人嚴重急性呼吸道綜合症(sars)免疫球蛋白的製作方法

2023-08-11 09:05:36 2

專利名稱：人嚴重急性呼吸道綜合症(sars)免疫球蛋白的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫學、血液學技術領域，涉及治療疾病的免疫球蛋白製劑，特別涉及治療人嚴重急性呼吸道綜合症/急性呼吸窘迫徵(SevereAcute Respiratory Syndrome SARS)。
背景技術：
SARS是一種急性呼吸道傳染病，主要通過近距離空氣飛沫和密切接觸傳播，起病急、傳播快，病死率高。SARS病人都是既往身體健康、年齡25～70歲的成年病人，也有一部分疑診SARS兒童(≤15歲)病例報告，潛伏期通常為2～7天，但可以長達10天。該病開始時一般先出現發熱(＞38℃)前驅症狀，發熱通常為高熱，有時伴有畏寒和寒顫，有時還伴有其他症狀包括頭痛、疲乏和肌痛，發病期間，一些病人有輕度的呼吸系統症狀。典型病例通常沒有皮疹和神經系統表現或胃腸道表現，但有一些病人報告，在出現發熱前驅症狀期間發生了腹瀉，3～7天後，病人開始進入下呼吸道受累期，開始出現乾咳或呼吸困難，可能伴有或發展為低氧血症。10％～20％病人的呼吸系統表現非常嚴重，需要插管和機械通氣，在出現發熱前驅症狀期間和整個病程中，胸部X線檢查可能正常。但是，大量病人在呼吸系統受累期間出現下列特徵性表現早期局灶性滲出，發展為更瀰漫的斑片狀間質性滲出。
中國香港的研究人員Peiris等報告了(Lancet 2003 3619365)50例SARS病人的臨床表現和病毒學研究結果。強有力的證據表明，新冠狀病毒可能是SARS的致病原因。研究者分析了50例SARS病人的病史記錄和微生物學研究結果，這50例病人是來自5個以上的獨立的流行病學聯繫的傳播聚集群。他們通過胸部X線檢查、鼻咽部抽吸物和血清標本的實驗室檢查來調查病原體，對這些病人的實驗室結果與其他呼吸道疾病患者的微生物學檢查結果進行了比較，結果顯示，發熱、寒戰、肌痛和咳嗽是最常見的症狀。與胸部X線變化相比，呼吸道症狀和聽診結果不成比例地顯著輕微，年齡較大、淋巴細胞減少、肝功能異常與嚴重疾病相關。2例病人分離出一種屬於冠狀病毒屬的病毒。採用這種病毒的特異性血清學和PCR(聚合酶鏈式反應)試驗的測試結果顯示，50例SARS病人中的45例，而對照組中無一例，有該病毒感染的證據。研究人員採用經典的病毒培養法、血清學技術和現代分子基因技術，描述和確定了香港50例SARS病人的發病原因。他們報告的一個優點是分析了來自對照病人的標本，這一點也是確定因果關係的一個重要手段。在40例患有其他呼吸系統疾病的病人中，無一例病人的呼吸道標本含有冠狀病毒的RNA，在來自獻血者的200份血清標本中也沒有發現抗這種新冠狀病毒的抗體。研究者稱沒有恆定地識別出經典的呼吸道的或細菌性呼吸道病原體。然而，從符合SARS定義的病人標本中分離出了一種新的冠狀病毒。在接種了咽拭子標本的Vero E6細胞中以顯微鏡檢查看到了細胞病理學特徵。培養細胞的電子顯微鏡檢查揭示了具有冠狀病毒特徵的超微結構特徵，免疫組織化學和免疫螢光染色展示了與I組冠狀病毒多克隆抗體的反應性。為了用逆轉錄-聚合酶鏈反應RT-PCR(擴增)冠狀病毒聚合酶基因的片段，他們設計並使用了冠狀病毒共有(序列)的引物，以取得一段序列，該序列清楚地識別了上述分離物是一種獨特的冠狀病毒，它與以往測過序的冠狀病毒只有較遠的關係。研究者用特異的診斷用RT-PCR引物，在12例不同地點的病人中識別出了數個相同的核苷酸序列，這一結果與從一個點發源的暴發一致。以此新的冠狀病毒製備的間接螢光抗體試驗和酶聯免疫吸附檢測法已被用於證實病毒特異性血清學反應。
2003年4月16日，世界衛生組織在日內瓦宣布，經過全球科研人員的通力合作，終於正式確認冠狀病毒的一個變種是引起非典型肺炎的病原體。來自中國、美國、中國香港和新加坡等10個國家和地區的13個實驗室的科學家在當日舉行的會議上，一致認定了變種冠狀病毒的作用。
SARS病毒是一種嶄新的冠狀病毒，而非某種已知冠狀病毒的近期變種。SARS病毒基因組研究表明在不同國家發生的SARS病毒沒有顯著的變異。SARS病毒存活時間比以往估計的長，SARS病毒在病人的糞便和尿中可存活數天。
冠狀病毒是RNA病毒。冠狀病毒屬Coronavirus是冠狀病毒科Coronaviridae中的一個屬，其成員包括三個組。第一組有犬冠狀病毒、貓冠狀病毒、貓傳染性腹膜炎病毒、人冠狀病毒229E、可傳播胃腸炎病毒等；第二組有牛冠狀病毒、人冠狀病毒OC43、小鼠肝炎病毒等；第三組包括傳染性支氣管炎病毒、火雞冠狀病毒和大鼠冠狀病毒。以上病毒中，人冠狀病毒引起人類普通感冒。
冠狀病毒病毒顆粒多為圓形、橢圓形或輕度多形性，直徑為60-220nm，表面有多個稀疏的棒狀突起，長約20nm。電鏡負染照片示病毒顆粒形似王冠，因而得名。病毒顆粒內有由病毒RNA和蛋白質組成的核心，外面有脂質雙層膜。此病毒對理化因素的抵抗力不強，56℃10分鐘可消除其感染性；pH3、用乙醚、氯仿或紫外線處理，均可使其滅活。
對冠狀病毒感染，尚無特異性抗病毒療法，而且關於冠狀病毒感染抗病毒治療的文獻報告也很少。SARS推薦的治療方案為密切觀察病情變化(多數病人在發病後14天內都可能屬於進展期)，預防和治療繼發細菌感染，抗病毒治療，有嚴重中毒症狀或達到重症病例標準者應用糖皮質激素，中藥輔助治療。
已有報導稱對重症病人可使用已康復非典型肺炎病人的血清進行治療。研究者對21例非典患者不同時期的血清研究，已將非典保護性抗體鎖定在IgG抗體上。對21例非典型患者採集了不同時期的序列血清，發現在非典病人發病一周內未產生IgG型抗體，IgG型抗體亦可在10-14天時檢測到，但滴度較低，60天時達到高峰，90天時仍維持在高水平。在調查的21例非典患者中，恢復期病人100％發現有IgG型抗體。感染SARS病毒病人如果在首兩星期內使用血清，病人的住院時間和發燒期會較短，死亡率會較低。香港醫師已經用SARS痊癒患者的血清成功治療了一些患者。但在目前的治療中，仍以利巴韋林和類固醇等藥物作為抗病毒的首選。因為血清需由康復者捐出，且會使初痊癒病人感覺難受，並還得選擇合適的血型配合才行。
病毒是一種抗原，能引起特異性免疫應答。病毒抗原刺激機體免疫系統可產生多種特異性抗體(IgG、IgM、IgA)。抗體與病毒結合後能使病毒失去感染性，抗體對病毒有中和作用，這種抗體稱為中和抗體。病毒感染後細胞表面抗原變化也能被宿主免疫系統識別，引起特異性免接應答。在病毒血症期間抗體如能充分發揮作用，則可防止嚴重臨床症狀產生。特異性抗體主要作用於游離病毒，亦可作用於受染靶細胞。IgG抗體對游離病毒的作用為病毒中和作用，其機制是抗體與病毒包膜或衣殼結合後，覆蓋住病毒吸附位點，病毒不能吸附和穿入易感細胞，喪失感染力，從而阻止病毒對易感靶細胞的吸附。血清中最主要的中和抗體是1gG。
免疫預防是目前人類對付病毒感染最根本的措施。對付急性病毒感染，人免疫球蛋白製劑是最常用的免疫血清。目前市場上常見的有人狂犬病免疫球蛋白、人破傷風免疫球蛋白、人B肝免疫球蛋白等。人免疫球蛋白製劑是由人血漿製備而得，對人體無任何副作用與過敏反應。而馬及其它動物血清製備的免疫球蛋白，對人體有嚴重副作用與過敏反應，因而不能大劑量使用於臨床搶救危重病人。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於預防和治療SARS的免疫製劑，該免疫製劑能及時有效地清除和殺滅體內的冠狀病毒等特異性抗原，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，並可用於高危人群的預防等特點。
本發明提供的用於預防和治療SARS的免疫製劑，是由SARS病人恢復期的血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人的血漿經低溫乙醇蛋白分離法提取後經病毒滅活處理製備的人SARS免疫球蛋白。
上述「低溫乙醇蛋白分離法提取」和「病毒滅活處理」的具體技術方案分別是低溫乙醇蛋白分離法提取包括(1)將抗SARS人血漿於反應罐混合攪拌後，調節pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.1-0.14，反應溫度為-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後用低溫連續離心法分離，得到組分I+II+III沉澱；(2)用組分I+II+III沉澱重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉澱組分I+II+III沉澱，調節pH 5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.01至0.015，反應溫度-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，用低溫連續分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉澱廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘後經澄清濾板(如NA12)深度過濾，濾液返回反應罐，調節pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.03至0.06，反應溫度-5至-7℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後離心得到組分II沉澱；(4)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱。
病毒滅活處理採用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
低pH孵化滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，並用1mol/L的鹽酸調節至pH4.10±0.3，然後用除菌濾板(如NA17)過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘餘乙醇檢測含量低於0.03％，蛋白含量為5±1％；然後用規格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經除菌過濾後的製品密閉後立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾。
巴氏滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調節至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾後再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩定劑(如甘氨酸)，然後進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒後的蛋白溶液立即冷卻，用規格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾。
本發明提供的用於預防和治療SARS的人SARS免疫球蛋白的製備方法包括以下步驟(1)將抗SARS人血漿於反應罐混合攪拌後，調節pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.1-0.14，反應溫度為-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後用低溫連續離心法分離，得到組分I+II+III沉澱；(2)用組分I+II+III沉澱重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉澱組分I+II+III沉澱，調節pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.01至0.015，反應溫度-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，用低溫連續分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉澱廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘後經澄清濾板(如NA12)深度過濾，濾液返回反應罐，調節pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.03至0.06，反應溫度-5至-7℃，繼續攪沉澱，拌2小時後靜置3至12小時，然後離心得到組分II沉澱。
(4)進行病毒滅活處理，可採用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
低pH孵化滅活病毒處理的內容及步驟是(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，並用1mol/L的鹽酸調節至pH4.10±0.3，然後用除菌濾板(如NA17)過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘餘乙醇檢測含量低於0.03％，蛋白含量為5±1％；然後用規格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經除菌過濾後的製品密閉後立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾，從而製得本發明人SARS免疫球蛋白。
巴氏滅活病毒處理的內容及步驟是(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調節至pH7.4±0.3，用除菌濾板(如NA17)過濾後再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5-10％，然後進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒後的蛋白溶液立即冷卻，用規格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾，從而製得本發明人SARS免疫球蛋白。
製備過程中使用的抗SARS人血漿為SARS病人恢復期的血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人的血漿。
本發明提供的人SARS免疫球蛋白含有高效價的SARS抗體，能與相應抗原特異性結合，結合後SARS抗體的Fc段變構，產生中和作用、調理作用、激活補體系統等生物學活性。此外SARS抗體的Fc段還能與吞噬細胞、NK細胞、B細胞毒性作用(ADCC)、胞飲抗原等，從而使機體立即獲得較強的免疫力，顯著增強機體的體液應答，及時有效地清除和殺滅體內的冠狀病毒等特異性抗原，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，還可用於高危人群的預防。


圖1為製備本發明人SARS免疫球蛋白的工藝流程，圖中字母F表示組分。
(2)也可在健康人群中進行SARS抗體篩選，當抗SARS≥8IU/ml即可採集免疫血漿。
(3)在有SARS疫苗的情況下，還可應用SARS疫苗免疫健康人後進行SARS抗體篩選和血漿採集。SARS疫苗免疫應按國家食品藥品監督管理局(SDA)批准的免疫程序進行。SARS疫苗應符合相關質控部門頒布的標準。免疫接種方法可採用皮內注射、皮下注射、肌肉注射以及多點小劑量免疫接種等。免疫接種部位包括左側或右側上臂、左右雙側上臂、左右雙側大腿內側等靠近淋巴結部位。抗SARS人血漿效價標準為應用SARS抗體酶標試劑盒或其他適宜方法測定SARS抗體效價，當抗SARS效價≥8IU/ml時即可採集免疫血漿。
2、人SARS免疫球蛋白的製備(1)抗SARS原料血漿合併與澄清用75％乙醇洗滌裝有抗SARS人血漿的血漿袋錶面，再用注射用水衝洗血漿袋錶面的殘餘乙醇，逐袋剪開血漿袋，30-37℃融化，融化後用網眼布過濾，再移入反應罐。
(2)組分組分I+II+III獲得混合血漿攪拌後大罐計量，調節pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.1-0.14，反應溫度為-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置8小時，然後用低溫連續離心法分離，得到組分I+II+III沉澱；(3)組分II上清獲得用組分I+II+III沉澱重量25倍0℃注射用水溶解沉澱組分I+II+III沉澱，調節pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.01至0.015，反應溫度-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置8小時，用低溫連續分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉澱廢棄；(4)收穫組分II沉澱每100ml組分I+III上清加入1g經20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘後經澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應罐，調節pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.03至0.06，反應溫度-5至-7℃，繼續攪拌2小時後靜置8小時，然後離心得到組分II沉澱。
(5)病毒滅活處理採用低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
①低pH孵化滅活病毒處A組分II溶解按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0℃注射用水溶解組分II沉澱，並用1mol/L的鹽酸調節至pH4.10±0.3，然後用除菌濾板NA17過濾。
B超濾濃縮濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/4，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘餘乙醇檢測含量低於0.03％，蛋白含量為5±1％。
C除菌過濾然後用規格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾。除菌濾膜規格0.2μm，組裝順序為預過濾膜NA17板→0.45μm→0.2μm，除菌前後均應按所用濾器及濾膜的要求進行完整性測試。
D病毒滅活將經除菌過濾後的製品密閉後立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天。
②巴氏滅活病毒處理按所得組分II沉澱重量的3-5倍量的0℃注射用水溶解組分II沉澱，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調節至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾後再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5-10％，然後進行60℃10小時巴氏滅活，滅活病毒後的蛋白溶液立即冷卻，用規格為0.2μm濾膜進行除菌過濾，組裝順序為預過濾膜NA17板→0.45μm→0.2μm，除菌前後均應按所用濾器及濾膜的要求進行完整性測試。
(6)DV50除病毒過濾將製品經已滅菌過的除菌濾器進行預過濾，預過濾膜規格為0.1μm，預過濾後的製品進行終端過濾(DV50過濾)。過濾前後要對DV50濾器進行膜完整性測試。
(7)第二次超濾將經病毒滅活及DV50除病毒過濾後的濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％。
(8)第二次除菌過濾用規格為0.2μm的除菌濾膜對上述濃縮液進行除菌過濾，從而得到用於預防和治療SARS的人SARS免疫球蛋白。
3.製品的分裝和包裝按2000年版《中國生物製品規程》中的《生物製品分裝規程》和《生物製品包裝規程》進行人SARS免疫球蛋白的分裝、包裝成液體製劑，或分裝、凍幹、包裝成凍幹製劑。
4.本發明人SARS免疫球蛋白理化指標的檢定
(1)物理檢查外觀本品主要組成成分為人SARS免疫球蛋白，液體製劑為無色或淡黃色的澄明液體。凍幹製劑為白色或乳白色疏鬆體，無融化現象，重融後呈無色或微黃色的澄明液體，可帶乳光。
(2)化學檢定按2000年版《中國生物製品規程》中的《生物製品化學檢定規程》進行。
pH值用生理鹽水稀釋至1％蛋白質濃度，在20±2℃測定，pH應為6.4-7.4。
純度免疫球蛋白的含量應不低於蛋白含量的90％。
IgG單體及二聚體含量IgG單體及二聚體含量之和應≥90％。
(3)熱穩定性試驗人SARS免疫球蛋白的製劑於57±0.5℃水浴保溫4小時，應無凝膠或絮狀物。
(4)蛋白質含量用鎢酸沉澱法測定，蛋白質含量應不高於180克/升。
(5)鑑別試驗用免疫雙擴散法。應只與抗人的血清產生沉澱線，與抗馬、抗牛血清不產生沉澱線。
(6)抗SARS效價測定應用軍事醫學科學院微生物流行病研究所提供的SARS抗體酶標試劑盒檢測，效價應不低於100IU/ml。
(7)無菌試驗按2000年版《生物製品無菌試驗規程》進行。
(8)安全試驗按2000年版《人免疫球蛋白的製造及檢定規程》進行。
(9)熱原質試驗按2000年版《生物製品熱原質試驗規程》進行。
5.本發明人SARS免疫球蛋白使用說明(1)成品規格本品肌肉注射規格為100IU/瓶，200IU/瓶，包裝規格為每箱500瓶。
本品靜脈注射規格為10000IU/瓶，20000IU/瓶，包裝規格為每箱500瓶。
(2)質量標準本品依據《中國生物製品規程》2000年版人免疫球蛋白製劑生產和檢定，質量符合要求。
(3)適應證受SARS病毒感染病人的治療，還可用於高危人群的預防。
(4)用法與劑量通常採用靜脈注射，也可做肌內或皮下注射。預防劑量1次皮下或肌內注射100～200IU，兒童與成人用量相同，必要時可間隔3-4周再注射一次；治療劑量疑似意外感染者，立即(最多不超過7天)按體重注射8-10IU/kg，以後視病情決定注射劑量與間隔時間。
(5)禁忌過敏體質者慎用。
(6)副反應及處理過敏反應的處理主要症狀為蕁麻疹、發熱等，一般系在注射後7-14天發病，亦有在注射後2-4天發病。症狀輕者停藥即可，重者可使用鈣劑或抗組織胺藥物，一般數日即可痊癒。
(7)注意事項本品有液體及凍幹兩種類型。製品混濁，有搖不散的沉澱、異物或瓶身有裂紋，標籤不清，過期失效者均不可使用。製品打開後應一次用完。凍幹製品應加標籤規定量滅菌注射用水，輕搖使完全溶解。
(8)保存、運輸及使用期限於2～8℃避光乾燥處保存和運輸。在盒籤(瓶籤)標明的失效期前使用。
權利要求
1.一種用於預防和治療SARS的免疫製劑，它是由SARS病人恢復期血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人血漿經低溫乙醇蛋白分離法提取後經病毒滅活處理製備的人SARS免疫球蛋白。
2.根據權利要求1所述的用於預防和治療SARS的免疫製劑，其特徵在於所說的經低溫乙醇蛋白分離法提取包括(1)將抗SARS人血漿於反應罐混合攪拌後，調節pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.1-0.14，反應溫度為-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後用低溫連續離心法分離，得到組分I+II+III沉澱；(2)用組分I+II+III沉澱重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉澱組分I+II+III沉澱，調節pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.01至0.015，反應溫度-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，用低溫連續分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉澱廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘後經澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應罐，調節pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.03至0.06，反應溫度-5至-7℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後離心得到組分II沉澱。
3.根據權利要求1所述的用於預防和治療SARS的免疫製劑，其特徵在於所說的病毒滅活處理是低pH孵化滅活病毒處理或巴氏滅活病毒處理。
4.根據權利要求3所述的用於預防和治療SARS的免疫製劑，其特徵在於所說的低pH孵化滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，並用1mol/L的鹽酸調節至pH4.10±0.3，然後用除菌濾板NA17過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘餘乙醇檢測含量低於0.03％，蛋白含量為5±1％；然後用規格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經除菌過濾後的製品密閉後立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)滅活病毒後用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾，再進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
5.根據權利要求3所述的用於預防和治療SARS的免疫製劑，其特徵在於所說的巴氏滅活病毒處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調節至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾後再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5％-10％，然後進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒後的蛋白溶液立即冷卻，用規格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
6.製備人SARS免疫球蛋白的方法，包括(1)將抗SARS人血漿於反應罐混合攪拌後，調節pH5.95±0.10，乙醇濃度20％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.1-0.14，反應溫度為-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後用低溫連續離心法分離，得到組分I+II+III沉澱；(2)用組分I+II+III沉澱重量20-30倍0-4℃注射用水溶解沉澱組分I+II+III沉澱，調節pH5.10±0.10，乙醇濃度14％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.01至0.015，反應溫度-3至-6℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，用低溫連續分離法獲得組分I+III上清，將組分I+III沉澱廢棄；(3)每100ml組分I+III上清加入1g經20％乙醇處理過的硅藻土，攪拌30分鐘後經澄清濾板NA12深度過濾，濾液返回反應罐，調節pH7.40±0.20，乙醇濃度25％，用濃度為1-2mol/L的磷酸氫二鈉溶液和/或濃度為1-2mol/L的氯化鈉溶液調節離子強度至0.03至0.06，反應溫度-5至-7℃，繼續攪拌2小時後靜置3至12小時，然後離心得到組分II沉澱；(4)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，經病毒滅活處理製得人SARS免疫球蛋白。
7.根據權利要求6所述的製備人SARS免疫球蛋白的方法，其特徵在於所述的病毒滅活處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量加入0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，並用1mol/L的鹽酸調節至pH4.10±0.3，然後用除菌濾板NA17過濾；濾液用超濾方法進行濃縮，先濃縮蛋白溶液至原體積1/3至1/5，再用濃縮液5倍量的注射用水超濾透析脫醇，使殘餘乙醇檢測含量低於0.03％，蛋白含量為5±1％；然後用規格為0.2μm的除菌濾膜進行除菌過濾；(2)將經除菌過濾後的製品密閉後立即送入24℃±1℃定溫室孵化24天滅活病毒；(3)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾；濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
8.根據權利要求6所述的製備人SARS免疫球蛋白的方法，其特徵在於所述的病毒滅活處理包括(1)按所得組分II沉澱重量的3-5倍量的0-4℃注射用水溶解組分II沉澱，用濃度為1mol/L的鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉調節至pH7.4±0.3，用除菌濾板NA17過濾後再進行超濾脫醇，使蛋白濃度在2％±0.02，加入穩定劑甘氨酸，使甘氨酸在溶液中的濃度為5％-10％，然後進行60℃10小時巴氏滅活病毒，滅活病毒後的蛋白溶液立即冷卻，用規格為0.2μm濾膜進行除菌過濾；(2)用規格為0.1μm的濾膜進行預過濾後進行DV50除病毒過濾，濾液用濃度為1mol/L鹽酸或1mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH6.4-7.4，用生理鹽水透析3-4倍後濃縮至蛋白質含量不超過18％，再用規格為0.2μm的除菌濾膜對所得濃縮液進行除菌過濾。
全文摘要
一種用於預防和治療SARS的免疫製劑，它是由SARS病人恢復期血漿或者含高效價SARS病毒抗體的健康人血漿經低溫乙醇蛋白分離法提取並經病毒滅活處理製備的人SARS免疫球蛋白，能有效地治療受SARS病毒感染的病人，還可用於高危人群的預防。
文檔編號C07K16/08GK1449833SQ0312811
公開日2003年10月22日 申請日期2003年6月7日 優先權日2003年6月7日
發明者楊曉明, 鄒漢武, 方志正, 葉巨兵, 李策生 申請人:武漢生物製品研究所