移動式色譜柱隔板的製作方法

2023-07-20 19:42:46

專利名稱：移動式色譜柱隔板的製作方法
技術領域：
本發明屬於色譜領域，更具體地屬於採用色譜柱通過色譜法純化多肽的領域。本文報告了一種色譜柱隔板(S印arator)，其可以將色譜柱分成上色譜柱室和下色譜柱室，且所述隔板在色譜柱內具有可變的位置，即，所述隔板可以隨著周圍色譜材料的壓力依賴性壓縮而滑動。
背景技術：
多肽在當今醫療產業組合中具有重要作用。對於人類應用，每種藥用物質必須滿足不同的標準。為了確保生物藥劑對人類的安全性，將會導致嚴重損害的核酸、病毒和宿主細胞蛋白特別需要被去除。為了滿足質量管理規範，一個或多個純化步驟需要遵照製造工藝。其中，純度、產量和收率在確定適當的純化工藝中具有重要作用。在通常的色譜法中，採用色譜柱，所述色譜柱基本上包括具有上配件(fitting) 和下配件的柱殼體，所述柱殼體依次地包括柱頂部處的入口、柱底部處的出口、上色譜柱篩板(frit)、下色譜柱篩板、上分配板和色譜材料。常規的色譜法及其用途對於本領域技術人員是已知的。參見，例如， Chromatography (色譜法)，第 5 片反，Part A !Fundamentals and Techniques (部分 A 基本原理和技術)，Heftmann，Ε·(編輯)，Elsevier Science Publishing Company，紐約， (1992) ；Advanced Chromatographic and Electromigration Methods in Biosciences (生物科學中的色譜法和電遷移法)，Deyl，Z.(編輯)，Elsevier Science BV，阿姆斯特丹，荷蘭，(1998) ；Chromatography Today (當今色譜法)，Poole, C. F.，和 Poole，S. K.，Elsevier Science Publishing Company，紐約，(1991) ；Scopes,Protein Purification Principles and Practice (蛋白質純化原理和實踐)(1982) ；Sambrook, J.，等(編輯)，Molecular Cloning :A Laboratory Manual (分子克隆實驗室指南)，第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press,冷泉港,N. Y. , 1989 ；或Current Protocols in Molecular Biology (現代分子生物學實驗技術)，Ausubel，F. Μ.，等(編輯)，John Wiley & Sons，Inc.，紐約。為了純化已經通過例如細胞培養法製備的免疫球蛋白，通常採用不同色譜步驟的組合。通常蛋白A親和色譜法後緊接著進行一個或兩個額外的分離步驟。最後的純化步驟是所謂的「精細純化步驟(polishing st印)」以去除痕量的雜質和汙染物，如聚集的免疫球蛋白、殘留的HCP(宿主細胞蛋白)、DNA(宿主細胞核酸)、病毒或內毒素。對於該精細純化步驟，通常使用流通模式的陰離子交換材料。在WO 2006/048514中，報導了一種容器，其包括開口的、形狀互補的上端部和下端部和膜濾器，其中色譜混合物置於所述容器中，所述膜濾器固定於所述容器的下端部。在 US 6，458，273中報導了一種高通量液相色譜柱組件，其包括與具有分離室的分離柱流體連通的具有加樣室的加樣柱，所述加樣柱具有第一內徑和第一長度，所述分離柱的直徑小於所述加樣柱的內徑且長度大於所述加樣柱的長度。高壓液相色譜柱報導於US 4,719,011中，其可以被模塊化地修改長度和/或內徑並且在模塊化系統中可以包含其他部件，例如，柱區段(column section)、用於連接不同內徑的柱區段的轉接器和錐形轉接器，和用於注入或排出流體的端板構件。EP 1 916 522中報導了一種柱裝置，其包括具有多個粒子的固定相，其適於與流動相相互作用以便分離溶解在流動相中的樣品流體中的不同化合物；用於至少部分地容納固定相的殼體；和分離固定相的各區段並且與所述殼體強制連接的隔板。在WO 00/010675中報導了分段式色譜柱，其包括多個被多個多孔構件分隔並限定邊界的介質床。在US 3，398，512中報導了一種色譜設備。在US 3，453，811中報導了其中具有分配元件的色譜柱。在EP-A 1 892 5 中，報導了一種色譜柱和使用所述色譜柱的筒式色譜柱。在US 3，657，864中報導了一種用於解析揮發性混合物的分離系統。發明概述本文報導的此隔板允許更換上色譜柱室中的色譜材料而無需更換下色譜柱室中的色譜柱材料，其還允許，例如，在一個色譜柱內組合具有不同的色譜功能基團的兩種不同的色譜材料，並且在隔板的存在下，可以提供更多的均勻填充的色譜柱。此外，本文報導的隔板減少了色譜柱施加的背壓，即，其減少了色譜柱內部的壓力。在添加至柱填充物的每個隔板處，壓降減小。作為一個方面，本文報導了用於液相色譜柱中的環形導向環，其特徵在於所述導向環具有包括兩個軸向對稱的橫截面區域(5和6)的垂直橫截面，其中每個所述軸向對稱的橫截面區域具有a)錐形結構，其中所述錐形是從所述導向環的外部向內部逐漸變細，和b)用於安裝篩板的凹口(8)，所述凹口具有指向所述導向環內部的開口。在一個實施方案中，所述凹口是矩形凹口。在進一步的實施方案中，每個所述橫截面區域具有三角形形狀且最長邊(7)的長度為所述凹口(8)的直徑的至少1.5倍。在進一步的實施方案中，所述環由橡膠、塑料、聚矽氧烷、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯製成。如本文報導的另一方面是如本文報導的導向環用於將篩板安裝至圓筒形液相色譜柱中的用途。另一個方面是一種色譜柱隔板，其包括如本文報導的導向環和安裝至所述導向環中的篩板。在一個實施方案中，所述篩板是a)單個篩板，或b)具有上篩板和下篩板的雙篩板。在另一個實施方案中，a)所述篩板具有1 μ m至20 μ m的孔徑，或b)每個所述篩板彼此獨立地具有1 μ m至20 μ m的孔徑，由此所述上篩板的孔徑小於所述下篩板的孔徑。在另一個實施方案中，所述篩板由金屬、聚矽氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、燒結物料或它們的組合製成。在進一步的實施方案中，所述隔板包括距離固定件(distance holder), 所有距離固定件均與所述隔板的一側連接。在一個實施方案中，所述色譜柱隔板的特徵在於a)所述隔板將色譜柱分隔成上色譜柱室和下色譜柱室，並且b)所述隔板通過沿色譜柱的內壁滑動在色譜柱內具有可變的位置。在一個實施方案中，所述色譜柱隔板包括一個篩板，在另一個實施方案中，所述隔板包括上篩板和下篩板。在進一步的實施方案中，所述色譜柱隔板或所述上篩板或所述下篩板的孔徑為1 μ m至20 μ m，由此上篩板的孔徑小於所述下篩板的孔徑。在另一個實施方案中，所述篩板由金屬、聚矽氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、燒結物料或它們的組合製成。在一個實施方案中，所述色譜柱隔板具有連接至一側的3個或更多個距離固定件。在一個具體實施方案中，所述距離固定件連接到具有較大孔徑的色譜柱隔板的一側。如本文報導的另一個方面是如本文報導的色譜柱隔板用於將色譜柱分成多個室的用途。如本文報導的進一步方面是如本文報導的色譜柱隔板用於將色譜柱分隔成上色譜柱室和下色譜柱室的用途。還有另一個方面是如本文報導的色譜柱隔板用於將色譜柱中的色譜材料分隔成兩個不同的部分的用途。如本文報導的再一個方面是如本文報導的色譜柱隔板用於分隔一個色譜柱中兩種不同的色譜材料的用途。如本文報導的進一步方面是根據本發明的色譜柱隔板用於將包含色譜材料的色譜柱分隔成兩個分開的室，由此所述色譜柱隔板被包埋在色譜柱中的色譜材料中的用途， 如本文報導的色譜柱隔板用於將包含色譜材料的色譜柱分隔成兩個分開的室，由此所述色譜柱隔板分隔一個色譜柱中兩種不同的色譜材料的用途。如本文報導的還有的另一個方面是包括至少一個，S卩，一個或多個如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱。在一個實施方案中，所述色譜柱包括一個或兩個色譜柱隔板。在此方面的進一步實施方案中，任一色譜柱隔板與第一種色譜材料接觸並與第二種色譜材料接觸，由此所述第一種和第二種色譜材料是a)具有相同的色譜功能基團且具有相同或不同粒度的色譜材料，或b)具有不同的色譜功能基團的色譜材料。如本文報導的另一個方面是色譜柱用於純化多肽的用途，所述色譜柱包括至少一個如本文報導的色譜柱隔板。如本文報導的另一個方面是色譜柱施加裝置，由此所述裝置在其底部處具有與如本文報導的色譜柱隔板的上表面形狀相反的形狀和小於所述導向環的外徑的直徑。發明詳述本文報導了一種用於液相色譜柱中的環形導向環，其特徵在於所述導向環具有包括兩個軸向對稱的橫截面區域的垂直橫截面，其中每個所述軸向對稱的橫截面區域具有a)錐形結構，其中所述錐形是從所述導向環的外部向內部逐漸變細，和b)用於安裝篩板的凹口，所述凹口具有指向所述導向環內部的開口。報導了一種色譜柱隔板，其用於將色譜柱中的色譜材料分隔成兩個分開的部分， 由此a)所述隔板將色譜柱分隔成上色譜柱室和下色譜柱室，和b)所述隔板在色譜柱內具有可變的位置，和c)所述隔板包埋在所述色譜材料中。在柱色譜法中，通過色譜分離法經由與色譜材料的相互作用將至少一種或多種目的多肽，即待純化的一種或多種多肽，與不感興趣的其他多肽和物質分開。術語「多肽」表示天然或合成產生的、由通過肽鍵連接的胺基酸殘基組成的聚合物。少於約20個胺基酸殘基的多肽可以稱為「肽」。包含一條或多條胺基酸鏈或一條具有 100個以上的胺基酸殘基的胺基酸鏈的多肽可以稱為「蛋白」。另外多肽可以包含非胺基酸成分，諸如糖基。糖基和其他非胺基酸成分可以由產生所述多肽的細胞加入，並且其將隨著細胞的類型而變化。多肽以其胺基酸主鏈結構來限定；通常不指定諸如糖基的取代基，但可以存在取代基。在一個實施方案中，所述多肽是免疫球蛋白，或免疫球蛋白片段，或包含免疫球蛋白或免疫球蛋白片段的融合蛋白。術語「免疫球蛋白」表示通常包含兩個輕鏈多肽(輕鏈，LC)和兩個重鏈多肽(重鏈，HC)的多肽。每條重鏈和輕鏈包含可變區(通常是鏈的氨基末端部分)，所述可變區包含與抗原相互作用的特異性結合區(⑶R，互補決定區)。每個重鏈和輕鏈還包含恆定區(通常是鏈的羧基末端部分)，所述恆定區介導免疫球蛋白與宿主組織或因子的結合， 所述宿主組織或因子包括免疫系統的各種細胞、一些吞噬細胞和經典補體系統的第一成分(Clq)。通常輕鏈包含輕鏈可變區和輕鏈恆定區，而重鏈包含重鏈可變區、鉸鏈區和和重鏈恆定區，即ChI結構域、Ch2結構域、Ch3結構域和任選的Ch4結構域。免疫球蛋白可以多種形式存在，包括，例如，片段Fv、Fab和F(Eib)2以及單鏈(例如，Huston, J. S.等，Proc. Natl. Acad. ki. USA(美國科學院院刊)85 (1988) 5879-5883 ；Bird, R. Ε.，等，Science (科學)242 (1988) 423-426 ；通常，Hood, L. Ε·，等，Immunology (免疫學)，Benjamin N. Y.，第二版(1984)以及 HunkapiIler，T.和 Hood，L.，Nature (自然)323 (1986) 15-16)。取決於重鏈恆定結構域的胺基酸序列，免疫球蛋白被分為不同的類型IgA、IgD、Ige、IgG和IgM。這些類型中的一些被進一步分為亞類(同型)，例如，IgG分為IgGl、IgG2、IgG3和IgG4，或 IgA分為IgAl和IgA2。根據免疫球蛋白所屬的免疫球蛋白類型，免疫球蛋白的重鏈恆定區分別稱為a (IgA)、d (IgD)、e (IgE)、g (IgG)和m(IgM)。另外可能存在兩種類型的免疫球蛋白輕鏈，λ型輕鏈和κ型輕鏈。術語「色譜材料」當在本申請內使用時一方面表示可以在目的多肽的色譜純化中在無需進一步修飾的條件下使用的固體材料，諸如羥磷灰石，以及還表示包含已經例如通過共價鍵引入/連接色譜功能基團修飾的散裝芯材的材料，諸如SP-s印harose 。散裝芯材被理解為不參與色譜分離，即待分離多肽和色譜材料的色譜功能基團之間的相互作用。 其僅僅提供色譜功能基團連接的三維構架，並且確保包含待純化多肽的溶液可以接觸色譜功能基團。在一個實施方案中，所述散裝芯材是固相。因此，在另一個實施方案中，「色譜材料」是連接色譜功能基團的固相。在另一個實施方案中，「色譜功能基團」是可電離疏水基團，或疏水基團，或其中不同的色譜功能基團組合在一起以便結合僅特定類型的多肽的複合基團，或共價結合的帶正電荷或負電荷的基團。通常待純化多肽作為經緩衝的水性溶液施加至色譜材料。術語「施加於(applying to) 」及其語法等價物當在本申請中使用時表示色譜純化多肽的部分步驟，其中使包含待純化的目的多肽的溶液與色譜材料接觸。這表示包含待純化多肽的溶液在色譜柱的上部入口處被加入至包含色譜材料的色譜柱。包含待純化的目的多肽的溶液通過色譜材料，由此允許色譜材料和溶液中的物質之間的相互作用。取決於條件，諸如例如PH、電導率、鹽濃度、溫度和/或流速，包含在所述溶液中的物質與色譜材料特異性地相互作用，由此取決於與色譜材料的相互作用，實現它們通過色譜柱的移動。目的多肽可以從純化步驟後獲得的溶液中，即，從洗脫液中，通過本領域技術人員熟悉的方法，諸如沉澱、鹽析、超濾、滲濾、凍幹、親和色譜、或溶劑體積減小從而獲得基本均質形式的目的物質而回收。術語「緩衝的」當在本申請中使用時表示其中由於酸性或鹼性物質的添加或釋放引起的PH改變通過緩衝物質來調平的溶液。可以使用導致所述作用的任何緩衝物質。在一個實施方案中，使用藥用緩衝物質，諸如，例如，磷酸或其鹽、乙酸或其鹽、檸檬酸或其鹽、 嗎啉或其鹽、2-(N-嗎啉代)乙磺酸或其鹽、組氨酸或其鹽、甘氨酸或其鹽、或三(羥甲基) 氨基甲烷(TRIQ或其鹽。在一個實施方案中，所述緩衝物質是磷酸或其鹽，或乙酸或其鹽， 或檸檬酸或其鹽，或組氨酸或其鹽。任選地緩衝的溶液可以包含額外的鹽，諸如，例如，氯化鈉、硫酸鈉、氯化鉀、硫酸鉀、檸檬酸鈉、或檸檬酸鉀。在液相色譜柱色譜純化方法中，色譜材料位於柱殼體內並且表示為「固定相」。為了使固定相能夠與施加於其上的溶液中的物質/多肽相互作用，固定相被「流動相」包繞或包埋在「流動相」中。術語「流動相」表示液體，例如，緩衝的，水溶液，水和有機溶劑的混合物，或有機溶劑，其用於其中採用固定相的色譜純化法中。已充分地確定了不同的色譜法，並且這些色譜法廣泛用於多肽回收和純化，諸如採用微生物蛋白(例如，蛋白A或蛋白G親和色譜)的親和色譜、離子交換色譜(例如，陽離子交換(羧甲基樹脂)，陰離子交換(氨乙基樹脂)和混合模式交換)，嗜硫吸附(例如， 採用巰基乙醇和其他SH配體)，疏水相互作用或芳烴吸附色譜(例如，採用苯基-瓊脂糖，氮雜-嗜沙蟾毒樹脂(aza-arenophilic resins)，或間氨基苯硼酸)，金屬螯合物親和色譜法(例如，採用Ni(II)-和Cu(II)-親和材料)，尺寸排阻色譜，和電泳法(諸如凝膠電泳，毛細管電泳)(參見，例如，Vijayalakshmi，M.A.，Appl. Biochem. Biotech.(應用生物化學和生物技術)75 (1998) 93-102)。術語「疏水電荷誘導色譜」，簡稱「HCIC」，表示採用「疏水電荷誘導色譜材料」的色譜法。「疏水電荷誘導色譜材料」是包含色譜功能基團的色譜材料，所述色譜功能基團可以在一個PH範圍內與待純化物質/多肽形成疏水鍵並且在另一個pH範圍內帶有正電荷或負電荷，即HCIC使用可電離的疏水基團作為色譜功能基團。通常，多肽在中性pH條件下結合於疏水電荷誘導材料，並且之後通過改變PH值生成電荷排斥而被回收。示例性的「疏水電荷誘導色譜材料，，是 Biokpra MEP 或 HEA Hypercel (Pall Corp.，USA)。術語「疏水相互作用色譜」，簡稱「HIC」，表示其中採用「疏水相互作用色譜材料」 的色譜法。「疏水相互作用色譜材料」是結合了作為色譜功能基團的疏水基團，諸如丁基、 辛基或苯基的色譜材料。被施加的多肽根據其表面暴露的胺基酸側鏈的疏水性而被分離， 所述表面暴露的胺基酸側鏈可以與疏水相互作用色譜材料的疏水基團相互作用。多肽和色譜材料之間的相互作用可以受溫度、溶劑和溶劑的離子強度影響。例如溫度升高支持多肽和疏水相互作用色譜材料之間的相互作用，因為胺基酸側鏈的運動增加並且在較低溫度下包埋在多肽內部的疏水胺基酸側鏈變得可以接近。此外，kosmotropic鹽促進疏水相互作用而離液鹽(chaotropic salt)減弱疏水相互作用。「疏水相互作用色譜材料」例如是，苯基瓊脂糖(Wienyls印harose) CL_4B、6 FF、HP、苯基 Superose (Phenyl Superose)、辛基瓊脂糖(0ctyl-kpharose)CL-4B、4FF 和丁基瓊脂糖(Butyls印harose) 4FF (所有均可獲自 Amersham Pharmacia Biotech Europe GmbH，德國)，它們經由縮水甘油醚與散裝材料連接而獲得。術語「親和色譜」當在本申請中使用時表示採用「親和色譜材料」的色譜法。在親和色譜中，多肽根據與色譜材料的色譜功能基團形成靜電相互作用、形成疏水鍵和/或形成氫鍵，基於其生物學活性或化學結構而被分離。為了從親和色譜材料回收特異性結合的多肽，加入競爭性配體或改變色譜條件，諸如緩衝液的PH值、極性或離子強度。「親和色譜材料」是包含複合色譜功能基團的色譜材料，在所述複合色譜功能基團中不同的單一色譜功能基團組合在一起以便僅結合特定類型的多肽。此色譜材料特異性地結合特定類型的多肽，這取決於其色譜功能基團的特異性。示例性的「親和色譜材料」是「金屬螯合色譜材料」 諸如包含Ni (II)-NTA或Cu(II)-NTA的材料，用於結合包含六聚組氨酸標籤的融合多肽或具有大量表面暴露的組氨酸、半胱氨酸和/或色氨酸殘基的多肽，或「抗體結合色譜材料」 諸如蛋白A，或「酶結合色譜材料」諸如包含酶底物類似物、酶輔因子或酶抑制劑作為色譜功能基團的色譜材料，或「凝集素結合色譜材料」諸如包含多糖、細胞表面受體、糖蛋白或完整細胞作為色譜功能基團的色譜材料。術語「金屬螯合色譜」當在本申請中使用時表示採用「金屬螯合色譜材料」的色譜法。金屬螯合色譜基於金屬離子和多肽的表面暴露的胺基酸側鏈的電子給體基團之間螯合物的形成，所述金屬離子作為色譜功能基團與散裝芯材結合，諸如Cu (II)，Ni(II)或 Zn(II)；所述多肽尤其是具有包含咪唑的側鏈和包含硫醇基的側鏈。所述螯合物在那些側鏈至少部分不被質子化的PH值下形成。通過pH值的改變，即，通過質子化從色譜材料回收結合的多肽。示例性的「金屬螯合色譜材料」是HiiTrap Chelating HP(Amersham Pharmacia Biotec Europe GmbH,iIH ), Fractogel EMD (EMD Chemicals Inc，USA)。術語「離子交換色譜」當在本申請中使用時表示採用「離子交換色譜材料」的色譜法。術語「離子交換色譜材料」的涵義依賴於陽離子是否在「陽離子交換色譜」或「陽離子交換色譜材料」中被交換，或陰離子是否在「陰離子交換色譜」或「陰離子交換色譜材料」中被交換。術語「離子交換色譜材料」當在本申請中使用時表示固定的高分子量固相，其攜帶共價結合的帶電荷基團作為色譜功能基團。為了總體上的電荷中性，非共價結合的抗衡離子與共價結合的帶電荷基團締合。「離子交換色譜材料」具有以其非共價結合的抗衡離子交換周圍溶液中類似的帶電荷離子的能力。取決於其可交換的抗衡離子的電荷，「離子交換色譜材料」稱為「陽離子交換色譜材料」或「陰離子交換色譜材料」。此外取決於帶電荷基團的性質，「離子交換色譜材料」稱為例如，具有磺酸基(S)，或羧甲基(CM)的陽離子交換色譜材料。取決於帶電荷基團的化學性質，「離子交換色譜材料」可以另外地分類為強或弱離子交換色譜材料，這取決於共價結合的帶電荷取代基的強度。例如，強陽離子交換色譜材料具有磺酸基作為色譜功能基團，弱陽離子交換色譜材料具有羧酸基作為色譜功能基團。「陽離子交換色譜材料」，例如，可以不同的名稱獲自大量的公司，諸如例如，Bio-Rex, Macro-Prep CM(可獲自 Biorad Laboratories, Hercules, CA, USA)，弱陽離子交換劑 WCX 2(可獲自Ciphergen，弗裡蒙特，CA, USA)，Dowex MAC-3 (可獲自陶氏化學公司(Dow chemical company)τ^ !^ MI,USA),Mustang C(Pall Corporation, East Hills, NY, USA)，纖維素 CM-23，CM-32，CM-52，hyper-D,和 partisphere (可獲自 Whatman pic, Brentford, UK)，Amberlite IRC 76，IRC 747，IRC 748，GT 73 (可獲自 Tosoh Bioscience GmbH，斯圖加特，德國)，CM 1500，CM 3000 (可獲自 BioChrom Labs, Terre Haute, IN, USA)，禾口 CM-S印harose Fast Flow(可獲自 GE Healthcare-Amersham Biosciences Europe GmbH, Freiburg,德國)。術語「羥磷灰石色譜」當在本申請中使用時表示採用特定形式的磷酸鈣作為色譜材料的色譜法。示例性的羥磷灰石色譜材料是Bio-Gel HT, Bio-Gel HTP, Macro-PrepCeramic (可獲自 Biorad Laboratories)，I 型、II 型羥磷灰石，HA Ultrogel (Sigma Aldrich Chemical Corp.，USA)，羥磷灰石快速流動和高解析度(Hydroxyapatite Fast Flow and High Resolution) (Calbiochem)，或 TSK 凝膠 HA-1000 CTosoh Haas Corp. , USA) 術語「結合-和-洗脫模式」及其語法等價物在本發明中使用時表示色譜法的操作模式，其中包含待純化多肽的溶液施加至色譜材料，由此待純化的物質/多肽結合至色譜材料。結果待純化的物質/多肽保留在色譜材料上，而非目的物質/多肽通過流過而被去除。之後在第二步驟中待純化的物質/多肽從色譜材料上被洗脫並且因此隨洗脫溶液從固定相中被回收。這不一定表示100%的非目的物質/多肽被去除，但基本上100%的非目的物質/多肽被去除，即，在一個實施方案中，至少50%的非目的物質/多肽被去除，在另一個實施方案中至少75%的非目的物質/多肽被去除，在進一步的實施方案中，至少90%的非目的物質/多肽被去除，和在一個實施方案中，多於95%的非目的物質/多肽被去除。術語「流通模式」及其語法等價物當在本發明中使用時表示色譜法的操作模式，其中包含待純化的物質/多肽的溶液被施加至色譜材料，由此待純化的物質/多肽不結合至色譜材料。結果待純化的物質/多肽以流通方式獲得。還存在於溶液中的非目的物質/多肽結合至色譜材料並且從溶液中被去除。這不一定表示100%的非目的物質/多肽從溶液中被去除，但基本上100%的非目的物質/多肽被去除，S卩，在一個實施方案中，至少50%的非目的物質/多肽從溶液中被去除，在另一個實施方案中，至少75%的非目的物質/多肽從溶液中被去除，在進一步的實施方案中，至少90%的非目的物質/多肽從溶液中被去除，且在一個實施方案中，多於95%的非目的物質/多肽從溶液中被去除。術語「連續洗脫」和「連續洗脫法」在本申請中可交換使用，它們表示其中例如，導致洗脫(即，結合的物質/多肽從色譜材料的溶出)的物質的濃度被連續升高或降低的色譜法，即，通過一系列小的步幅改變濃度，在一個實施方案中每個步幅不大於導致洗脫的物質的濃度的2%,在另一個實施方案中不大於1 %。在此「連續洗脫」中，一種或多種條件， 例如，色譜法的pH，離子強度，鹽濃度，和/或流動，可以線性地改變，或指數地改變，或漸進地改變。在一個實施方案中，所述改變是線性的。術語「分階洗脫」和「分階洗脫法」在本申請中是可互換的，它們表示其中例如導致洗脫(即，結合的物質/多肽從色譜材料的溶出)的物質的濃度，即在一個實施方案中，立即從一個值/水平升高或降低至下一個值/水平。在此「分階洗脫」中，一種或多種條件， 例如，色譜法的PH，離子強度，鹽濃度，和/或流動，全部從第一(例如，起始)值立即改變為第二(例如，最終)值。在一個實施方案中，該步驟中的改變大於導致洗脫的物質濃度的 5%的變化，在另一個實施方案中大於10%的變化。「分階洗脫」表示條件遞增地改變，即逐步的改變，與線性改變相反。在「分階洗脫法」中，在每次遞增後收集新的級分。在每次遞增後保持條件直至該洗脫法中的下一步驟。如本文報導的一個方面是用於色譜柱中的色譜柱隔板。一個隔板的存在將色譜柱分成上色譜柱室和下色譜柱室，並且所述隔板在色譜柱內具有可變的位置，所述位置通過導向環提供，即，其可以根據色譜材料的壓力依賴性壓縮和膨脹在色譜柱內垂直地滑動，並且所述隔板包埋在色譜材料中。在粗製多肽的柱色譜分離或純化中，通常採用包括色譜材料和流動相的色譜柱。 通過向流動相施加壓力驅使流動相通過色譜柱並隨後通過色譜材料。通過流動相的介導，壓力也施加到色譜材料，由此建立了從色譜柱的入口至色譜柱的出口的壓降。在色譜柱的出口處，壓力降低至外部的大氣壓。因此，最高壓力施加到色譜柱中色譜材料的上部部分。施加的壓力通常一方面取決於色譜材料的粒度，還取決於流動相的粘度，因為設定恆流通過色譜柱，而不是恆壓。一般來說，壓力隨著色譜材料粒度的減小而增加。在通過色譜材料的恆定流速下，例如，在色譜材料的再生或清洗期間，流動相粘度的改變導致施加到色譜材料的壓力的改變。通常色譜材料不是壓力不敏感材料，即，其可被壓縮並且在壓縮後膨脹。因此，隨著施加壓力的增加，色譜材料被壓縮並且色譜柱內的色譜材料高度，即，床高，減小。同樣，隨著施加壓力的減小，色譜材料再次膨脹並且色譜柱內的色譜材料高度至多增大至施加壓力之前的高度。色譜材料的此壓縮和膨脹同時是整個色譜材料的宏觀過程和色譜材料的單個粒子的微觀過程。隨著此壓縮-膨脹循環的次數增加，色譜材料的粒子粉碎成較小的粒子。隨著色譜材料的粒子粒度的減小，色譜材料填料變得更加緊密，並且隨之，同時維持通過色譜柱(即，色譜材料)的恆定液相流動所需的壓力增大。這樣再次導致色譜材料粒子的進一步粉碎，再次導致壓力增加，等等。色譜柱分離通常可以操作直達最大壓力。當達到此壓力上限時，必須整體更換色譜柱填料。已經發現如本文報導的由導向環和安裝在其中的篩板組成的色譜柱隔板不會干擾色譜分離過程，而是使得能夠僅可更換一部分色譜材料，例如，當達到最大操作壓力時， 無需更換整個色譜柱填料。即，根據本發明的色譜柱隔板容許更換上色譜柱室中的色譜材料而不幹擾下色譜柱室中的色譜材料。因此，能夠去除包含在包括如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱中的全部色譜材料的有限部分，例如，在此部分已經塌陷或磨碎或填料質量下降時，而無需去除色譜材料的其他部分。色譜材料的這種部分去除是有可能的，因為一方面隔板將色譜柱中的全部色譜材料分成不同的部分，並且在另一方面其防止下色譜柱室中裝填的色譜材料受到去除上色譜柱室中色譜材料的幹擾。因此，至少未暴露於最大壓力變化並且因此沒有被磨碎的那部分色譜材料可以進一步被使用而對分離效率沒有負面的影響。 但是，通過保留一部分色譜材料，可以實現商品成本的降低。如本文報導的色譜柱隔板包括導向環，在所述導向環中可以安裝由任意惰性材料製成的篩板。「惰性材料」是不會干擾色譜分離過程的材料，即，在相同條件下或以其他方式採用相同條件，用包括一個或多個如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱獲得的色譜圖與用未包括色譜柱隔板的色譜柱獲得的色譜圖是一樣的。此類惰性材料是例如，金屬，尤其是不鏽鋼，聚矽氧烷，聚丙烯，聚乙烯，聚四氟乙烯，燒結物料或它們的組合，尤其是聚四氟乙烯塗覆的不鏽鋼。在一個實施方案中，如本文報導的色譜柱隔板可以包括單篩板或在另一個實施方案中包括上篩板和下篩板的組合。如果隔板包括一個篩板，則該篩板的孔徑小於色譜材料的粒子的尺寸。在一個實施方案中，所述孔徑為色譜材料粒子的平均直徑的10%以下以便防止篩板的孔被粉碎的色譜材料粒子阻塞。如果隔板包括兩個篩板，則兩個篩板可以具有相同的孔徑或兩個篩板可以具有不同的孔徑。因為色譜材料粉碎成較小的粒子，在一個實施方案中，上篩板的孔徑小於下篩板，在一個實施方案中，上篩板的孔徑為色譜材料粒子的平均直徑的10%以下。在一個實施方案中，色譜柱隔板的上篩板和/或下篩板為金屬網。 在進一步的實施方案中，上篩板的孔徑小於下篩板的孔徑。在一個實施方案中，色譜柱隔板或色譜柱隔板的下篩板的孔徑為Iym至20μ ，或Ιμ 至ΙΟμ ，或Ιμ 至5μπ 。在另一個實施方案中，色譜柱隔板的上篩板的孔徑為色譜柱隔板的下篩板孔徑的5%以下，或色譜柱隔板的上篩板的孔徑為色譜柱隔板下篩板孔徑的10%，或色譜柱隔板上篩板的孔徑為色譜柱隔板的下篩板孔徑的20%以下。在進一步的實施方案中，色譜柱隔板下篩板的孔徑為 20 μ m或10 μ m或5 μ m，且上篩板的孔徑為5 μ m或1 μ m。因此，根據本發明的色譜柱隔板的使用允許下色譜柱室中的色譜材料的較長時間使用，以及同時用於減少色譜法的成本。在一個實施方案中，上色譜柱室為下色譜柱室體積的5%至15%，在另一個實施方案中為10%。在另一個實施方案中，上色譜柱室為下色譜柱室體積的20%至30%，在一個實施方案中，為25%。還在進一步的實施方案中，上色譜柱室的體積與下色譜柱室的體積相同。要指出的是如本文報導的色譜柱隔板不會使存在於色譜柱的入口和出口處的隔板或篩板無法使用。此外，在色譜材料內還放置額外的隔板。由於與流動相的流動方向垂直的柱色譜柱的橫截面是環狀的，因此篩板且同樣隔板也具有環狀的外形。隔板的高度小於色譜柱填料的總長度。在一個實施方案中，隔板的高度為0. Icm至10cm，在另一個實施方案中為0. 25cm至5cm，且在進一步的實施方案中，為0. 5cm至2cm。隔板的高度為連接至上色譜柱室的篩板表面和連接至下色譜柱室的篩板表面之間的距離。如果隔板包括上篩板和下篩板，則兩個單個篩板的總高度可以小於隔板的高度。在此實施方案中，隔板內存在的額外空間可以用於，例如，在篩板放置傳感器以記錄，例如，UV吸收，或壓力，或經過隔板的流動相的電導率，或用於提供額外的閥以去除流動相或用於在色譜柱填料內的一個位置處添加流動相。如果隔板包括上篩板和下篩板，則在一個實施方案中兩個篩板具有相同的高度。 在另一個實施方案中，上篩板和下篩板具有不同的高度。在一個實施方案中，色譜柱隔板的直徑小於引入其的色譜柱的內徑。在圖1中，顯示了示例性的色譜柱隔板。在圖la)中，繪製了具有單篩板的隔板， 其包括篩板(1)和配件O)。在圖lb)中，顯示了具有上篩板C3)和下篩板以及配件 (2)的隔板。在圖Ic)中，顯示了隔板的導向環的垂直橫截面，其包括兩個軸向對稱的橫截面區域(5和6)，其中每個軸向對稱的橫截面區域具有a)錐形結構，其中所述錐形從所述導向環的外部向內部逐漸變細，和b)用於安裝篩板的凹口(8)，所述凹口(8)具有指向所述導向環內部的開口。如本文報導的色譜柱隔板除了篩板以外還包括配件或導向環(兩個術語可以交換使用)用於當所述隔板置於色譜柱內時密封篩板的外緣和色譜柱壁之間的距離。在一個實施方案中，配件或導向環由柔性材料製成，所述柔性材料諸如橡膠，塑料，聚矽氧烷，聚四氟乙烯，聚乙烯，聚丙烯等。配件或導向環必須是柔性的以便調平一個色譜柱的內徑的小差異或相同標稱直徑的不同色譜柱之間的小差異，以防止液相或色譜材料在篩板外部通過隔板。要指出的是如本文報導的隔板可以僅通過流動相而不通過色譜材料。即篩板的孔徑小於色譜材料粒子的尺寸。配件或導向環具有環形形狀，其橫截面可以具有任何形狀，只要其具有用於接納篩板的矩形凹口。例如，在一個實施方案中，配件的橫截面具有三角形的形狀，在具有最大內角的三角形的角中具有用於接納篩板的矩形凹口。在進一步的實施方案中，配件或導向環具有橫截面或提供三角形形式的橫截面區域，在另一個實施方案中提供直角三角形形式的橫截面區域，其中所述篩板連接至內角為90°的三角形的角。在另一個實施方案中，導向環的橫截面區域為梯形形式，其在平行邊的短邊處具有用於接納篩板的矩形凹口。在一個實施方案中，配件為矩形形式，在另一個實施方案中，為具有90°，90°，80°和100°的內角的矩形。在一個實施方案中，80°和100°的內角位於矩形的上邊或底邊處。在一個實施方案中，當隔板放置在色譜柱內時，導向環的最長邊是隔板的外緣，並與色譜柱壁接觸。在另一個實施方案中，最長邊具有垂直定向。還在另一個實施方案中，配件或導向環的橫截面區域為具有90°內角的矩形形式，在短邊之一中或在正方形的情況下在一條邊中具有用於接納篩板的矩形凹口。具有凹口的邊是配件的指向隔板的中心且同樣指向色譜柱的中心的那條邊，或換句話說，所述凹口處於與流動相的流動方向平行並且具有小於篩板的外徑的直徑的配件或導向環的那條邊中。導向環除了具有防止液相和色譜材料粒子在篩板旁經過隔板的功能，其還具有防止在施加外部壓力時色譜材料的壓縮和膨脹期間整個隔板在色譜柱中的傾斜和隨之被卡住。如本文報導的隔板放置在裝填入色譜柱中的色譜材料內。因為可以沿色譜柱的內壁滑動，因此所述隔板可以自由地移動並且準確地放入色譜柱內。在裝填色譜柱和從色譜柱中取出隔板期間這是有用的。因此，為了防止在隔板下方形成腔隙，和隨之對色譜分離過程的負面影響，如本文報導的隔板以允許隔板隨著包埋所述隔板的色譜材料的壓縮和膨脹而沿色譜柱的內壁滑動的方式進行構造。在一個實施方案中，導向環的垂直橫截面區域為三角形或梯形的形式，在所述形式中所述導向環具有錐形結構，其中所述錐形從所述導向環的外部向內部逐漸變細，即導向環的外緣分別高於其內緣或凹口。在一個實施方案中，導向環的外緣高度為凹口高度的至少1.5倍。在另一個實施方案中，導向環的外緣高度為凹口高度的至少1. 5倍，或2倍，或3倍，或多於3倍。如果隔板包括上篩板和下篩板，在一個實施方案中，配件或導向環是單個配件或環，且在另一個實施方案中，配件或導向環由上配件或環和下配件或環製成。在後一種情況下，在一個實施方案中，兩個配件或環具有接觸區，所述接觸區包括上配件或環的下邊和下配件或環的上邊，由此接觸邊是平的，即，沒有凹口或凹槽，並且與上篩板的下邊和下篩板的上邊成直線，即，上配件的下邊和上篩板的下邊形成無偏移的單個表面，並且同樣下配件或環的上邊和下篩板的上邊形成無偏移的單個表面，由此兩個表面是平行的。通常，配件或導向環的最小內徑或上配件和下配件的最小內徑小於篩板的外徑， 艮口，配件或導向環在篩板的外周長內朝向色譜柱的中心延伸。在一個實施方案中，配件或導向環在其上表面處包括三個或更多個孔，每個孔具有為色譜柱隔板施加裝置所使用的螺紋。在進一步的實施方案中，下配件或導向環在其上表面處包括三個或更多個無螺紋孔。在一個實施方案中，配件包括3至6個具有或不具有螺紋的孔。在圖2中，顯示了不同的配件或導向環的橫截面區域。在圖2a)中，顯示了三角形配件的橫截面區域，在圖2b)中，顯示了梯形配件的橫截面區域，且在圖2c)中，顯示了矩形配件的橫截面區域。從圖2中的橫截面區域可以看出，配件或導向環覆蓋篩板的外徑充分地延伸。在圖3中，顯示了具有包括三個螺紋孔的導向環的隔板的立體圖。色譜柱隔板可以用不同的方法插入至色譜柱中。用於將如本文報導的色譜柱隔板插入至包括第一部分色譜材料的色譜柱中的方法包括將色譜柱隔板置於色譜柱內的液體或色譜材料或色譜材料漿的表面的上面，向所述色譜柱的頂部施加壓力，並且隨之使所述色譜柱隔板在色譜柱內沿流動相的流動方向移動直至該色譜柱隔板處於色譜柱內的預定位置處。在不同的或備選方法中，使用色譜柱隔板施加裝置。此裝置包括中央的鐘形本體； 與所述裝置的頂部連接的用於使該裝置上下移動的設備；至少三個與色譜柱隔板連接的連接件，由此所述連接件連接/固定至隔板和本體；以及本體中的至少一個孔，當該裝置置於色譜柱中時所述孔用於該裝置下方區域和該裝置上方區域之間的壓力調節。在一個實施方案中，所述連接件是在其下端部具有螺紋的杆，所述螺紋用於將所述連接件固定至色譜柱隔板的配件。在將隔板放置在其預定位置後，將該裝置的本體從柱中取出，將連接件從隔板的配件擰出，並且也從柱中取出。同樣通過顛倒步驟的次序從柱中取出包括單個篩板的隔板。如果隔板包括上篩板和下篩板，則通過顛倒如前面所概述的步驟的次序取出上篩板。為了取出下篩板，使用抓取器，該抓取器鉤住下導向環的上表面中存在的孔。在圖4中顯示了具有導向環的色譜柱隔板，所述導向環包括三個具有螺紋的孔， 所述孔經由三個連接件連接至色譜柱隔板施加裝置。用包埋有如本文報導的色譜柱隔板的色譜材料裝填色譜柱分為兩個裝填階段。以根據通用方法將第一部分色譜材料裝填入柱中來開始裝填。之後將如本文報導的色譜柱隔板放置在第一部分色譜材料的上面。最後在隔板的上面根據通用方法將第二部分色譜材料裝填至柱中。此裝填法是從底部至頂部的裝填。相反，沒有包括根據本發明的隔板的柱從頂部裝填，尤其需要較高的裝填壓力。因此，如果使用一個隔板，如本文報導的色譜柱隔板提供了以兩個相繼的步驟裝填色譜柱的方式，或如果使用兩個以上的隔板則提供了以三個以上相繼的步驟裝填色譜柱的方式。採用如本文報導的隔板，柱被分成上室和下室(一個隔板)或下室、中間室和上室(兩個隔板)，其中每個室本身相當於具有減小的色譜材料床高的色譜柱。隨著將色譜柱分成較小的室，改變即減小了(一個室中色譜材料的)體積與 (該室的)表面的比率，並且增加了色譜材料填料的穩定性。在圖5中，繪製了包括一個(圖5a)、兩個(圖5b)和三個(圖5c)色譜柱隔板的色譜柱。對於色譜材料、待純化多肽和色譜條件的每種組合，必須單獨地確定需要更換色譜材料的時間點。這可以取決於例如，待遵循的規範或收率。一旦決定要更換色譜材料，可以去除上室中的色譜材料部分而不幹擾或損壞色譜柱下室中的色譜材料部分的填料。在使用色譜柱期間色譜材料的破碎導致具有減小的直徑(尺寸)的色譜材料粒子。這些粒子越小，更多的隔板的篩板的孔被阻塞。因此，還建議從柱中取出隔板，清洗篩板並且一旦將上室中的色譜材料部分去除並在向色譜柱的上室中填充新的色譜材料之前將隔板再次引入至柱中。如果使用包括上篩板和下篩板的隔板，僅上篩板需要被去除並且下篩板可以仍然在原位。在此實施方案中，下室中色譜材料的裝填很少或甚至根本不被幹擾。可以在任何色譜柱中使用如本文報導的色譜柱隔板以便將色譜柱分成兩個、三個或多個單獨的和獨立的室。在作出本發明時在我們的實驗室中可獲得足量的多肽促紅細胞生成素以評價該色譜柱隔板的性能。這不意在限制本發明的範圍，而僅作為實例給出以說明本發明。在圖6中，顯示了採用Vydac C4色譜材料色譜分離促紅細胞生成素的UV-吸收洗脫圖，由此採用不包括色譜柱隔板的色譜柱獲得色譜圖a)且採用包括一個如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱獲得色譜圖b)。可以看出色譜圖是相同的，由此顯示隔板對色譜行為沒有影響。因此，採用根據本發明的隔板，能夠將色譜柱中的色譜材料分成兩個或多個不同的部分或室而不會干擾色譜分離過程。在圖7中，顯示了在多用途色譜柱的連續再生循環中包括如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱的背壓增加。再生步驟最適合對此進行例證，因為在此步驟中在色譜循環中發生最高的背壓。如從圖7中可見，在連續再生步驟中背壓持續地增加，可能是由於色譜材料不斷破壞的緣故。在循環58次後，色譜柱的上室中用過的和破損的色譜材料更換為新鮮的，即，新的色譜材料。通過僅更換上面部分的色譜材料，實現了後續再生步驟中背壓的大幅降低。因此，如本文報導的色譜柱隔板首先不會影響色譜分離，其次提供了簡易、有效和成本節約的色譜柱填料更新。要指出的是在此柱中的色譜材料再次更換，並且隨後下室中的色譜材料運行98個連續的分離循環而無需更換。不使用如本文報導的隔板，柱材料必須在平均15個循環後要被更換。在圖8中，顯示了 Vydac C4色譜柱的塔板數目的確定。在色譜圖a)中，用於確定塔板數目的示蹤物質的峰分成兩個峰。這顯示該色譜柱填料有缺陷，例如，色譜材料的破壞，例如，其開放了備選的流路，引起可觀察到的峰加倍。在色譜圖b)中，顯示了在更換色譜柱上室中的色譜材料部分後塔板數目的確定。再沒有看到峰的加倍。此外，採用如本文報導的色譜柱隔板，能夠將第一色譜材料裝填至下室中，並且將不同的第二色譜材料裝填至色譜柱的上室中。採用兩種不同的色譜材料，獲得了混合型色譜柱。在圖9和10中，顯示了色譜分離IL13受體α抗體的不同UV-吸收洗脫圖。通常抗體可以通過陽離子交換色譜和陰離子交換色譜的組合來純化，由此離子交換色譜可以具有任何次序。在圖9中，顯示了第一個柱中的第一 SP-瓊脂糖陽離子交換色譜(圖9a)和第二柱中的第二 Q-瓊脂糖陰離子交換色譜(圖9b)的UV-吸收洗脫圖。在此兩步程序中， 包含抗體的洗脫液在施加至第二色譜柱之前已經被處理。在圖10中，顯示了通過如本文報導的混合型色譜純化抗體的分析性SEC洗脫圖。圖IOa)顯示了圖9b)的產物峰的分析圖。 圖IOb)是在混合型色譜柱的上室中採用SP-瓊脂糖和在混合型色譜柱的下室中採用Q-瓊脂糖的混合型色譜的產物峰的圖。圖IOc)提供了在混合型色譜柱的上室中使用Q-瓊脂糖和在混合型色譜柱的下室中採用SP-瓊脂糖的混合型色譜的產物峰的圖。如從圖10中給出的色譜圖可見，混合型色譜結果基本上與單獨的色譜步驟相同，僅由於色譜步驟的不同次序引起保留時間稍有不同。如本文報導的色譜柱隔板-提供了在上和下色譜柱室中使用不同類型的相同色譜材料的手段，例如，在上色譜柱室中可以使用具有較高機械穩定性的色譜材料，且在下色譜柱室中可以使用具有較低機械穩定性的色譜材料；-提供了更換上色譜柱室中用過的或磨碎的或塌陷的色譜材料而不需要更換下色譜柱室中的色譜材料的手段；
-提供了在每個色譜柱室中使用不同的具有不同的色譜功能基團的色譜材料從而能夠組合兩種不同的色譜法的手段。通過使用如本文報導的色譜柱隔板，例如可以在下色譜柱室中使用對壓力敏感的色譜材料，因為隔板減小了引導至下色譜柱室中的色譜材料的壓力。即通過使用如本文報導的隔板，可以實現色譜材料內部的壓力減小。因此，包括如本文報導的隔板的色譜柱與具有相同的床高但沒有如本文報導的隔板的色譜柱相比具有減小的背壓(背壓是驅使流動相通過色譜材料所需的壓力)，即，減小了總壓力以及壓力變化和壓力增量。如上所述，減小的壓力和減小的壓力變化可以提供增加數目的色譜循環，無需更換色譜柱內的色譜材料。 在一個實施方案中，包括具有距離固定件的色譜柱隔板的色譜柱的下色譜柱室中的色譜材料選自DEAE-瓊脂糖或HA-Ultrogel。另外通過使用如本文報導的隔板，色譜柱可以以增加的流動相流速操作。這是由於必須施加於色譜柱以實現預定流速所需的壓力減小所導致的(參見圖11)。在一個實施方案中，所述色譜柱隔板包括指向色譜柱的下端部的距離固定件。在另一個實施方案中，所述色譜柱隔板包括3-6個距離固定件。提供下面的實施例和附圖用於輔助理解本發明，本發明的真實範圍在後附的權利要求中給出。要理解在不背離本發明的實質的前提下可以對給出的步驟作出改動。


圖1根據本發明的示例性色譜柱隔板a)具有單個篩板的隔板，其包括篩板(1) 和配件⑵；b)具有上篩板⑴和下篩板(3)以及上配件⑵和下配件⑷的隔板；C)隔板的導向環的垂直橫截面，包括兩個軸向對稱的橫截面區域(5和6)，每個軸向對稱的橫截面區域具有i)錐形結構，其中所述錐形從所述導向環的外部向內部逐漸變細，和i)用於安裝篩板的凹口(8)，所述凹口(8)具有指向所述導向環內部的開口。圖2不同配件的橫截面區域a)三角形配件的橫截面，b)梯形配件的橫截面區域， c)矩形配件的橫截面區域，d)上配件和下配件的橫截面區域。圖3顯示了包括三個螺紋孔的配件的立體圖。圖4具有包括三個螺紋孔的配件的色譜柱隔板的橫截面，所述三個螺紋孔經由三個連接件連接至色譜柱隔板施加裝置。圖5包括一個(a)、兩個(b)、和三個(c)色譜柱隔板的色譜柱。圖6採用Vydac C4色譜材料色譜分離促紅細胞生成素的UV-吸收洗脫圖，由此採用不包括根據如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱獲得色譜圖a)且採用包括一個如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱獲得色譜圖b)。圖7在多用途色譜柱的連續再生循環中包括如本文報導的色譜柱隔板的色譜柱的背壓增加。圖SVydac C4色譜柱的塔板數目的確定。圖9IL13受體α抗體的色譜圖的UV-吸收Q-瓊脂糖洗脫圖a)SP_瓊脂糖陽離子交換色譜；b)Q_瓊脂糖陰離子交換色譜。圖10分析性SEC洗脫圖a)圖9的產物峰的分析圖；b)在混合型色譜柱的上室中採用SP-瓊脂糖和在混合型色譜柱的下室中採用Q-瓊脂糖的混合型色譜的產物峰的圖；c)在混合型色譜柱的上室中使用Q-瓊脂糖和在混合型色譜柱的下室中採用SP-瓊脂糖的混合型色譜的產物峰的圖。圖11顯示對於陰離子交換色譜材料(DEAE瓊脂糖(DEAE Sepharose))所得的柱 (背)壓vs.設定的流動相流動。菱形不具有如本文報導的隔板的色譜柱；三角形具有如本文報導的隔板的色譜柱。可見採用如本文報導的隔板對於較高的床高可以實現背壓的減小。實施例1促紅細胞生成素的發酵和純化促紅細胞生成素的發酵和純化如歐洲專利No. 1 064 951 Bl中所報導的那樣進行。本文給出的數據在反相HPLC中在Vydac C4色譜材料上獲得，如EP 1 064 951的實施例Id)中所報導的那樣。RP-HPLC材料Vydac C4 (Vydac)由矽膠粒子組成，其表面攜帶C4-烷基鏈。將促紅細胞生成素與蛋白質雜質分離是基於疏水相互作用的強度差異來進行。採用在稀三氟乙酸中的乙腈梯度進行洗脫。使用不鏽鋼柱(填充以2. 8至3. 2升的Vydac C4矽膠)進行製備性HPLC。通過加入三氟乙酸將羥磷灰石Ultrogel洗脫液酸化並將其加樣至Vydac C4 柱上。對於洗滌和洗脫，使用稀三氟乙酸中的乙腈梯度。收集各級分並立即用磷酸鹽緩衝液中和。實施例2抗-(IL-13R α 1)抗體的製備抗-IL13受體α抗體根據WO 2006/072564中報導的數據和方法製備，尤其是根據實施例10至12製備。Jlij^feif (Sequential-Chromatography)對於該離子交換色譜，將包含抗-IL13RCI抗體的蛋白A洗脫液調節至ρΗ 6. 5並施加至已經用IOmM磷酸鉀緩衝液平衡的SP-瓊脂糖陽離子交換色譜柱上。在使用IOmM磷酸鉀緩衝液的洗滌步驟後，抗體用PH 6. 5的50mM磷酸鉀緩衝液洗脫。將SP-瓊脂糖洗脫液的PH值調節至pH 7. 1並施加至已經用35mM磷酸鉀緩衝液平衡的Q-瓊脂糖陰離子交換色譜柱上。純化的抗體由陰離子交換色譜柱的流通物獲得。混合型色譜(Hybrid-Chromatography)對於採用包括根據本發明的色譜柱隔板的色譜柱的混合型-離子交換色譜，將包含抗-IL13Ra抗體的蛋白A洗脫液調節至pH 7. 1並施加至已經用IOmM磷酸鉀緩衝液平衡的混合型-色譜柱上。在用IOmM磷酸鉀緩衝液洗滌後，抗體用pH 7. 1的20mM磷酸鉀緩衝液洗脫。
權利要求
1.用於液相色譜柱中的環形導向環，其特徵在於所述導向環具有包括兩個軸向對稱的橫截面區域的垂直橫截面，其中每個所述軸向對稱的橫截面區域具有a)錐形結構，其中所述錐形是從所述導向環的外部向內部逐漸變細，和b)用於安裝篩板的凹口，所述凹口具有指向所述導向環的內部的開口。
2.根據權利要求1所述的環，其特徵在於所述凹口是矩形凹口。
3.根據前述任一項權利要求所述的環，其特徵在於每個所述橫截面區域具有三角形形狀且最長邊的長度為所述凹口的直徑的至少1. 5倍。
4.根據前述任一項權利要求所述的環，其特徵在於所述環由橡膠、塑料、聚矽氧烷、聚四氟乙烯、聚乙烯或聚丙烯製成。
5.根據權利要求1-4中任一項所述的導向環在將篩板安裝至圓筒形液相色譜柱中的用途。
6.色譜柱隔板，其包括根據權利要求1-4中任一項所述的導向環和安裝至所述導向環中的篩板。
7.根據權利要求6所述的隔板，其特徵在於所述篩板是a)單個篩板，或b)具有上篩板和下篩板的雙篩板。
8.根據權利要求6或7任一項所述的隔板，其特徵在於a)所述篩板具有1μ m至20 μ m的孔徑，或b)每個所述篩板彼此獨立地具有1μ m至20 μ m的孔徑，由此所述上篩板的孔徑小於所述下篩板的孔徑。
9.根據權利要求6-8中任一項所述的隔板，其特徵在於所述篩板由金屬、聚矽氧烷、聚丙烯、聚乙烯、聚四氟乙烯、燒結物料或它們的組合製成。
10.根據權利要求6-9中任一項所述的隔板，其特徵在於所述隔板包括距離固定件，所有所述距離固定件均與所述隔板的一側連接。
11.根據權利要求6-10中任一項所述的色譜柱隔板用於將色譜柱分成多個室的用途。
12.根據權利要求6-10中任一項所述的色譜柱隔板用於將色譜柱分隔成上色譜柱室和下色譜柱室的用途。
13.根據權利要求6-10中任一項所述的色譜柱隔板用於將色譜柱中的色譜材料分隔成兩個不同的部分的用途。
14.根據權利要求6-10中任一項所述的色譜柱隔板用於分隔一個色譜柱中兩種不同的色譜材料的用途。
15.色譜柱，其包括一個或多個根據權利要求6-10中任一項所述的色譜柱隔板。
16.根據權利要求15所述的柱，其特徵在於所述色譜柱包括一個或兩個色譜柱隔板。
17.根據權利要求15至16中任一項所述的柱，其特徵在於任一色譜柱隔板與第一種色譜材料接觸並與第二種色譜材料接觸，由此所述第一種和第二種色譜材料是a)具有相同的色譜功能基團且具有相同或不同粒度的色譜材料，或b)具有不同的色譜功能基團的色譜材料。
18.根據權利要求15至17中任一項所述的色譜柱用於純化多肽的用途。
19.色譜柱填充裝置，其特徵在於所述裝置在其底部處具有與根據權利要求6至10中任一項所述的色譜柱隔板相反的形狀和小於所述導向環的外徑的直徑。
20.成套部件，其包括a)根據權利要求6至10中任一項所述的色譜柱隔板，b)配件，c)色譜柱隔板施加裝置。
全文摘要
本發明涉及一種色譜柱隔板，所述隔板將色譜柱分隔成上色譜柱室和下色譜柱室，並且所述隔板在所述色譜柱內具有可變的位置且被色譜材料包埋。所述隔板允許更換所述上色譜柱室中的色譜材料而無需更換所述下色譜柱室中的色譜柱材料並且其還允許在一個色譜柱內組合具有不同的色譜功能基團的兩種不同的色譜材料。
文檔編號B01D15/22GK102470286SQ201080032204
公開日2012年5月23日 申請日期2010年7月28日 優先權日2009年7月30日
發明者安德烈亞斯·布拉舍克, 羅伯託·法爾肯施泰因 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司