一種來源於新疆沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
2023-07-25 01:30:41 2
專利名稱：一種來源於新疆沙冬青的i型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其克隆方法
技術領域：
本發明涉及來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因及其對應編碼的胺基酸，此外本發明也涉及到這些基因的克隆方法。
背景技術：
新疆沙冬青新疆沙冬青(Ammopiptanthus nanus Cheng f.)又名矮沙冬青、小沙冬青、矮黃花木，屬於豆科(Leguminosae)、黃華族(Thermopsideae)、沙冬青屬(Ammopiptanthus Cheng f.),為第三紀孑遺植物,被列為國家一級保護植物。主要分布在海拔1800 2800m的乾旱荒山和石質戈壁類型的內蒙古西部和寧夏、甘肅、新疆的部分沙 漠、荒漠地帶，是該區唯一的常綠闊葉灌木，分布區內氣候乾旱，降水量遠小於蒸發量，年平均氣溫6. 8°C，氣溫變化極值可達70°C以上。沙冬青具有很強的抗逆性，在相對瘠薄的土壤條件下仍能在高達70°C左右的地表沙溫和低至零下20°C 30°C的環境中正常生長發育。有很強的抗寒、抗旱和耐鹽鹼等抗逆特性。國內外關於沙冬青屬植物的報導包括生理生化特性的研究、抗寒、抗旱機理及相關的超微結構；染色體數目及核型、減數分裂期染色體行為、開花物候、和引種栽培試驗等。這些研究都證實了沙冬青抗旱耐凍的特性，因此它是珍貴的抗旱耐凍遺傳資源。I型液泡膜焦磷酸酶是由單個亞基組成的位於液泡膜上利用焦磷酸鹽(PPi)勢能作為能量在細胞內部各個腔室形成質子梯度的蛋白。I型液泡膜焦磷酸酶基因的表達與非生物脅迫有關，能提高植物耐鹽和乾旱脅迫的耐受力型液泡膜焦磷酸酶能夠調節植物激素的轉運，進而調節由這些植物激素所介導的生長發育過程，並且受到植物激素(如，脫落酸)的調控。新疆沙冬青作為優秀的抗逆植物，克隆以上抗逆基因對基礎和應用研究具有重要意義。
發明內容
本發明的主要目的就是針對荒漠抗逆植物新疆沙冬青的抗逆基因開發研究的局限性，提供來源於植物新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列及其開放閱讀框序列，以期應用於其它轉基因作物中使之具有相應的優良的抗逆性能。本發明的另一個目的是提供一種上述基因序列的克隆方法。為了實現上述發明目的，本發明採用的技術方案如下一種來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該序列具有如SEQ IDNO. I所述的核苷酸序列以及該基因對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。上述核苷酸序列，可通過包括下述步驟的方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取總RNA、設計引物、進行PCR擴增、測序等克隆得到(I)總RNA的提取和純化
可採用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取得到純化的新疆沙冬青葉片總RNA;常用的RNA提取方法很多，如試劑盒法、熱硼酸法、異硫氰酸胍法、苯酚法、十二烷基硫磺酸鈉法、十六烷基三甲基溴化銨法、及各種改進方法等，均可用於新疆沙冬青葉片總RNA的提取；本發明中可優選試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAot2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)，進行新疆沙冬青葉片總RNA提取。純化主要是為了去除總RNA中的DNA汙染，獲得純化的新疆沙冬青葉片總RNA，以滿足後續對目的基因的表達進行定量檢測等需要。常用的RNA純化方法包括DNA酶消化法(簡稱D法)、酸酚變性法(簡稱S法)、EDTA法(簡稱E法)等；本發明中可優選DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAqut2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。
(2)中間片段的克隆A、中間片段cDNA第一鏈的合成以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)試劑盒中 3' RACE Adaptor 進行反轉錄，得到的cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板；B、PCR 擴增以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述兼併上遊引物(jf3)和兼併下遊引物(jx3)，進行PCR擴增。I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增引物jf3 5/ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3'，jx3 5/ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3'；擴增得到新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。本步驟中，擴增體系可優選為TaqPlusPCR Master Mix20 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(jx3/jf3)I μ L，ddH2016 μ L。擴增程序可優選為95 °C, 3min ；95°C，30s, 58。。，30s, 72°C，Imin (35 個循環)；72°C，8min ;4°C 保溫。(3)3'端的克隆C、3' -outer PCR 擴增根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3' outer,以前述步驟(2) A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3' -outer 和 TaKaRa 公司 3' Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code D314)試劑盒中3'端下遊引物3' RACE outer,進行3'端outer PCR擴增:I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上遊outer引物
GSP3-3' -outer :5' -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'；3'端下遊引物 3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；擴增得到的產物為cDNA 3'端；本步驟中，擴增體系可優選為IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序可優選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 個循環)72°C, 8min ；4°C 保溫。D、3' -inner PCR 擴增根據前述步驟⑵所得中間片段端序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3;-inner，以前述步驟C所得:V端的outer PCR產物模板，利用特異性上遊引物GSP3-3'-inner 和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中3'端下遊引物3' -RACE inner,進行3'端inner PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上遊inner引物GSP3-3/ -i nner 5/ -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'；3'端下遊引物 3' -RACE inner 3' -RACE i nner :5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'；擴增得到的產物為cDNA 3'端inner PCR產物，通過克隆測序，得到3'端完整序列；本步驟中，擴增體系可優選為dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,31 -outer PCR 產物2 μ L,2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2(25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq(5U/μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序可優選為95 °C, 3min ；
、
95°C，30s ；55°C, 30s ；72°C，Imin 30s (35 個循環)72°C,8min ;4°C保溫。
(4)5'端的克隆E、合成5'端的cDNA第一鏈以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter後，以Random Decamers進行反轉錄5 ' RACE Adapt er :5 , -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；
合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈；F、5' -outer PCR 擴增根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5' -outer,以前述步驟E所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物 GSP3-5' -outer 和FirstChoice RLM-RACE Kit 試劑盒中的 5'端上遊引物 5' -RACEouter,進行 5'端 outer PCR 擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下遊outer引物GSP3-5' -outer 5/ -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'；5'端上遊引物 5' -RACE outer 5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；擴增得到的產物為cDNA 5'端；本步驟中，擴增體系可優選為
cDNA 模板IyL
10X PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X 引物(GSP3-5,-outer/5'-RACE outer)2 μ L
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I.25 μ L
ddH2034.75 μ L。擴增程序可優選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 個循環)；72°C，8min ;12°C保溫。G、5' -inner PCR 擴增根據前述步驟(2)所得中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5; -inner，以前述步驟F所得Y端的outer PCR產物模板，利用特異性下遊引物GSP3-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit試劑盒中 5'端上遊引物5' -RACE inner,進行5 』端inner PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下遊inner引物GSP3-5' -inner 5/ -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3'；
5'端上遊引物 5' -RACE inner 5' -RACE i nner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'；擴增得到的產物為cDNA 5'端inner PCR產物，通過克隆測序，得到5'端完整序列；本步驟中，擴增體系可優選為
5'-outer PCR 產物I μ L
IOX PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X 引物(GSP3-5'-inner/5^-RACE inner)2 uL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I. 25 μ L
ddH2034. 75 μ L。擴增程序可優選為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，lmin/kbp (35 個循環)；72°C，8min，12°C 保溫。(5)全長序列拼接和基因分析將上述步驟⑵所得中間片段、步驟(3)所得3'端inner PCR擴增序列和述步驟
(4)所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟體進行完整序列的拼接，然後通過NCBI裡ORF finder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。(6) I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆將上述步驟(5)所分析的完整基因序列作為模板，設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，並進行PCR擴增I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增引物0RF3-S 5/ -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'，0RF3-A 5/ -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3;；擴增得到的產物為完整的新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。本步驟中，擴增體系可優選為dNTP Mixture (2. 5mM each)4 μ L,2 X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I μ L，cDNA 模板lyL，5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ μ L) 0. 5 μ L,ddH2032. 5 μ L0I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優選為98°C,30s ；62°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環)；
與現有技術相比，本發明的有益效果是本發明是一種來源於植物新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列是新的基因序列，使人們對這些基因的研究對象從細菌及其他植物體進一步擴展到新疆沙冬青。並且，根據在新疆沙冬青植物的這些基因所具備的優良的抗旱、耐鹽等性能可以預料如果將其通過轉基因技術導入玉米等其他植物的基因中，將可培育出具有相應的優良的抗旱、耐鹽等性能的植物新品種。
圖I為AnVPl基因電泳檢測結果圖，圖2為AnVPl基因中間片段電泳檢測結果圖， 圖3為AnVPl基因3'端inner PCR電泳檢測結果圖，圖4為AnVPl基因5'端inner PCR電泳檢測結果圖。
具體實施例方式下面結合具體實施方式
對本發明的上述發明內容作進一步的詳細描述。但不應將此理解為本發明上述主題的範圍僅限於下述實施例。在不脫離本發明上述技術思想情況下，根據本領域普通技術知識和慣用手段，做出各種替換和變更，均應包括在本發明的範圍內。在下述各實施例中，將新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶簡稱為AnVPl。通過各實施例，最終得到來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶核苷酸序列(如SEQ ID NO. I所述)及其對應的胺基酸序列(如SEQ ID NO. 2所述)。實施例I本實施例為新疆沙冬青葉片總RNA的提取和純化，總RNA提取使用北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAOUIVci提取試劑盒，CAT#90404-50，包括下述步驟(I)估算組織細胞的用量。每次微量提取一般需要100-200mg植物葉片或50-100mg植物種子或200-500mg植物果實。 (2)先將新鮮植物組織剪切成小塊(保存在RNAL0CKER中的植物組織需用紙吸去RNAL0CKER液體後再剪切成小塊)，放入10_15mL塑料離心管中，加入ImL 65°C預熱的溶液A(用前需要搖晃混勻)，然後用勻漿器勻漿5-20秒。勻漿時會產生泡沫，但不影響提取效果。也可以使用液氮硯磨法破碎植物組織，硯磨完後加入ImL溶液A,但效果比較差，因為研缽本質是二氧化矽，在溶液A存在時會吸附RNA。(3)將勻漿物或硯磨物轉移至乾淨的I. 5mL塑料離心管中(可以不必轉移非液體的細胞碎片)。有的植物組織(比如果實)含有大量水份，勻漿液會多於lmL，轉移時也只取 ImL。(4)在離心管中加入O. 3mL的溶液B和O. 2mL自備氯仿，在振蕩器上振蕩30秒混勻，此時溶液呈均勻的乳濁狀。振蕩器振蕩時必須使管底溶液震蕩起來。(5)室溫12000rpm離心3-5分鐘，兩相間有約5mm厚的細胞破碎物。(6)將上清液(約0.6mL)轉移到另一乾淨的I. 5mL塑料離心管中，下層有機相和中間層含有DNA、蛋白質和其他雜質，避免觸及或吸取。最好留下IOOuL上清液不取。
(7)加入等體積的溶液C，充分顛倒混勻。(8)將一半溶液轉移到離心吸附柱(60911B)中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄穿透液。注意不要跟用於RNA提取的吸附柱(60911D)混用。(9)將剩下的一半溶液轉移到同一離心吸附柱中，12000rpm室溫離心半分鐘，棄
穿透液。(10)將O. 7mL通用洗柱液加入到離心吸附柱中，12000rpm室溫離心10-30秒，棄
穿透液。(11) 12000rpm室溫離心10秒以便去除殘留液體。 (12)將 IOuL(IOU)的 RNase-free DNase 加入到 50uL37°C預熱的DNA膜反應液中，吹打混勻配製成DNase工作液。(13)將DNase工作液在37°C預熱I分鐘，然後全部加入到離心吸附柱中，室溫放置5分鐘。注意5分鐘一般足夠降解大多數情況下的DNA汙染。如果DNA沒有徹底降解(可能由於樣品中殘留的雜質抑制了 DNase的活性)，此步的保溫時間可以適當延長到10分鐘或15分鐘。(14)直接在離心吸附柱中加入O. 7mL通用洗柱液，蓋上蓋後顛倒數次混勻。(15) 12000rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(16)再加O. 3mL通用洗柱液到離心吸附柱，12000rpm室溫離心半分鐘,棄穿透液。(17) 12000rpm室溫離心半分鐘。此步十分重要，否則殘留乙醇會影響RNA的使用。(18)將離心吸附柱轉移到RNase-free收集管中，加入30_50uL RNA洗脫液，室溫放置1-2分鐘。(19) 12000rpm室溫離心半分鐘，離心管中溶液即為RNA樣品。本產品提供的離心吸附柱吸附力較強，一次洗脫不能全部將膜上RNA洗下，如有必要，可以再加入30-50uLRNA洗脫液一次。實施例2本實施例為新疆沙冬青總RNA的反轉錄，其反轉錄得到的cDNA第一鏈用於基因中間片段和3'端擴增的模板，按照Takara公司的3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0, Code D314試劑盒說明書進行cDNA第一鏈合成。實施例3本實施例為AnVPl基因中間片段的克隆，方法如下以蒺藜苜蓿(FJ176929. I)為詢問序列，參考百脈根(EF440187. I)、綠豆(AB009077. I)、大豆(AK285283. I)和豇豆(U31467. I)序列設計兼併引物 jf3/jx3 jf3:5' -GCCCAAARGAGCTTTCACTY-3 ；jx3:5' -GAAGMARGTGACCRGGAAGG-3'。以實施例2的cDNA第一鏈為模板，以設計的兼併引物jf3和jx3進行AnVPl基因cDNA中間片段的擴增。TaqPlusPCR Master Mix20 μ L
cDNA 模板2 μ L擴增體系為
2Χ引物(jx3/jf3)I UL
ddH2016 μ L擴增程序為95°C，5min；95°C，30s，58°C，30s，72t，lmin(35 個循環)；
72°C，8min ;4°C 保溫。取所得擴增產物20 μ L經I %非變性瓊脂糖凝膠100V電泳30min，GoLdenView染色後紫外線檢測擴增片段，結果如圖2所示。擴增得到的產物為AnVPl基因cDNA中間片段，通過包括下述步驟的方法克隆測序，得到的中間片段序列如SEQ ID NO. 3所述①目的片段的回收與純化將擴增出來的特異條帶用乾淨刀片在紫外光下快而準確的從瓊脂糖中挖出，置於I. 5mL離心管中，用凝膠回收試劑盒(OMEGA公司的E. Z. N. A. TM GeL Extraction Kit)回收膠中的DNA片段；②連接反應將回收的DNA片段克隆於TaKaRa公司的pMD19_T載體中。連接反應採用連接試劑盒(Takara公司)，擴增體系總體積10 μ L，16°C連接過夜；③感受態細胞的製備I、從LB平板上挑取新活化的E. coLi DH5 α單菌落，接種於3_5mL LB液體培養基中，37°C，225r/min振蕩培養12h左右，直至對數生長後期。將該菌懸液以I : 100-1 50的比例接種於IOOmL LB液體培養基中，37°C振蕩培養2_3h至0D600 = O. 35-0. 5左右；II、將培養液轉入離心管，冰上放置lOmin，然後於4°C下3000r/min離心IOmin ；III、棄去上清，用預冷的O. 05moL/L的CaCL2溶液IOmL輕輕懸浮細胞，冰上放置15_30min 後，4°C下 3000r/min 離心 IOmin ； IV、棄去上清，加入4mL預冷含15%甘油的O. 05moL/L的CaCL2溶液，輕輕懸浮細胞，冰上放置幾分鐘，即成感受態細胞懸液；V、感受態細胞分裝成100μ L的小份，貯存於-70°C可保存半年；④質粒DNA的轉化I、從_80°C冰箱中取出一管大腸桿菌感受態細胞DH5ci，置於冰上融化；II、在無菌條件下加入10 μ L連接反應液，輕輕震搖混勻後，在冰上放置30min ；
III、42°C水浴熱擊90s，不要搖動，之後迅速放入冰浴冷卻2_3min ；IV、加入890 μ L無Amp的LB液體培養基，混勻後，37°C、150r/min搖床振搖培養，溫育Ih ；V、取100 μ L已轉化的菌液塗於一個LB/Amp的培養平板上，正面朝上放置30min，待菌液完全被培養基吸收後，用封口膜封住，然後倒轉培養皿，37°C避光培養12-16h ;隨後篩選陽性菌落；⑤重組菌落的鑑定與保存
從外觀上看，一般白色且圓的菌落為陽性，通過菌液PCR進一步鑑定I、在過夜培養的平板上用滅菌的小槍頭挑取幾個白色菌落，分別點種於含O. lg/LAmp的LB液體培養基的I. 5mL離心管中，37°C，150r/min振搖培養4_6h ；II、取I μ L菌懸液作為模板，用引物jfl/jxl進行PCR擴增，PCR反應條件中裂解時間延長至5min，用I %的非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增產物。如果產物為目的條帶時，此菌落為陽性克隆，否則為陰性。同時設不加菌懸液的陰性對照；III、取已經鑑定的陽性克隆的菌落懸浮液750 μ L，加入250 μ L的滅菌甘油，混勻後，用液氮速凍，置於-80°C冰箱中保存備用；IV、最後送英俊生物技術公司測序，所得序列在NCBI的BLastn進行比對分析，驗證克隆片段是否正確。
實施例4本實施例為AnVPl基因3'端的克隆，方法如下(1)3/ -outer PCR 擴增根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3' outer,以實施例2所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3' -outer和 TaKaRa 公司 3' Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下遊引物3' -RACE outer,進行 3'端 outer PCR 擴增GSP3-3/ -outer :5' -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'；3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'；擴增體系為IXcDNA Dilution Buffer II8 μ L,cDNA 模板2yL，2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer)I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0擴增程序為95 °C, 3min ；95°C, 30s ；55°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環)72°C,8min ； 4°C保溫。(2) 3' -inner PCR 擴增根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3' inner,以上述(I)所得outer PCR產物為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3' -inner和TaKaRa公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下遊引物 3' RACEinner,進行 3'端 inner PCR 擴增GSP3-3' -inner 5/ -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'；3' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3 ；擴增體系為
dNTP Mixture (2. 5mM each)8 μ L,cDNA 模板2 μ L，2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner) I μ L,10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4μ L,MgCl2 (25mM)3 μ L,TaKaRa LA Taq (5U/ μ I)0. 25 μ L,ddH2028. 75 μ L0
擴增程序為95 °C, 3min ；95°C, 30s ；60°C, 30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環)；72°C，8min ;4°C 保溫。取所得擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖3所示。擴增得到的產物為AnVPl基因3 ^端cDNA完整序列inner PCR產物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的3'端cDNA完整序列如SEQ ID NO. 4所述。實施例5本實施例為5^端擴增的cDNA第一鏈合成以實施例I純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter後，以Random Decamers進行反轉錄5 ' RACE Adapt er :5 , -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAk-3'；合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈；實施例6本實施例為AnVPl基因5'端的克隆，包括下述步驟(I) 5' -outer PCR 擴增根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5'-outer,以實施例5所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5'-outer 和試劑盒FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 中上遊引物5' -RACEouter,進行 5'端 outer PCR 擴增GSP3-5' -outer 5/ -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'；5' -RACE outer 5/ -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'；擴增體系為cDNA 模板I μ L
IOX PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2X引物(GSP3-5,-outer/5'-RACE outer)2 uL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5 U/μ L)I. 25 μ L
ddH2034. 75 μ L。擴增程序為95 °C, 3min ；95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環)；72°C，8min ;12°C保溫。(2) 5' -inner PCR 擴增根據實施例3得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5丨-inner,以上述⑴所得outer PCR產物為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5' -inner和試劑盒FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 中上遊引物5' -RACEinner,進行 5'端 inner PCR 擴增GSP3-5' -inner 5/ -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3;；5' -RACE inner 5/ -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3 ；擴增體系為
b' -outer PCR 產物IuL
10X PCR Buffer5 μ L
dNTP Mix4 μ L
2Χ引物(GSP3-5'-inner/5^-RACE inner)2 yL
ThermostabLe DNA poLymerase(0. 25 μ L of 5U/μ L) I.25 μ L
ddH2034.75 μ L。擴增程序為95°C，3min;95°C，30s ；60°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環)；72°C，8min ;12°C 保溫。取所得擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖4所示。擴增得到的產物為AnVPl基因5'端cDNA完整序列inner PCR產物，通過克隆測序(同實施例3)，得到的5'端cDNA完整序列如SEQID NO. 5所述。實施例7本實施例為AnVPl基因全長序列序列拼接和基因分析，包括下述步驟將上述實施例3所得中間片段、實施例4所得3'端inner PCR擴增序列和實施例6所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟體進行完整序列的拼接，然後通過NCBI裡ORF finder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。實施例8本實施例為AnVPl基因克隆,方法如下以實施例7的基因分析設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，以實施例5所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板進行PCR擴增0RF3-S :5' -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'，0RF3-A :5' -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3'；擴增體系為
dNTP Mixture (2. 5mM each)4 U L,2X 引物(0RF3-S/0RF3-A)IU L,cDNA 模板luL，5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 U L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase (2. 5U/ U L) 0. 5 U L,ddH2032. 5 U L0擴增程序為98°C，30s ；62°C，30s ；72°C，2min 30s (35 個循環)；取所得擴增產物經I %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖I所示。擴增得到的產物為完整的AnVPl基因序列，如SEQ ID NO. I所述；其對應的胺基酸序列如SEQ ID NO. 2所述。
權利要求
1.一種來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，該基因具有如SEQ ID NO. I所述的核苷酸序列。
2.根據權利要求I所述的序列，其特徵在於該基因的所述的核苷酸序列對應的胺基酸序列如SEQID NO. 2所述。
3.依照權利要求I所述的一種來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法，包括下述主要步驟 (1)總RNA的提取和純化 採用各種通用的RNA提取方法和純化方法，從植物新疆沙冬青葉片中提取得到純化的新疆沙冬青葉片總RNA ； (2)中間片段的克隆 A、中間片段cDNA第一鏈的合成 以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，使用TaKaRa公司3' -FullRACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3' RACE Adaptor 進行反轉錄，得到的 cDNA第一鏈，作為下述步驟B中PCR擴增的模板； B、PCR擴增 以前述步驟A所得中間片段的cDNA第一鏈作為模板，利用下述上遊引物(jf3)和下遊引物(jx3)，進行PCR擴增。
I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增引物 jf3 5/ -GGTCTTCTATGGCTTTGTTYGG-3'， jx3 5/ -TRGCAGARAACCAGTAAGGRAG-3,； 擴增得到新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因cDNA中間片段，通過克隆測序，得到中間片段序列。
(3)3'端的克隆 C、3'-outer PCR 擴增 根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3' outer,以前述步驟(2)A所得的cDNA第一鏈為模板，利用特異性上遊引物GSP3-3' -outer和TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2· 0 (Code :D314)試劑盒中 3 '端下遊引物3' RACE outer,進行 3'端 outer PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上遊outer引物GSP3-3' -outer 5/ -TCGCTGTTGGTCTCTGGGCAGGGCTTAT-3'； 3'端下遊引物3' -RACE outer 3' -RACE outer 5/ -TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3'； 擴增得到的產物為cDNA 3'端； D、3'-inner PCR 擴增 根據前述步驟(2)所得中間片段端序列，設計併合成特異性上遊引物GSP3-3' inner,以前述步驟C所得:V端的outer PCR產物模板，利用特異性上遊引物GSP3-3' -inner和 TaKaRa 公司 3' -Full RACE Core Set Ver. 2. 0 (Code :D314)試劑盒中 3'端下遊引物3' RACE inner,進行 3'端 inner PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因3'端的特異性上遊inner引物GSP3-3' -inner :5' -CCATTGGTTCTGCCGCCCTTGTGTCTTT-3'； 3'端下遊引物3' -RACE inner 3' -RACE inner :5' -CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3'； 擴增得到的產物為cDNA 3'端inner PCR產物，通過克隆測序，得到3'端完整序列； (4)5'端的克隆 E、合成5'端的cDNA第一鏈 以上述步驟(I)純化的新疆沙冬青葉片總RNA作為模板，經過Ambion公司FirstChoice RLM-RACE Kit，SKU# :AM1700 試劑盒對 RNA 處理，加入下述 5' RACE Adapter後，以Random Decamers進行反轉錄5' RACE Adapt er :5, -GCUGAUGGCGAUGAAUGAACACUGCGUUUGCUGGCUUUGAUGAAA-3,；合成得到反轉錄產物5'端的cDNA第一鏈； F、5'-outer PCR 擴增 根據上述步驟(2)得到的中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5' outer,以前述步驟E所得反轉錄產物的cDNA第一鏈為模板，利用特異性下遊引物GSP3-5' -outer和FirstChoice RLM-RACE Kit試劑盒中的5'端上遊引物5' RACE outer，進行5'端outer PCR 擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下遊outer引物GSP3-5' -outer :5' -TAAGCAAGCAAACAAGGATACCCACAG-3'； 5'端上遊引物5' -RACE outer 5' -RACE outer :5' -GCTGATGGCGATGAATGAACACTG-3'； 擴增得到的產物為cDNA 5'端； G、5'-inner PCR 擴增 根據前述步驟(2)所得中間片段序列，設計併合成特異性下遊引物GSP3-5' -inner,以前述步驟F所得5'端的outer PCR產物模板，利用特異性下遊引物GSP3-5' -inner和FirstChoice RLM-RACE Kit 試劑盒中 5'端上遊引物 5' -RACE inner，進行 5'端 innerPCR擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因5'端的特異性下遊inner引物GSP3-5' -inner :5, -GGAAGCAACAACGAGAGCGGCACAGGA-3,； 5'端上遊引物5' -RACE inner 5' -RACE inner :5' -CGCGGATCCGAACACTGCGTTTGCTGGCTTTGATG-3'； 擴增得到的產物為cDNA 5'端inner PCR產物，通過克隆測序，得到5'端完整序列； (5)cDNA全長序列拼接和克隆 將上述步驟⑵所得中間片段、步驟⑶所得3'端inner PCR擴增序列和步驟(4)所得5'端inner PCR擴增序列用DNAman軟體進行完整序列的拼接，然後通過NCBI裡ORFfinder工具分析開放閱讀框，即完整的基因序列。
(6)I型液泡膜焦磷酸酶基因的克隆 將上述步驟(4)合成5'端的cDNA第一鏈作為模板，根據上述步驟(5)的基因分析設計上遊引物0RF3-S和下遊引物0RF3-A，並進行PCR擴增 I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增引物0RF3-S :5' -ATGGGTGCAGCCATTCTCCC-3'， 0RF3-A :5' -TTAGATCTTGAAGAGTAAGCCACCATG-3'； 擴增得到的產物為完整的新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因，通過克隆測序，即得其基因序列。
4.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(I)中，採用的RNA提取方法為試劑盒法(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAott2. O提取試劑盒，CAT#90404-50);純化方法為DNA酶(北京天恩澤基因科技有限公司的柱式植物RNAQUT2. O提取試劑盒，CAT#90404-50)消化法。
5.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟⑵中進行PCR擴增時，擴增體系可優選為 TaqPlusPCR Master Mix20U L, cDNA 模板2 u L, 2X 引物(jf3/jx3)IuL, ddH2016u L ； I型液泡膜焦磷酸酶基因中間片段擴增程序分別可優選為95°C,3min ；95°C，30s, 58°C，30s, 72°C，Imin (35 個循環)； 72°C，8min ;4°C保溫。
6.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(3)中進行3'-outerPCR擴增時， 擴增體系可優選為 IXcDNA Dilution Buffer II8 u L, cDNA 模板2 u L, 2X 引物(GSP3-3, -outer/3' -RACE-outer) I u L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4u L, MgC12(25mM)3u L, TaKaRa LA Taq(5U/U I)0. 25U L, ddH2028. 75 u L0 擴增程序可優選為95°C,3min ；95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環) 72°C，8min ;4°C保溫。
7.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(3)中進行3'-innerPCR擴增時， 擴增體系可優選為 dNTP Mixture(2. 5mM each)8 u L, 3' -outer PCR 產物2 y L， 2X 引物(GSP3-3, -inner/3' -RACE-inner) I u L, 10XLA PCR Buffer II(Mg2+Free)4u L,MgCl2 (25mM)3 u L, TaKaRa LA Taq (5U/U I)0. 25U L, ddH2028. 75 u L0 擴增程序可優選為95°C,3min ；95°C, 30s ；55°C,30s ；72°C, Imin 30s (35 個循環) 72°C，8min ;4°C保溫。
8.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(4)中進行5'-outerPCR擴增時， 擴增體系可優選為 cDNA 模板I u L IOX PCR Buffer5 n L dNTP Mix4 uL 2X引物(GSPS-Sf-Outer/^'-RACE outer)2 uLThermostabLe DNA poLymerase (0. 25 u Lof 5U/ u L) I. 25 ii L ddH2034. 75 P L； 擴增程序可優選為95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環)；72°C，8min ;12°C 保溫。
9.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(4)中進行5'-innerPCR擴增時， 擴增體系可優選為 5'-outer PCR 產物I u L IOX PCR Buffer5 u L dNTP Mix4 u L 2 X 引物(GSPS-S'-inner/S'-RACE inner)2 uL ThermostabLe DNA poLymerase個(0.25 y L of 5U/U L)I.25 P L ddH2034. 75 u L； 擴增程序可優選為95°C,3min ；95°C, 30s ；60°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環)；72°C，8min，12°C 保溫。
10.根據權利要求3所述的克隆方法，其特徵在於所述的步驟(6)中進行PCR擴增時，擴增體系可優選為dNTP Mixture(2. 5mM each)4 μ L,.2 X 引物(0RF3-S/0RF3-A)I μ L，cDNA 模板I μ L,.5 X PrimeSTAR Buffer (Mg2+plus)10 μ L,PrimeSTAR HS DNA PLoymerase(2. 5U/μ L)0. 5 μ L, ddH2032. 5 μ L0I型液泡膜焦磷酸酶基因擴增程序可優選為.98°C, 30s ；62°C,30s ；72°C,2min 30s (35 個循環)。
全文摘要
本發明公開了一種來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶的基因序列，該基因具有如SEQ ID NO.1所述的核苷酸序列。上述基因編碼的I型液泡膜焦磷酸酶具有如SEQ ID NO.2所述的胺基酸序列。此核苷酸序列是新的基因序列。本發明還公開了一種上述來源於新疆沙冬青的I型液泡膜焦磷酸酶基因序列的克隆方法。
文檔編號C12N9/14GK102676556SQ201210148680
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月15日 優先權日2012年5月15日
發明者於好強, 付鳳玲, 劉豔萍, 李晚忱, 鄧龍群, 雍太明 申請人:四川農業大學