一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建的製作方法
2023-07-24 22:22:21 2
一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建，屬於酶工程領域。通過把釀酒酵母TDH3啟動子序列、酵母分泌信號肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個胺基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列按順序合成，在兩端加上限制性內切酶位點，通過酶切構建到pPIC9K質粒中，再將該質粒轉化到酵母中得到具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，其生產柚苷酶的回收率達到92%，發酵後柚苷酶的酶活達到5.0U/g溼酵母。本發明實現了柚苷酶生產和同步濃縮回收的一步完成，降低了能源消耗，降低了成本，具有較強的實用性。
【專利說明】一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建
[0001]
【技術領域】
[0002]本發明屬於酶工程領域，具體涉及一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建。
【背景技術】
[0003]中國柑桔的產量僅僅比美國和巴西低，柑桔的產量排列在世界第三位。利用柑桔生產的果汁飲料具有含糖量高，風味清香醇和等特點。而且柑桔果汁具有易於榨取等便於工業化生產和加工的特點，可以用來生產果酒等高附加值的產品。但是柑桔果汁常常具有很濃烈的苦味，該苦味大大限制了果汁的利用和產品的推廣。去除苦味的柑桔果汁，才能有更廣闊的市場和利用空間。
[0004]利用柚苷酶可以把果汁中的苦味有效地去除掉。柚苷酶的生產有固體發酵和液體發酵兩種方法。固體發酵雖然酶的濃度高，但是其傳質和傳熱阻力非常大。傳質和傳熱阻力大的固體發酵，非常不利於大規模的工業化生產，因為其溫度和酸度等在工業化規模中不容易控制。
[0005]液體發酵具有發酵體積大，易實現自動化控制等特點，因而液體發酵在許多產品的生產上體現出巨大優勢。特別是在現在勞動力成本上升，國際大力推進機械化和自動化背景下，液體發酵具有 更廣闊的空間。柚苷酶的生產也有越來越傾向於液體發酵。但是液體發酵生產的酶類產品濃度低。生產的柚苷酶等都游離在發酵醪液中，為得到高濃度的柚苷酶的固體粉末，需要對發酵醪液進行濃縮。為純化濃縮纖維素酶往往需要通過真空蒸發或噴霧乾燥等工藝來濃縮纖維素酶。在纖維素蒸發濃縮或噴霧乾燥的過程中，柚苷酶的活性喪失一部分，而且濃縮工藝大幅度提高了纖維素酶的生產成本。在蒸發或噴霧乾燥的過程中，消耗大量的能源如電或燃氣等。因此降低濃縮成本，成為降低液體發酵生產柚苷酶生產成本的必然選擇。
【發明內容】
[0006]本發明的首要目的在於克服現有技術的缺點與不足，提供一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株。
[0007]本發明的另一目的在於提供用於構建上述酵母菌株的DNA片段。
[0008]本發明的再一目的在於提供用於構建上述酵母菌株的質粒。
[0009]本發明的目的還在於提供上述酵母菌株的構建方法。
[0010]本發明的目的通過下述技術方案實現:
用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個胺基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列；上述序列分別如SEQID N0.1~5所示。
[0011]優選的，所述的用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段的序列如SEQ ID N0.6所示。
[0012]用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒為包含上述DNA片段的真核表達質粒。所述的真核表達質粒優選為pPIC9K質粒。
[0013]所述的用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒通過包含如下步驟的方法製備得到:合成兩端有限制性內切酶識別位點含有上述DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。所述的真核表達質粒PPIC9K質粒時，限制性內切酶優選為Aat II和Not I。
[0014]一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，含有上述質粒。所述的酵母菌株優選為酵母菌株SMDl 168。
[0015]所述的具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的構建方法，包括如下步驟:製備酵母電轉化感受態細胞，將上述質粒通過電轉化轉進酵母中得到。
[0016]本發明相對於現有技術具有如下優點和效果:
本發明的酵母菌株能在生產柚苷酶的同時，把柚苷酶吸附在菌株自身表面，通過簡單過濾，就能達到濃縮柚苷酶的目的。
[0017]本發明大大簡化了柚苷酶的濃縮工藝，降低了能源消耗，大幅度降低了成本，因此該發明具有較強的實用性。
[0018]本發明把柚苷酶基因在酵母內表達，並實現了柚苷酶生產和同步濃縮回收的一步完成，現有技術未有相關報導，具有較高的創新性。
[0019]本發明酵母菌株生產柚苷酶的回收率達到92%，發酵後柚苷酶的酶活達到5.0 U/g溼酵母。
【具體實施方式】
[0020]下面結合實施例對本發明做進一步詳細的描述，但本發明的實施方式不限於此。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。
[0021]實施例1
(l)pPIC9K質粒的提取
I)接1%含PPIC9K質粒的大腸桿菌細胞於2 mL LB培養基。
[0022]2)37 °C振蕩培養 12 h。
[0023]3)取1.5 mL菌液於EP管，以4000 rpm離心3 min,棄上清液。
[0024]4)加 0.1 mL 溶液 I (1% 葡萄糖，50 mM EDTA pH 8.0,25 mM Tris-HCl pH 8.0)充分混合。
[0025]5)加入0.2 mL溶液II (0.2 mM NaOH, 1% SDS),輕輕翻轉混勻，置於冰浴5 min。
[0026]6)加入0.15 mL預冷溶液111(5 mol/L KAc, pH4.8),輕輕翻轉混勻,冰浴5 min。
[0027]7)以10000 rpm離心20 min，取上清液於另一新EP管中。
[0028]8)加入等體積的異戊醇，混勻後靜置10 min。
[0029]9)再以 10000 rpm 離心 20 min,棄上清。
[0030]10)用70%乙醇0.5 mL洗滌一次,抽乾所有液體。[0031]11)待沉澱乾燥後，溶於0.05 mL TE緩衝液中。
[0032](2)大腸桿菌DH5a感受態細胞的製備
I)將大腸桿菌DH5a置於LB或其他營養豐富的培養基上，在37 °C下過夜培養。
[0033]2)高溫滅菌大的離心瓶(250~500 mL)以備第二天搖瓶用。
[0034]3)準備幾瓶滅菌水(總量約1.5升)，保存於冷凍室中以備第二天重懸浮細胞用。
[0035]4)轉移0.2~I mL過夜培養物至裝有20 mL LB (或其他營養豐富的培養基)的100 mL搖瓶。
[0036]5)37 1:下劇烈振蕩培養6小時。
[0037]6)監控0D600值(培養I小時後每半小時測定一次)。
[0038]7)當0D600值達到0.5~1.0時，從搖床中取出搖瓶，置於冰上冷卻15分鐘。
[0039]8)細胞在4 V 5000g下離心15分鐘，棄上清液。
[0040]9)用滅菌的冰水重懸浮細胞，先用渦旋儀或吸液管重懸浮細胞於少量體積中(幾毫升)，然後加水稀釋至離心管的2/3體積。
[0041]10)照上面步驟重複離心，小心棄去上清液。
[0042]11)照上面步驟用滅菌的冰水重懸浮細胞。
[0043]12)離心，棄上清液。
[0044]13)用20 mL滅菌的、冰冷後的10%甘油重懸浮細胞。
[0045]14)照上面步驟離心，小心棄去上清液(沉澱可能會很鬆散)。
[0046]15)用10%甘油重懸浮細胞至最終體積為2~3 mL。
[0047]16)將細胞按150 μ L等份裝入微量離心管，於-80 °C保存。
[0048](3) pPIC9K-Naringinase 粒構建
I)用限制性內切酶Aat II ,Not I分別酶切質粒PPIC9K。限制性內切酶Aat I1、Not I(TAkaRA)各 1.5 μ?，提取的 pPIC9K 質粒溶液 6 μ?, IOXK Buffer I μ? 加入到 100 μ? EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切60 min。再通過瓊脂糖凝膠電泳回收酶切的質粒pPIC9K，回收條帶為9.25 kb左右。
[0049]2)序列合成
合成兩端具有Aat II和Not I識別序列的序列，序列包括CCGACGTC-釀酒酵母TDH3啟動子序列-釀酒酵母分泌信號肽編碼序列-柚苷酶編碼序列-釀酒酵母凝聚因子C端的400個胺基酸片段編碼序列-釀酒酵母TDH3終止子序列-GCGGCCGCGG，各片段及全長片段如SEQ ID N0.1~6所示。
[0050]3)連接
合成的鹼基序列 20 μ?, Aat I1、Not I (TAkaRA) 12 μ?, IOXK Buffer 加入到 400 μ?EP管中，在30 °C水浴鍋中酶切80 min，酶切後，取序列酶切液15μ?，酶切的pPIC9K質粒5μ?, Τ4 DNA ligase (TAkaRa) 5μ?，IOXbuffer 5μ?, ddH20 ΙΟμ?，加入 100 μ? EP 管中，16
°C連接過夜。
[0051]4)將上述連接產物電轉化到大腸桿菌DH5 α，電轉化具體方法如下:
4.1)在冰上解凍大腸桿菌DH5 α感受態細胞添加I~10 μ L連接產物，冰上放置約5分鐘。
[0052]4.2)轉移連接產物/細胞混合物至冷卻後的2mm電穿孔容器中。[0053]4.3)加載電轉化儀，準備好300 yLLB*2XYT。
[0054]4.4)對電穿孔容器進行脈衝(200歐姆，25 μ F，2.5千伏)，檢查時間常數，應該在3以上。
[0055]4.5)立即添加300 μ L的LB或2ΧΥΤ至電轉杯中。
[0056]4.6)37 °C下培養細胞40分鐘至I小時以復甦。
[0057]4.7)復甦後離心棄掉150 μ L上清，剩餘150 μ L重懸菌體塗布到含有氨苄(100Kg/mL)的LB或2XYT培養基的固體平板上，於37 °C培養過夜。
[0058]5)挑去固體平板上生長的單克隆，通過培養，提取質粒，用Aat II和FspA I對質粒進行酶切鑑定，鑑定正確的質粒再進一步測序，得到質粒pPIC9K-Naringinase。
[0059](4)酵母感受態細胞的製備
1)挑一環酵母菌(SMD1168)接種於5 mL YEPD培養基中，30 V 250~300 rpm培養過夜得到一級種子。
[0060]2)取I mL—級種子分別接種於兩瓶50 mL YEPD培養基中，30 V 250~300 rpm培養約 16 ~18 h (0D600 約 1.3 ~1.5)。
[0061]3)於4 °C離心收集菌體，用25 mL冰預冷無菌水洗滌一次後，細胞用10 mL冰預冷無菌水重懸，可換成較小的離心管。
[0062]4)加入I mL pH 7.5的10XTE緩衝液，搖晃均勻，再加入I mL IOXLiAc,旋轉搖勻，於30 1:輕輕搖動45 min。
[0063]5)再加入0.4 mL 1mol/L DTT，並同時旋轉搖動，於30 °〇輕輕搖動15 min。
[0064]6)於4 °C離心，棄上清(用槍吸)，再用25 mL冰預冷無菌水洗滌。
[0065]7) 2.5 mL冰預冷的I mol/L山梨醇洗滌，離心收集菌體，棄上清(用槍吸)。
[0066]8)每管用100 yL I mol/L山梨醇溶解，分裝於3個EP管中(80 yL/管)，於_70°C冰箱保存。
[0067](5) pPIC9K-Naringinase 質粒電轉化酵母
1)向酵母感受態細胞中加入約5~10 μ g (體積小於10 μ L) pPIC9K_Naringinase質粒，用槍吹吸均勻，轉移至預冷的電轉杯中，靜置5min。
[0068]2)擦乾電轉杯，電擊，電擊參數:1.5 KV，25 yF，200歐姆。
[0069]3)立即加入I mL冰預冷的I mol/L山梨醇，轉移至離心管中，於30 °C靜置lh。
[0070]4)離心，棄上清，加入I mL YEPD後，於30 °C>200 rpm培養2 h。
[0071]5)離心得菌體後，吸除550 μ L上清液，然後取150 μ L塗100 Pg/mL氨苄YETO板於30 °C培養至長出轉化子。
[0072](6)酵母轉化子發酵
挑取的轉化子在YEro培養基中30 °C培養24 h，以10%接種量(v/v)接種於發酵培養基(酵母浸膏10 g/L，蛋白腖20 g/L，50 mM檸檬酸緩衝液，麩皮200 g/L，羥甲基纖維素20g/L，l L水)中。發酵在500 mL搖瓶中發酵，裝液量為20% (v/v)。在發酵培養基中培48h0
[0073](7)柚苷酶的回收
發酵液在離心機中4000 r/m離心10 min，收集上清(上清中有游離的柚苷酶，用於柚苷酶回收率的計算)，按酵母沉澱溼重與蒸餾水質量比1:10的比例加入蒸餾水，用蒸餾水洗滌兩次，收集酵母沉澱，柚苷酶吸附在酵母表面。
[0074](8)柚苷酶酶活測定:試管中分別加入2 mL pH 4.0,0.1 M醋酸一醋酸鈉緩衝溶液，2 mL質量濃度400 mg/L的柚皮苷溶液，40 °C下保溫5 min，加入預先稀釋的酶液I mL，保溫10 min，立即用沸水浴滅活10 min，高效液相色譜法測定剩餘柚皮苷的量，通過計算可得柚皮苷的減少量。色譜條件:色譜柱為大連依利特C18 Hypersil (250 mmX4.6 mm, 5Ixm);流動相為甲醇:5%乙酸溶液(55:45);流速I mL/min ;檢測波長283 nm ;柱溫30 °C。
[0075]酶活定義為:在40 °C，pH值4.0條件下，每分鐘分解I Pg柚皮苷的酶量為I U。
[0076]柚苷酶回收率(％)=酵母沉澱吸附的酶活/(上清液的酶活+酵母沉澱吸附的酶活)X 100%O
[0077]經過測定柚苷酶的回收率達到92%，發酵後柚苷酶的酶活達到5.0 U/g溼酵母。柚苷酶較高的回收率，說明在發酵的時候，構建的酵母能很好的富集濃縮柚苷酶，實現了發酵和濃縮的一步完成。
[0078]上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都 包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的DNA片段，其特徵在於:包括按順序排列的釀酒酵母TDH3啟動子序列、釀酒酵母分泌信號肽編碼序列、柚苷酶編碼序列、釀酒酵母凝聚因子C端的400個胺基酸片段編碼序列、釀酒酵母TDH3終止子序列。
2.根據權利要求1所述的DNA片段，其特徵在於:所述的序列分別如SEQID N0.1~5所示。
3.根據權利要求1所述的DNA片段，其特徵在於:所述的DNA片段的序列如SEQIDN0.6所示。
4.用於構建具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株的質粒，其特徵在於:為包含權利要求1-3任一項所述的DNA片段的真核表達質粒。
5.根據權利要求4所述的質粒,其特徵在於:所述的真核表達質粒為pPIC9K質粒。
6.根據權利要求4所述的質粒，其特徵在於通過包含如下步驟的方法製備得到:合成兩端有限制性內切酶識別位點含有權利要求1-3任一項所述的DNA片段的序列，通過限制性內切酶連接到真核表達質粒上。
7.根據權利要求6所述的質粒,其特徵在於:所述的真核表達質粒為pPIC9K質粒時，限制性內切酶為Aat II和Not I。
8.一種具有生產和回收柚苷酶雙重功能的酵母菌株，其特徵在於:包含權利要求4-7任一項所述的質粒。
9.根據權利要求8所述的酵母菌株，其特徵在於:所述的酵母菌株為酵母菌株SMDl168。
10.權利要求8或9所述的酵母菌株的構建方法，其特徵在於包括如下步驟:製備酵母電轉化感受態細胞，將權利要求4-7任一項所述的質粒通過電轉化轉進酵母中得到。
【文檔編號】C12N1/19GK103789332SQ201410084899
【公開日】2014年5月14日 申請日期:2014年3月10日 優先權日:2014年3月10日
【發明者】薛棟升, 陳茂彬, 汪江波 申請人:湖北工業大學