一種產角蛋白酶的單胞菌及其應用的製作方法

2023-07-24 21:26:11 1

專利名稱：一種產角蛋白酶的單胞菌及其應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種產角蛋白酶的單胞菌及其應用，尤其是一種產角蛋白酶的的單胞菌的篩選和應用。
背景技術：
角蛋白酶(Keratinase)是一種可以特異性降解角蛋白的酶類，可以由細菌、放線菌和真菌等多種微生物產生。常見的角蛋白為動物的毛髮，如牛毛、羊毛和人發等，羽毛作為家禽飼養和屠宰工業的副產物每年產量巨大，且蛋白質和胺基酸含量豐富，是潛在的優良蛋白質資源。在傳統利用羽毛過程中主要採用酸鹼水解。熱降解等方法，前者存在汙染環境問題，後者對能源消耗比較大，且可以破壞部分胺基酸，降低了產品的營養價值。羽毛的合理利用一方面可以減少廢棄物對環境的汙染，同時可以作為一種飼科蛋白質應用於畜禽的飼養。在紡織工業中，羊毛有時候會發生氈縮現象。目前處理羊毛鱗片多採用氯化法等化學方法，或採用雙氧水進行預處理，對環境造成了汙染。而在應用生物處理法時採用蛋白酶進行單一處理對羊毛質地損害較大。採用角蛋白酶和蛋白酶共同處理可以達到既可以減少羊毛鱗片又可以不損害羊毛自身質地的效果。此外，角蛋白酶可「消化」導致狂牛症和人類克雅氏症的毒蛋白，從而可應用於醫療和實驗儀器的淨化；它還可用於皮革脫毛鞣製，配製潤膚露、浴皂、洗髮水和脫毛膏等美
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發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種產角蛋白酶的單胞菌，該菌株為嗜麥芽寡養單胞菌Gtenotrophomonas maltophilia)BBEll_l，於2011年6月9日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No =M 2011193，以其16SrDNA全序列為基礎的系統發育樹如說明書附圖1所示。所述嗜麥芽寡養單胞菌發酵用培養基組成如下葡萄糖lOgL—1，酵母粉5gL_i，羽毛 SgL—1，磷酸二氫鉀lgL—1，磷酸氫二鉀SgL-1PH 9 ；發酵條件為發酵條件優選為pH 9、培養溫度25°C。本發明具有如下有益效果1)本發明提供的菌株，具有在Mh內高效降解羽毛的優點，優於國內外所報導的可以降解羽毛角蛋白的菌株；2)採用本發明所篩選的菌株對單一羽毛培養基進行降解，經分析後可以產生17 種胺基酸，並含有動物自身不能合成的稀有胺基酸，可以代替大豆滿足家禽所用飼料。3)採用本發明篩選的菌株所產角蛋白酶的粗酶液，與蛋白酶共同處理，在蛋白酶濃度一定的情況下增加角蛋白酶粗酶液的濃度可以對羊毛鱗片得到較好的處理，可應用於紡織行業。


圖 1 嗜麥芽寡養單胞菌 Gtenotrophomonas maltophilia)BBEll-I 的系統發育樹圖2 採用所篩菌株對單一羽毛培養基進行降解Mh的效果培養基為羽毛含量為2(^171的單一羽毛無機鹽培養基，A三角瓶為未處理羽毛，B三角瓶為單胞菌處理Mh的效果。圖3 嗜麥芽寡養單胞菌發酵上清液對羊毛去鱗的處理效果A 未處理羊毛纖維B 蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量10% owfC:蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量30% owfD 蛋白酶用量2% owf，角蛋白酶用量80% owf
具體實施例方式實施例1產角蛋白酶菌株的篩選方法1.採樣地點為當地家禽飼養場，將採樣所得土壤或汙泥樣品，分別加入到盛有 20mL滅菌水和玻璃珠的三角瓶中，置37°C搖床混勻、打碎做成菌懸液；2.將菌懸液加入到初篩培養基中，37°C 200轉，直至羽毛降解為止，傳代三次。初篩培養基羽毛10，K2HPO4,1. 4，KH2PO4 0. 7，NaCLO. 5，MgSO4 · 7H20 0. 1， ρΗ7·0-7·2。(g/1)3.吸取上清液進行梯度稀釋，取10_4、10_6、10_6 3個稀釋度塗布脫脂牛奶平板。塗布後37 °C倒置培養48h ；4.選取透明圈較大的點種於脫脂牛奶培養基中。從形態上分辨及透明圈大小可以篩選出6株菌。5.將以上牛奶平板中透明圈較大的在LB培養基上劃線純化並保藏於甘油管中。6.將以上菌株接種到含有完整羽毛的三角瓶中進行進一步篩選。選出降解較強時間較快的菌株，後進行菌種鑑定。將以上6株菌分別接種於羽毛無機鹽培養基中觀察羽毛降解情況，其中有兩株菌可以降解羽毛，但有一株菌降解速度較慢。另一株菌在M小時內可以對羽毛實現大部分降解，確定此株菌為最終篩選菌株，並測序鑑定為嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)。實施例2產角蛋白酶菌株的初步發酵條件確定選取不同的溫度、pH、氮源、碳源和無機鹽，對所篩菌發酵條件進行初步確定，發酵時間定為40h，結果見表1。酶活測定吸取ImL適當稀釋的酶液，加入ImL 0. 05mol/LTtis-Hcl緩衝液 (PH7.5)及底物(羽毛粉)5mg，40°C培養60min，加入2mL 4M TCA溶液以終止反應，放置 20min後過濾掉不溶物。離心5min，吸取0. 5mL上清液移入到新的試管中，後依此加入0. 5mL 福林酚試劑和anL 0. 5M Na2CO3後40°C顯色20min，在660nm處檢測吸光值，吸光值每增加 0.01定義為一個酶活單位。
表1產角蛋白酶菌株的初步發酵條件確定
權利要求
1.一種產角蛋白酶的單胞菌，為嗜麥芽寡養單胞菌(Stenotrophomonas maltophilia) BBE11-1，於2011年6月9日保藏於中國典型培養物保藏中心，保藏編號為CCTCC No =M 2011193。
2.權利要求1所述的單胞菌應用於紡織原料加工。
3.權利要求2所述的應用，其特徵在於所述嗜麥芽寡養單胞菌發酵上清粗酶液與羊毛進行反應處理。
4.根據權利要求2所述的應用，其特徵在於所述嗜麥芽寡養單胞菌發酵用培養基組成如下葡萄糖lOgL—1，酵母粉5β Λ羽毛SgL—1，磷酸二氫鉀lgL—1，磷酸氫二鉀Sgr1pH 9。
5.根據權利要求3所述方法，其特徵在於發酵條件優選為pH9、培養溫度25°C。
6.權利要求1所述的單胞菌應用於飼料添加劑製備。
全文摘要
本發明公開了一種產角蛋白酶的單胞菌及其應用，所篩產角蛋白酶菌株可以在24h以內高效降解羽毛，經發酵初步優化后角蛋白酶活力可以達到150U/mL。對所降解羽毛經過胺基酸分析後發現可產多種胺基酸，可以代替大豆等糧食作物作為飼料的主要氮源。同時，該菌發酵酶液對羊毛也具有較好的處理效果。本發明篩選的產角蛋白酶單胞菌在飼料及紡織行業均具有良好的應用前景。
文檔編號C12N1/20GK102329751SQ20111028165
公開日2012年1月25日 申請日期2011年9月21日 優先權日2011年9月21日
發明者劉柏宏, 堵國成, 張娟, 陳堅 申請人:江南大學