一種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法
2023-08-11 04:27:41 2
專利名稱：一種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶催化合成改性甜菊糖苷的方法
技術領域：
—種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方 法，具體地說是以甜菊糖水溶液和澱粉水解液為原料，在微波反應裝置中經微波輻射與 CGTase酶催化的共同作用，合成改性甜菊糖苷。涉及有機化合物的生物合成技術領域。
背景技術：
甜菊糖是繼甘蔗和甜菜糖之後，第三種有開發價值的天然蔗糖替代品，被國際上 譽為"世界第三蔗糖"。它無毒副作用，無致癌物，食用安全，經常食用可預防高血壓、糖尿 病、肥胖症、心臟病、齲齒等病症，是一種可替代蔗糖的非常理想的甜味劑。但它有一個致命 的弱點，即後苦澀味，導致其甜度與蔗糖仍有很大差距。從甜葉菊中提取到的兩種主要甜味 物質為甜菊甙(Stevioside)和萊包迪甙A (Rebaudiosides A)，結構為
Stevioside (St) RebaudiosidesA(RebA) 其中Stevioside後苦澀味較重。利用酶例如CGTase催化轉苷、在甜菊糖特別是 Stevioside中引入新的糖基，可以溫和地改善甜菊糖的甜味特性，反應過程見方程式1。
CGTase
St +澱粉水解液-^ G-St + 2G-St + 3G-St十4G-St + 5G-St (方程式1) 注G = glucose (葡萄糖)殘基，2G = 2個glucose殘基，3G = 3個glucose殘基，4G = 4個glucose殘基，5G = 5個glucose殘基。 微波輻射雖然在某些情況下特別是常規化學反應中可以加快反應速度，但是由於 微波的熱和非熱效應以及酶催化合成的特殊性，同時由於水對微波的吸收遠較底物的強， 因此在水溶液中進行微波輔助下的酶催化反應很容易導致酶失活，故而一般在水溶液中進 行的微波酶催化反應並不常見。實驗發現在本發明所述的水溶液反應體系中，一定條件下 微波不僅不會導致酶失活，反而能大幅加快反應速率。經過反覆驗證，本發明用微波輔助 CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷。
發明內容
本發明的目的是提供一種用微波輔助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷的方法， 以甜菊糖水溶液和澱粉水解液為原料，微波輔助CGTase酶催化合成改性甜菊糖苷，應用本 發明可以高效、快速地合成改性甜菊糖苷。 本發明的技術方案一種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶CGTase催化合成改 性甜菊糖苷的方法，以CGTase酶為催化劑，以甜菊糖水溶液和澱粉水解液為原料，用微波 輻射促進反應，合成改性甜菊糖苷；所用甜菊糖水溶液和澱粉水解液的體積相同，甜菊糖水 溶液的質量濃度為2%，將底物甜菊糖澱粉按質量比為l : 0.3-1.5的比例混合，置於 80mL微波反應器中，再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶，將微波反應器移入微波反應裝 置，啟動微波輻射，輻射功率選擇範圍為40-80W，設定反應溫度為40-7(TC間的某一溫度， 待反應溫度達到設定值時開始計時，定時取樣進行高壓液相色譜分析(分析條件見參考文 獻[1]:中華人民共和國國家標準食品添加劑甜菊糖甙GB 8270-1999.)，反應至反應化合 物中原料甜菊甙的含量不變後停止微波加熱，得到無色透明的改性甜菊糖苷粗產品；改性 甜菊糖苷粗產品經乾燥、乙醇重結晶後得到白色晶體改性甜菊糖苷。經品嘗，其苦澀味大大 下降。 所述的甜菊糖是從甜葉菊中提取的、甜菊甙質量含量為40% _90%的甜菊糖，由 山東華仙甜菊股份有限公司購得，Stevioside含量的分析條件見參考文獻[1]。
所述的CGTase酶來源於浸麻芽孢桿菌(Bacallus macerans)，由日本天野酶製品 株式會社購得，在本反應中的加入量為10-40U/g甜菊糖；CGTase酶的酶活測定方法見參考 文獻[2] :Lejeune， A. ， Sakaguchi， K. ， Imanaka， T. Aspectrophotometric assay for the cyclization activity of cyclomaltohexaose(a -cyclodextrin)glucanotransferase. Anal Biochem 1989,181(1) :6-11.。 所述的澱粉水解液是用a -中溫澱粉酶水解木薯澱粉或玉米澱粉的水解液，澱粉 液化過程為稱取澱粉2g用水調成漿狀物，在攪動下緩緩傾入70mL沸水中。然後以30mL 水分幾次衝洗裝澱粉的燒杯，洗液併入其中，加熱至完全透明，冷卻，定容至100mL。加入2mL a _中溫澱粉酶(4U/mL)，在7(TC水浴中液化30min，此時水解反應已經達到平衡。
所述的a-中溫澱粉酶來源於枯草芽孢桿菌(Bacillus Subtilis)，由無錫雪梅 酶製劑科技有限公司購得，酶活測定方法見參考文獻[3]:中華人民共和國輕工行業標準 QB/T1803-1993.。 本發明的有益效果本發明所提供的合成改性甜菊糖苷的方法能將酶催化與微波 加熱有效結合，綜合利用酶催化和微波催化反應的諸多特點，能達到常規加熱下酶催化反應所不具有的良好效果，同時加快反應的進行，不會產生通常條件下水體系中微波使酶失 活的現象，從而提供了一種高效、快速的合成改性甜菊糖苷的方法。經品嘗，合成的改性甜 菊糖苷的苦澀味大大下降。
具體實施方式
實施例1將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入80mL微波 反應器，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應lmin。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為15.25%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為71%。
對照例1 (用常規加熱替代微波輻射) 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入50mL錐形 瓶中，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60。C水浴中反應30min， Stevioside的轉化率 達到16.45%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率 為71%。 實施例2將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入80mL微波 反應器，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應5min。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為36. 25%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為72 % 。
對照例2 (用常規加熱替代微波輻射)將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入50mL錐形 瓶中，加入10U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60。C水浴中反應45min， Stevioside的轉化率 達到35. 36%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率 為71. 5%。
實施例3將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入80mL微波 反應器，加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應lmin。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為45.45%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為77 % 。
對照例3 (用常規加熱替代微波輻射) 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入50mL錐形瓶 中，加入40U/g甜菊糖的CGTase酶液，在6(TC水浴中反應30min， Stevioside的轉化率達 到46. 94%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率為 76. 5%。 實施例4 將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的玉米澱粉水解液混合，移入80mL微波 反應器，加入20U/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W下攪拌反應lmin。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為20.63%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結
5晶後可以得到白色晶體產品，收率為70 % 。
實施例5將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入80mL微波反應 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、40W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為10.35%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為64% 。
實施例6將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入80mL微波反應 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、60W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為26. 27%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為70.4%。
實施例7將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入80mL微波反應 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在40°C 、80W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為11.61%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為66 % 。
實施例8將10mL 2 %的甜菊糖水溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入80mL微波反應 器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在50°C 、80W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液 相色譜分析。Stevioside的轉化率為22. 26%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結 晶後可以得到白色晶體產品，收率為70. 1 % 。
實施例9將10mL 2 %的甜菊糖溶液與10mL 2 %的澱粉水解液混合，移入80mL微波反應器， 加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在70°C 、80W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液相 色譜分析。Stevioside的轉化率為32. 35%。改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶 後可以得到白色晶體產品，收率為71. 2%。
實施例10 將10mL澱粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物澱粉甜菊糖為 0. 3 : 1 (w/w)混合，移入80mL微波反應器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W 條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉化率為15. 58%。改 性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率為69%。
實施例11 將10mL澱粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物澱粉甜菊糖為為 0. 5 : 1 (w/w)混合，移入80mL微波反應器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W 條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉化率為23. 57%。改 性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率為70. 5%。
實施例12 將10mL澱粉水解液與將10mL 2 %的甜菊糖水溶液按底物澱粉甜菊糖為為 1.5:1 (w/w)混合，移入80mL微波反應器，加入lOU/g甜菊糖的CGTase酶液，在60°C 、80W條件下攪拌反應5min。取樣進行高壓液相色譜分析。Stevioside的轉化率為20.46X。改 性甜菊糖苷粗產品經乾燥、用乙醇重結晶後可以得到白色晶體產品，收率為70. 3%。
權利要求
一種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶CGTase催化合成改性甜菊糖苷的方法，其特徵是以CGTase酶為催化劑，以甜菊糖水溶液和澱粉水解液為原料，用微波輻射促進反應，合成改性甜菊糖苷；所用甜菊糖水溶液和澱粉水解液的體積相同，甜菊糖水溶液的質量濃度為2％，將底物甜菊糖∶澱粉按質量比為1∶0.3-1.5的比例混合，置於80mL微波反應器中，再加入10-40U/g甜菊糖的CGTase酶，將微波反應器移入微波反應裝置，啟動微波輻射，輻射功率選擇範圍為40-80W，設定反應溫度為40-70℃間的某一溫度，待反應溫度達到設定值時開始計時，定時取樣進行高壓液相色譜分析，反應至反應化合物中原料甜菊甙的含量不變後停止微波加熱，得到無色透明的改性甜菊糖苷粗產品；改性甜菊糖苷粗產品經乾燥、乙醇重結晶後得到白色晶體改性甜菊糖苷。
2. 根據權利要求1所述的方法，其特徵是所述的甜菊糖是從甜葉菊中提取的、甜菊甙 質量含量為40% _90%的甜菊糖。
全文摘要
一種用微波輔助環糊精葡萄糖基轉移酶(CGTase)催化合成改性甜菊糖苷的方法，涉及有機化合物的生物合成技術領域。以甜菊糖水溶液和澱粉水解液為原料，在微波反應裝置中經由微波輻射與CGTase催化的共同作用合成葡萄糖基取代的甜菊糖苷。在本發明提供的工藝條件內，不僅可以顯著加快酶催化反應的進行，而且不會產生通常條件下水體系中微波使酶失活的現象。經品嘗，合成的改性甜菊糖苷的苦澀味大大下降。
文檔編號C12P19/56GK101775425SQ20101013112
公開日2010年7月14日 申請日期2010年3月24日 優先權日2010年3月24日
發明者夏詠梅, 張志勇, 方雲, 李薇, 王立成, 蔡亞, 陳凱 申請人:江南大學;常州市牛塘化工廠有限公司;南通市常海食品添加劑有限公司