
6.前述權利要求中任一項的方法，還包括確定所述多肽中反應性硫醇基的位置，以及任選地將其中的一些進行保護。
7.前述權利要求中任一項的方法，還包括通過化學反應或通過定點突變以產生在所述多肽的一個或更多個期望位置上具有硫醇基的變體多肽來對母體多肽進行修飾的起始步驟。
8.前述權利要求中任一項的方法，其中所述硫醇基存在於半胱氨酸殘基中。
9.前述權利要求中任一項的方法，其中所述包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑以下述通式表示
10.權利要求9的方法，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一個是N。
11.權利要求9或權利要求10的方法，其中R1或&之一包含聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團。
12.權利要求9或權利要求10的方法，其中R1和&都包含聚(亞烷基二醇)分子和/或聚糖基團。
13.權利要求9或權利要求10的方法，其中R1和&之一包含聚(亞烷基二醇)分子並且R1和&中另一個包含聚糖基團。
14.權利要求9至13中任一項的方法，其中用於使所述聚(亞烷基二醇)分子和/或所述聚糖基團與所述含氮芳香雜環相連的所述札和/或&基團獨立地選自-(CH2)n-Z-(CH2) 。-R 或-C (O)-Z-(CH2)。-R。
15.權利要求9至13中任一項的方法，其中在所述隊和&基團中，ο是0並且所述基團可表示為-(CH2) n-Z-R 或-C (0) -Z-R。
16.前述權利要求中任一項的方法，其中所述官能化試劑以下述通式之一表示其中至少R1以及任選地&與聚(亞烷基二醇)分子和/或聚糖基團共價連接；並且進一步地其中R1以及任選地&獨立地選自-(CH2)n-Z-(CH2)。-C(0)-R，其中 Z 是 0、S 或 NH，n 是 0 至 10，o 是 0 至 10，並且其中 R 是氫、聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團；或者-(CH2)n-Z-(CH2)。-R，其中Z是0、S或ΝΗ，η是0至10，ο是0至10，並且其中R是氫、 聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團；或者-C(0)-Z-(CH2)。-R，Z是0、S或ΝΗ，ο是0至10，並且其中R是氫、聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團；或者-(CH2)n-Z-C(0)-(CH2)。-R，其中 Z 是 0、S 或 ΝΗ，η 是 0 至 10，ο 是 0 至 10，並且其中 R 是氫、聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團；或者-Y-(CH2)n-Z-C (O)-(CH2)。-R，其中 Y 是芳基基團、0、S 或 NH，Z 是 0 或 ΝΗ，η 是 0 至 10， ο是0至10，並且其中R是氫、聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團；或者-Y-R，其中Y是0或S，R是氫、聚糖、聚(亞烷基二醇)分子、芳基或C1,烷基；前提是當&不與聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團相連時，其可另外選自氫或吸電子基團，例如滷素(F、Cl 或 Br)、-NO2, -CO2H, -CO2R4, COR4, -CHO, _CN、-CF3> -SO2NR4Ii5、烷基或苯基，其中R4和&獨立地選自氫或C1,烷基。
17.前述權利要求中任一項的方法，其中所述聚糖是用於使所述多肽糖基化的碳水化合物基團。
18.權利要求17的方法，其中所述糖基是天然或合成的單糖、寡糖或多糖。
19.權利要求17或權利要求18的方法，其中所述聚糖是N-連接或0-連接的糖基。
20.權利要求1至19中任一項的方法，其中所述聚(亞烷基二醇)分子基團的分子量為 IkDa 至 50kDa。
21.前述權利要求中任一項的方法，其中所述聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團與所述多肽綴合以改變所述多肽的藥理學特性。
22.權利要求21的方法，其中所述藥理學特性是所述多肽的穩定性、生物半衰期、水溶性和/或免疫學性質。
23.前述權利要求中任一項的方法，其中所述多肽是促紅細胞生成素、幹擾素、白細胞介素、趨化因子、淋巴因子、細胞因子、胰島素、單克隆抗體或其片段、重組抗體或其片段、凝血因子、集落刺激因子、生長激素、纖溶酶原激活因子、病毒衍生肽、生殖激素、治療性酶或用於綴合物疫苗的載體蛋白。
24.權利要求23的方法，其中所述綴合物疫苗是在載體蛋白與一個或更多個作為抗原性多糖的聚糖基團之間形成的。
25.下式所示的用於使用聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團對多肽進行官能化的化合物
26.權利要求25的化合物，其中X和Y都是CH或者X和Y之一是CH而另一個是N。
27.權利要求M或權利要求25的化合物，其中所述聚(亞烷基二醇)分子是聚乙二
28.權利要求25至27中任一項的化合物，其中R1或&之一包含聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團。
29.權利要求25至27中任一項的化合物，其中R1和&包含聚(亞烷基二醇)分子和/或聚糖基團。
30.權利要求25至27中任一項的化合物，其中R1和&之一包含聚(亞烷基二醇)分子並且R1和&中另一個包含聚糖基團。
31.權利要求25至30中任一項的化合物，其中用於使所述聚(亞烷基二醇)分子和 /或所述聚糖基團與所述含氮芳香雜環相連的所述R1和/或&基團獨立地選自-(CH2) n-Z- (CH2)。-R 或者-C (0) -Z- (CH2)。-R。
32.權利要求25至30中任一項的方法，其中在R1和&基團中，ο是0並且所述基團可表示為-(CH2) n-Z-R 或-C (0) -Z-R。
33.下述通式之一所示的用於用聚(亞烷基二醇)分子或聚糖基團對多肽進行官能化的化合物
34.通過使權利要求25至33中任一項的化合物與多肽的一個或更多個硫醇基反應而形成的綴合物。
35.通過使權利要求25至33中任一項的化合物與多肽的一個或更多個硫醇基反應而形成的綴合物，其用於醫學處理方法。
36.權利要求35的用於處理方法的綴合物，其中所述處理是治療或診斷。
37.權利要求35的用於處理方法的綴合物，其中所述綴合物是疫苗。
38.權利要求37的用於處理方法的綴合物，其中所述疫苗是在載體蛋白和一個或更多個作為抗原性多糖的聚糖基團之間形成的。
全文摘要
本發明公開了用聚(亞烷基二醇)分子和聚糖基團對多肽進行官能化的試劑和方法，其基於包含具有乙烯基取代基的含氮芳香雜環的官能化試劑，所述乙烯基取代基能與天然存在於所述多肽中的或者引入所述多肽中的一個或更多個硫醇基反應(例如利用一個或更多個半胱氨酸殘基的硫醇基)。所述官能化試劑與聚(亞烷基二醇)分子(例如聚乙二醇(PEG)分子)或聚糖基團共價連接，使得所述乙烯基與所述多肽中硫醇基之間的反應將所述多肽與所述聚(亞烷基二醇)分子和/或所述聚糖基團共價連接。
文檔編號A61K47/48GK102317305SQ200980154905
公開日2012年1月11日 申請日期2009年12月21日 優先權日2008年12月19日
發明者安德魯·格雷厄姆·沃茨, 特倫斯·坎特納, 阿曼達·芭芭拉·麥肯齊 申請人:巴斯大學