糖基化胰島素及其藥物組合物和製備方法

2023-07-20 19:48:31

專利名稱：糖基化胰島素及其藥物組合物和製備方法
技術領域：
本發明具體涉及糖基化胰島素及其組合和含有這類糖基化化合物的藥物製劑及其製備方法。
近年來有人建議將一些胰島素類似物用於治療糖尿病。研究這類胰島素類似物的目的則是通過製備可用胰島素，促進胰島素取代治療，這類胰島素類似物與特殊的人胰島素相比，具有更有效或更長效的胰島素活性。
通過取代天然胰島素中一個或多個胺基酸殘基所研製的胰島素類似物，其存在的問題是這類化合物的潛在的免疫原性，而從這種取代中，也可產生意想不到的溶解度和穩定性。
儘管胰島素在血液循環中的半衰期非常短促，但不能排除少量胰島素在體內糖基化，這不僅在糖尿病患者中如此，而且在非糖尿病患者中也是這樣，正如Nakayama等人所預測的(在Sakamoto，Min和Baba編著的「CurrenttopicsinClinicalandexperimentalaspectsofdiabetesmellitus」1985，201-204，Else-vierSciencePublisherB.V.中的胰島素的非酶糖基化一文)。因此可能有機體具有發育機理，以抑制對糖基化胰島素的抗體的形成。
葡萄糖、甘露糖和某些寡糖與胰島素的結合過去已經進行了大量研究，其目的在於搞清楚在體內糖基化胰島素的形成是否會引起糖尿病患者後期併發症。Anzenbacher等(BiochimicaetBiophysicaActa，386，1975，603-607)研究了通過平衡透析D-葡萄糖與胰島素的結合，並無多少特殊的發現，但發現與胰島素分子結合的葡萄糖分子的平均數為8。
Dolhofer等研究了胰島素與葡萄糖和甘露糖的相互作用(FebsLet-ters100，1979，133-136)。結果證明通過37℃下的離體溫育，2個已糖共價結合到胰島素分子中。在經過選擇的反應條件下，每個胰島素分子平均與3.6±0.39葡萄糖和5.0±0.43甘露糖的殘基結合。
Brownlee和Cerami(Science，206，1979，1190-1191，Diabetes，32，1983，499-505)通過合成能與葡萄糖爭奪結合外源凝集素的糖基化胰島素衍生物，提出了葡萄糖控制的胰島素輸送體系。在該研究中，麥芽糖和其他寡糖與胰島素進行反應。
Nakayama等(同上)研究了離體和(糖尿病患者)體內胰島素非酶糖基化的問題，結論認為在病理條件下，葡萄糖與體內的胰島素分子相結合。通過離體研究證明，每個胰島素分子與3個葡萄糖分子結合。
在1988年，Lapolla等報導了離體糖基化胰島素在體內降低了生物活性(Diabetes，37，1988，787-791)。根據Dolhofer(同上)的意見，在37℃水溶液(pH7.4)中，胰島素在周圍高濃度的葡萄糖中糖基化17小時，葡萄糖的結合平均為2mol葡萄糖殘基/mol胰島素。
考慮到天然胰島素有三個游離的伯氨基分別在Bl(Phe)，Al(Gly)和B29(Lys)位上，顯然上述糖基化胰島素製劑會全都是糖基化胰島素分子的不均勻混合物。
至今尚無人採取任何步驟，將上述混合物分離成單個組分。
用於自調節胰島素輸送體系的糖基化胰島素衍生物已由Kim等人作了介紹(JournalofControlledRelease，1，1984，57-66，美國專利申請說明書US-4483792，4478830，4478746和4489063)。在這些糖基化胰島素中，通過由二羧酸、酸酐或苯胺或它們之間的組合，而衍生的間隔基團，使葡萄糖或甘露糖與胰島素偶合。
公開號為119650的歐洲專利申請No.84200328所述半乳糖基胰島素類似於Kim(同上)所述含有間隔基團的糖基化胰島素。
本發明的目的在於製備具有改進性的胰島素衍生物。更具體地說，本發明的目的在於研製非免疫原胰島素衍生物。本發明另一個目的在於研製胰島素起始作用比天然胰島素快的胰島素衍生物，以及提高低溶解度的胰島素的溶解度，從而將高濃度溶液用於例如胰島素泵。本發明的再一個目的在於製備對原纖化有高度穩定性的胰島素衍生物。
本發明提供了特定的糖基化胰島素。以下所述特定的糖基化胰島素係指在胰島素分子的特定位置上具有糖類取代基的胰島素。出乎意料的是這類特定的糖基化胰島素具有一定的治療上的優點，從以下所述和舉例可以明顯地看到。
最廣義地說，本發明提供了特定的糖基化胰島素。較狹義地說，本發明提供了或在A1，B1或B29位上單糖基化、在A1和B1，A1和B29或B1和B29位上二糖基化胰島素衍生物;或在A1，B1和B29位上三糖基化胰島素衍生物。
Kim等以及上述諸人所介紹的糖基化胰島素與本發明的胰島素幾不相同。本發明利用糖本身的醛基形成對胰島素的共價鍵，而不是利用人工的間隔基團。本發明勝過Kim等所述胰島素的另一個優點則是保留了胰島素分子中的中性電荷分布。因此，由糖基化反應(見反應圖)而轉化為仲氨基的氨基像正常胰島素一樣，仍然能夠被質子化。
本發明的胰島素衍生物，在三個位置上的每一個位置均可含單糖或具有多至3個糖殘基的寡糖。適合的單糖系葡萄糖、甘露糖和半乳糖。適合的寡糖系麥芽糖、異麥芽糖、乳糖、麥芽三糖、蜜二糖和纖維素二糖。
本發明特定的糖基化胰島素衍生物可用於治療糖尿病。為了控制胰島素治療，因此也可使用經過選擇的各個特定的糖基化化合物的混合物。
本文所述胰島素既包括天然胰島素，例如人、牛和豬的胰島素，也包括與天然胰島素相比，其中一個或多個胺基酸殘基被取代、加入或失去的天然胰島素衍生物。例見公開號為0194864A和0214826A的歐洲專利申請文件。
如上所述，天然胰島素具有三個可能糖基化的位置，即在A和B鏈上有2個N端胺基酸殘基，在B29位上有1個賴氨酸殘基。顯然，在上述種類的胰島素類似物中，可能糖基化部位的數目可以有2個(2個N端殘基)和2個以上，其數量決定於被修飾的胰島素分子中有多少個賴氨酸殘基。賴氨酸完全是一種天然存在的胺基酸，在其側鏈有1個游離的伯氨基。
用D-葡萄糖進行的糖基化反應路線示於下圖
1脫氧-D-果糖基胰島素(葡萄糖胰島素)
「胰島素」係指脫氨基胰島素。
上述反應也可按類似方法，用具有游離醛基的其他單糖或寡糖進行。
本發明的糖基化胰島素的具體例子有Phe(B1)葡萄糖人胰島素，Phe(B1)甘露糖人胰島素，Gly(A1)甘露糖人胰島素，Lys(B29)甘露糖人胰島素，Phe(B1)半乳糖人胰島素，Gly(A1)半乳糖人胰島素，Lys(B29)半乳糖人胰島素，Phe(B1)麥芽糖人胰島素，Phe(B1)乳糖人胰島素，Gly(A1)葡萄糖人胰島素，Gly(A1)麥芽糖人胰島素，Gly(A1)乳糖人胰島素，Lys(B29)葡萄糖人胰島素，Lys(B29)麥芽糖人胰島素，Lys(B29)乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二葡萄糖人胰島素，Phe(B1)異麥芽糖人胰島素，Gly(A1)異麥芽糖人胰島素，Lys(B29)異麥芽糖人胰島素，Phe(B1)麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)麥芽三糖人胰島素，
Lys(B29)麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二麥芽糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二乳糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二乳糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二麥芽三糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二麥芽三糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二甘露糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二甘露糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二甘露糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二半乳糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二半乳糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二半乳糖人胰島素，Phe(B1)，Gly(A1)二異麥芽糖人胰島素，Phe(B1)，Lys(B29)二異麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Lys(B29)二異麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三葡萄糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三麥芽糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三麥芽三糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三甘露糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三半乳糖人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三異麥芽糖人胰島素，
Phe(B1)葡萄糖[AspB10]人胰島素，Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖[AspB10]人胰島素。
還有源於其他種類(例如豬)的特定的糖基化胰島素也屬頗有意義的胰島素。
本發明糖基化胰島素可以在適當的有機介質或水介質中，通過胰島素或胰島素類似物與過量的單糖或寡糖反應進行製備。溫度的變化範圍可在20-60℃之間。有機溶劑可用低級羧酸，例如乙酸和丙酸;低級脂族醇，例如甲醇，乙醇和2-丙醇，乙二醇和丙二醇。但是也可用酚類。
反應時間和反應混合物的組分決定於所需最終產物是單糖基、二糖基還是三糖基的產物。反應通常可用反相高壓液體色譜法(以下簡稱為RPHPLC)，以測定各個糖基產物的最大生成量。
反應通過冷卻終止(例如-20℃)，反應混合物濃縮至乾燥，通過製備RPHPLC分離純化反應混合物的主要組分。脫鹽後，用快速原子轟擊質譜分析(以下簡稱FAB-MS)，氫硼化物還原後進行胺基酸定量分析和生物測量，測定產物的各種特性。
本發明的糖基化胰島素及其混合物可取代本領域中已知胰島素製劑中的人或豬胰島素，從而製備新的胰島素製劑。這種新的胰島素製劑含有糖基化胰島素或其藥物上可接受的鹽的水溶液，尤以中性pH值為佳。最好用諸如氯化鈉、乙酸鈉或丙三醇，將水介質配製成等滲液。此外，水介質還可含有鋅離子、緩衝組份(例如乙酸鹽或磷酸鹽和防腐劑(例如甲醛、羥苯甲酸甲酯或酚。製劑的pH值可以調整到所需值，製劑可以過濾滅菌。
本發明的胰島素製劑可按類似於已知胰島素製劑的用法使用。
實施例1Phe(B1)葡萄糖人胰島素在室溫下將人胰島素(0.1mmol)懸浮於甲醇(30ml)中，加入冰醋酸(5ml)。該混合物輕微攪拌至胰島素溶解。再加35ml甲醇，然後在加入D-葡萄糖(2.2mmol)後，在40℃下輕微攪拌該混合物8小時，得到命名化合物的主要組份。
將上述溶液在旋轉蒸發器上幾乎濃縮至幹，再將殘渣溶於水，並用製備RP HPCL進行分餾。層析柱為16×250mm，7μM 100
C18顆粒。溫度30℃。移動相。A∶0.04M磷酸，0.2M硫酸鈉，10%乙腈，用乙醇胺將pH調至2.5。B50%乙腈。
將相當於主峰中心部分的餾分脫鹽和凍幹。產量為0.02mmol。產物在氫硼化物還原後用FAB-MS和胺基酸定量分析進行測定。胺基酸分析表明存在著2個苯丙氨酸殘基(即與人胰島素比較，減少1個苯丙氨酸殘基)，證明在Phe(B1)上的取代。分子量的測定值為5970(理論值為5970)。
實施例2Phe(B1)，Gly(A1)二葡萄糖人胰島素按實施例1的方法製備上述化合物，但反應時間是16小時，而不是8小時，得到命題化合物的主要組份。
產量為0.06mmol。
胺基酸分析表明減少了1個Phe殘基和1個Gly殘基，證明A1和B1位上的取代。
分子量的測定值為6132(理論值為6132)。
基本按Jφrgensen等所述碘酸鹽法(Diabetologia 19，1980，546-554)製備125Ⅰ標記Phe(B1)，Gly(A1)二葡萄糖胰島素，將其注射到豬體內，測定其皮下吸收情況。豬皮下注射125Ⅰ人胰島素和125ⅠPhe(B1)，Gly(A1)二葡萄糖人胰島素後，其吸收率示於表1。表1中給出的T75，T50和T25值係指由注射樣品時起至注射部位進行放射性同位素測定時，起始值分別減至75%，50%和25%所需要的時間。由表1可見，糖基化胰島素的吸收顯著快於人胰島素。
表1T75T50T25人胰島素1.122.333.69二葡萄糖人胰島素0.651.472.76豬(平均5頭)皮下注射0.1u/kg的人胰島素(ActrapidTM)和(Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖人胰島素降低血糖的作用示於表2。表2給出了葡萄糖值(mmol/l)。
表2時間(小時)人胰島素二葡萄糖人胰島素-0.335.305.2405.365.320.334.784.760.674.724.0614.123.341.53.602.9823.242.842.53.282.9633.183.1443.343.96表2說明二葡萄糖胰島素的作用快於人胰島素。
人胰島素、牛胰島素和Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖人胰島素在兔體內的免疫應答(10隻兔的平均值)示於表3(兔血清的%結合值)。所用方法按Schlichtkrull等所述(Horm.Metab.Res.Suppl.ser.5，1974，134-143)。
表3時間(天)人胰島素牛胰島素二葡萄糖人胰島素01.9-0.41.2132.30.61.3273.028.51.5413.229.71.4554.330.71.1693.932.72.2832.430.11.1972.032.61.5由表3可見，二葡萄糖人胰島素的免疫應答達到驚人的低，其與人胰島素的免疫應答相同。
實施例3按類似方法製備下列化合物，通過FAB-MS或等離子吸收質譜法測定分子量，各個化合物的理論分子量也一併給出。
分子量化合物測量值理論值Phe(B1)半乳糖人胰島素59565970Phe(B1)麥芽糖人胰島素61196132Phe(B1)乳糖人胰島素，61256132Phe(B1)麥芽三糖人胰島素，62886294Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽糖人胰島素64446456Gly(A1)，Phe(B1)二乳糖人胰島素64566456Gly(A1)，Phe(B1)二麥芽糖人胰島素67716780Gly(A1)，Phe(B1)，Lys(B29)三葡萄糖人胰島素62946294Gly(A1)，Phe(B1)二葡萄糖[AspB10]人胰島素 6112 6110結合糖殘基的位置先後經氫硼化物還原和胺基酸定量分析進行鑑定。
權利要求
1.含有1個或多個單糖基或具有多至3個糖單位的1個或多個寡糖基的特定的糖基化胰島素。
2.按權利要求1的糖基化胰島素，其含有1個單糖基或具有多至3個糖單位的1個寡糖基。
3.按權利要求1的糖基化胰島素，其含有2個單糖基或具有多至3個糖單位的2個寡糖基。
4.按權利要求1的糖基化胰島素，其含有3個單糖基或具有多至3個糖單位的3個寡糖基。
5.按權利要求2的糖基化胰島素，其在A1，B1或B29位上單糖基化。
6.按權利要求3的糖基化胰島素，其在A1和B1，A1和B29，或B1和B29位上二糖基化。
7.按權利要求4的糖基化胰島素，其在A1，B1和B29位上三糖基化。
8.按上述權利要求之一的糖基化胰島素，其在B10位上含有Asp。
9.按上述權利要求之一的糖基化胰島素，其特徵在於母體胰島素系人胰島素。
10.Phe(B1)葡萄糖人胰島素。
11.Phe(B1)，Gly(A1)二葡萄糖人胰島素。
12.一種組合物，含有至少90%、較好至少95%、最好至少99%的上述權利要求之一的特定的糖基化胰島素。
13.藥物製劑，含有上述權利要求之一的特定的糖基化胰島素或其藥物上可接受的鹽和任意的藥物上可接受的佐劑、添加劑和防腐劑。
14.製備上述權利要求1-9之一的特定的糖基化胰島素的方法，其中將適合的胰島素在水或有機介質中與具有游離醛基的單糖或具有游離醛基和多至3個糖單位的寡糖反應，從該反應混合物中分離得到所需產物。
全文摘要
本發明提出了特定的糖基化胰島素和其藥物製劑。新的胰島素最好是單糖、二糖或三糖基化並含有單糖或具有2或3個糖單位的寡糖基的胰島素。與諸如人胰島素相比，特定的糖基化胰島素具有更高的溶解度和更迅速地產生胰島素作用。
文檔編號C07KGK1045586SQ9010128
公開日1990年9月26日 申請日期1990年3月7日 優先權日1989年3月8日
發明者約翰·布洛堡·哈爾斯特龍 申請人:諾沃-諾迪斯克有限公司