腦膜炎球菌疫苗及其製備方法
2023-08-02 14:01:21 2
專利名稱：腦膜炎球菌疫苗及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種腦膜炎球菌疫苗。具體而言，本發明涉及一種腦膜炎球菌結合疫苗。更具體而言，本發明涉及一種含有A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯的結合疫苗。本發明還涉及這種疫苗的製備方法。
腦膜炎奈瑟氏球菌俗名為腦膜炎球菌，學名為Neisseriameningitidis，有時也稱為奈瑟氏腦膜炎球菌。腦膜炎奈瑟氏球菌為需氧菌，革蘭氏陰性有莢膜常成雙排列，故又稱為雙球菌。由於無莢膜菌株幾乎不引起臨床疾病，因此莢膜在細菌毒力方面扮演了重要作用。根據莢膜多糖特性的不同至少可分為13個血清群A、B、C、D、E29、H、I、K、L、W135、X、Y、Z。但只有屬於A，B，C，Y和W135這5個群中的任一群才會致病，90％的腦膜炎球菌疾病是由A、B、C三群引起的。
腦膜炎奈瑟氏球菌是全世界細菌性腦膜炎中主要的病原體。世界唯一能引起腦膜炎大規模爆發流行細菌。即使有良好的醫療條件，急性腦膜炎球菌經常可於發病後一二天內產生死亡或留下嚴重後遺症。化學藥品對於控制疾病爆發流行幾乎沒有價值。更為重要的是，隨著抗菌素大量使用和/或濫用，在世界許多地方包括中國在內的腦膜炎球菌對抗菌素的耐藥性大量增加，就使得通過免疫接種疫苗來預防和控制該病成為緊迫的任務。
當前已有2類疫苗在大規模應用。第一類是多糖疫苗國際市場上有單價、兩價和四價腦膜炎球菌多糖疫苗，即A、A+C和A+C+Y+W135。該類疫苗是經純化的莢膜多糖製備而成。第二類是腦膜炎球菌結合疫苗即C群特異性莢膜多糖與一蛋白載體經偶聯後的結合疫苗。
第一類多糖疫苗非常安全，明顯的全身性反應極少見。最常見的副反應為注射部位持續1至2天的發紅和輕微的疼痛。超過38.5℃的發熱比率為1％-4％。單價疫苗、二價疫苗和四價疫苗在安全性或反應原性方面沒有顯著性差異。但是，A群多糖在兩歲以下年齡組中表現很弱的免疫原性和短暫的保護期，而C群多糖在兩歲以下年齡組中根本就沒有免疫原性。腦膜炎球菌多糖抗原與其他類多糖抗原一樣屬於T細胞非依賴性抗原，不能誘導出免疫記憶反應，再次免疫接種不能起到加免疫的效應，故對嬰幼兒免疫效果差。因此A群和C群多糖疫苗不宜用於嬰幼兒和常規免疫接種程序中。
第二類是腦膜炎球菌結合疫苗，多糖和蛋白載體偶聯後，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產生抗體應答，並能誘導T細胞免疫記憶反應。目前已有3種C群腦膜炎結合疫苗(MCC)獲得在國際上上市，其中兩種是將多糖連結到突變無毒白喉毒素(CRM197)上，另一個是將破傷風類毒素作為載體蛋白。上述結合疫苗均能產生足夠高水平的抗莢膜IgG抗體和有免疫記憶的B細胞。英國於1999年將C群多糖結合疫苗納入預防C群腦膜炎的國家免疫程序中。A群腦膜炎結合疫苗正在開發中，而A群腦膜炎球菌在引起大規模流行的各群腦膜炎球菌中佔主導地位。
免疫實踐證明，細菌莢膜多糖屬於T細胞非依賴性抗原，其免疫效果與接種對象的年齡明顯相關，嬰幼兒的免疫系統發育尚不完善，接種多糖疫苗後不能有效激活T輔助細胞和T記憶細胞，不能誘導產生免疫回憶反應，因而，免疫保護時間短暫，再次免疫接種也不能產生加強免疫效應。同時，腦膜炎球菌多糖抗原雖能誘導產生IgM和IgG抗體，但人類所產生的IgG主要是IgG2亞類，而人血清IgG2亞類抗體出現較遲，一般要到8-12歲才能上升至成人水平。這可能與分泌IgG2亞類抗體的B淋巴細胞發育遲緩有關。故此，嬰幼兒接種多糖疫苗後，產生只有短暫作用的IgM抗體為主。為提高多糖疫苗的免疫效果，主要辦法是將多糖抗原與蛋白載體結合，使其轉變為T細胞依賴性抗原。研究表明，多糖與蛋白載體結合後，T細胞能識別載體，刺激B細胞對多糖產生應答，並能誘導T細胞的免疫回憶反應使更多的B細胞產生特異性抗體。
已經發現，多糖和蛋白載體偶聯後的效果在Hib(b型流感嗜血桿菌)結合疫苗和C群腦膜炎球菌結合疫苗中得到了驗證。B群腦膜炎球菌外膜蛋白作為一種載體蛋白的功能也在Hib結合疫苗中被證實。目前，國際上Hib結合疫苗所用的4種載體分別為；破傷風類毒素、白喉類毒素、無毒性白喉變異株(CRM197)毒素和B群腦膜炎球菌外膜蛋白。盧錦漢，醫學生物製品學，人民衛生出版社，1995年，380頁中公開了B群腦膜炎球菌外膜蛋白的一種製備方法。該製備方法依據蔗糖密度梯度離心從破碎的B群腦膜炎球菌菌體的混合勻漿中分離B群腦膜炎球菌外膜蛋白，包括的主要步驟有培養菌體、分離菌體細胞、低滲破碎細胞、超速離心獲得外膜沉澱物、採用密度梯度離心純化外膜蛋白(反覆兩次)、溶解、增溶、除菌過濾、沉澱等步驟。由於需要的離心速度高，並且需要反覆兩次的密度梯度離心和溶解，所以對設備投資要求較高，十分繁瑣，步驟繁多複雜。所得產物為各種B群腦膜炎球菌外膜蛋白的混合物，沒有進一步分離。
基於現有腦膜炎疫苗的上述問題，WHO和比爾蓋茨基金合作加速在短期內開發出較低價格的腦膜炎球菌A+C群結合疫苗。WHO將開發有效、安全和適宜價格的多價腦膜炎球菌結合疫苗作為最優先考慮的事。
鑑於上述原因，需要對腦膜炎球菌疫苗進行革命性地改造，開發出較低價格用於兩歲以下年齡的兒童和嬰幼兒的A、C群腦膜炎球菌結合疫苗。
本發明所用腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)菌株購買於中國醫學細菌保藏中心(CMCC)，其菌株號為；CMCC(B)29201 A4株CMCC(B)29205 C11株CMCC(B)29356 B4株CMCC(B)29361 B15株中國醫學細菌保藏中心的全稱為醫學微生物菌種保藏管理中心，上述菌株保藏在該中心所屬單位中國藥品生物製品檢定所，北京(NICPBP)。該機構生產、銷售這些菌株，公眾可以購買。
在本發明的一個實施方案中，A群腦膜炎球菌多糖製備時可採用的菌株為CMCC(B)29201，C群腦膜炎球菌多糖製備時可採用的菌株為CMCC(B)29205，而B群腦膜炎球菌外膜蛋白製備時可採用的菌株為CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。如果滿足需要，也可採用其它合適的菌株，這裡給出的菌株僅僅是為了例示性說明本發明。
本發明分別採用罐液體培養A、C群腦膜炎球菌，甲醛殺菌，連續流離心收集上清液，加Cetavlon沉澱多糖，連續離心收集多糖複合物，再經CaCl2解聚而獲得粗多糖，用醋酸鈉溶液溶解粗多糖，並經冷酚抽提，透析，超濾而分別獲得A、C群精製純化多糖。A、C群腦膜炎球菌多糖的層析分析參見
圖1和圖2。關於A群腦膜炎球菌多糖的製備方法的細節，參考中國生物製品規程2000年版。C群腦膜炎球菌多糖的製備細節與A群腦膜炎球菌多糖的製備方法相同。
本發明所用B群腦膜炎外膜蛋白可以使用已知方法製備，例如盧錦漢，醫學生物製品學，人民衛生出版社，1995年，380頁中公開的方法。
進一步而言，可以對B群腦膜炎外膜蛋白進行進一步分離，使用含1類、2類或者1類、3類外膜蛋白作為載體。
所以，本發明的一個方面是提供了一種新穎的B群腦膜炎外膜蛋白製備方法。該方法採用罐液體培養，連續離心而獲得B群菌體再採用LiCl抽提獲得B群腦膜炎外膜蛋白，經乙醇沉澱，離心超濾，柱層析而獲得B群外膜蛋白。此處公開的B群腦膜炎外膜蛋白的製備方法與盧錦漢公開的方法截然不同(參考，盧錦漢，醫學生物製品學，人民衛生出版社，1995年，380頁)。
本發明所提供的B群腦膜炎外膜蛋白的製備方法的特點在於離心速度低，步驟相對簡單，並且對於B群腦膜炎外膜蛋白進行了分離。B群腦膜炎球菌外膜蛋白包括5種，分別是1類、2類、3類、4類和5類外膜蛋白。其中1類外膜蛋白是B群腦膜炎球菌亞型分類的基礎，是一種44,000-47,000 Dolton的熱穩定蛋白。2類或3類外膜蛋白是不能同時存在於同一菌株，分子量均為37,000-42,000 Dolton的熱穩定蛋白，常以三聚體形式存在，可誘導特異性抗體產生。4類和5類外膜蛋白對於誘導特異性抗體的產生作用不大。所以本發明的一個特點在於對B群腦膜炎外膜蛋白進行分離。圖3是B群腦膜炎球菌外膜蛋白的柱層析圖，可以看到主要有三個峰。在本發明中，可以使用三個峰中的洗脫溶液中群腦膜炎球菌外膜蛋白的作為載體。優選實施方案中，採用峰1和峰2的洗脫物作為載體，也即優選使用1類、2類或者1類、3類外膜蛋白作為載體。
本發明採用溴化氰(CNBr)活化A、C群多糖，以己二醯肼(ADH)為雙功能親核間隔基，使之形成多糖己二醯肼衍生物，再通過碳二亞胺(EDAC)介導的縮合作用與B群外膜蛋白共價結合，分別獲得A、C群多糖-B群外膜蛋白結合物，再經超濾濃縮，柱層析而獲得高分子量偶聯物，稀釋分裝而成結合疫苗。
本發明提供的組合疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖，它們分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結合。雖然B群腦膜炎球菌外膜蛋白在本發明中主要作為載體發揮作用，但是它的作用也許超出了普通載體的作用，因為它本身是來源於B群腦膜炎球的高分子物質，具有一定的免疫原性，可能會對逐年增加的B群腦膜炎球菌疾病產生預防作用。因此，B群腦膜炎球菌外膜蛋白在本發明的疫苗中的作用不應該等同於已有技術的公開。進而言之，可以理解的是，本發明的疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖、C群腦膜炎球菌莢膜多糖和B群腦膜炎球菌外膜蛋白，其中A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白結合。
優選地，本發明提供的組合疫苗包括A群腦膜炎球菌莢膜多糖和C群腦膜炎球菌莢膜多糖，它們分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白中的1類和2類或者1類和3類外膜蛋白共價結合。應該理解的是，在本實施方案中，組合疫苗中作為載體的B群腦膜炎球菌外膜蛋白主要成份是含有1類和2類或1類和3類的外膜蛋白。
如上所述，在多糖和蛋白形成偶聯物的過程中，可以由單個A群多糖或C群多糖經活化後可能有多個位點同時結合多個B群腦膜炎球菌外膜蛋白。同樣也可以由活化後的單個B群腦膜炎球菌外膜蛋白的多個位點同時結合多個A或C群多糖。多糖和蛋白的結合併不限定於11，也就是一個多糖分子上可以偶聯上1個或者多個蛋白；同樣地，一個蛋白分子上可以偶聯上1個或者多個多糖分子。在多糖和蛋白的偶聯中，優選發生多糖和蛋白的一一對應的結合。但是如上所述，多糖和蛋白的各種結合只要並不影響本發明的結合疫苗所能達到的效果，那麼所有這些偶聯中的細節變化均應包括在本發明範圍之內。
多糖與蛋白的偶聯有多種已知的方法，在此所述的偶聯方法僅僅是用於說明。所以，可以採用各種等同的方法實現本發明所述的偶聯過程，因此任何用於分子偶聯的方法和工藝或者過程都有可能用於實施本發明。
在本發明的疫苗中，A群、C群腦膜炎球菌結合疫苗的動物試驗每劑免疫劑量為含有A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖各1.25-2.5g，優選地所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結合疫苗的每劑人用免疫劑量中各有5-20g。當然，根據免疫對象的體質狀況可以有所變化。至於用量的上限，本領域的技術人員可以根據疫苗使用的常規實踐靈活掌握。
並且，在本發明的疫苗中可以進一步添加吸附劑，例如氫氧化鋁和/或磷酸鋁等鋁佐劑。使用時，可以對本發明的結合疫苗進行稀釋，合適的稀釋液的不限定的實例有緩衝生理鹽水稀釋液。
本發明的疫苗可以採用常規接種方式，例如腹腔接種、肌肉或皮下接種等。腹腔接種較麻煩，安全性較差，故優選肌肉或皮下接種方式。免疫接種推薦使用三針。
本發明對現有商業化多糖疫苗在下列方面進行了改進1、更少的反應原性本發明的疫苗中沒有摻入蔗糖或明膠等穩定劑，從而減少了現有疫苗的反應原性。
2、本方法選擇適宜的超濾膜超濾抗原，並採用柱層析法純化獲得的高分子量偶聯物，從而提高了抗原的免疫原性。
3、提高了免疫效力本發明由於將腦膜炎球菌多糖抗原轉變為T細胞依賴性抗原，能誘導出免疫記憶反應，再次免疫接種能起到加強免疫的效應。
4、將疫苗接種人群擴展到兩歲以下的兒童和嬰幼兒本發明的疫苗對兩歲以下的兒童和嬰幼兒能提供良好的免疫保護力，誘導免疫記憶反應，並可維持長期的免疫保護作用。
5、對現有免疫程序中的疫苗無幹擾性本發明的疫苗沒有選破傷風類毒素、白喉類毒素和/或突變的無毒白喉毒素(CRM197)作為載體蛋白載體，就避免了對現有免疫程序中的疫苗效果(例如百白破疫苗)的幹擾性。
6、選擇B群腦膜炎球菌外膜蛋白作為載體蛋白，也是基於在世界範圍內B群腦膜炎球菌發病率逐年升高，且截止目前尚無相應的有效疫苗。B群腦膜炎球菌外膜蛋白除具有載體蛋白功能外，還可產生足夠的抗B群腦膜炎球菌抗體，對B群腦膜炎球菌的感染能起到一定的預防作用。
7、本發明的B群腦膜炎球菌外膜蛋白製備、純化工藝方面有了顯著的改進，製備所需設備，人力和物力消耗降低，過程簡單，節約時間，並且可以進一步對B群腦膜炎球菌外膜蛋白進行分離。
總之，至今還沒有一種新的腦膜炎球菌A+C群結合疫苗能滿足上述優點。而且，本發明所述疫苗的製備方法也有獨到之處，克服了已有技術存在的有些問題。
圖2、C群腦膜炎球菌莢膜多糖柱層析圖，表明其分子量不均一。
圖3、B群腦膜炎球菌外膜蛋白柱層析圖，其中圖中的3個峰，從左到右分別代表1類外膜蛋白、2/3類外膜蛋白和4/5類外膜蛋白。
圖4、A群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結合物柱層析圖。圖中的上層峰A群腦膜炎球菌莢膜多糖峰，結合後，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰B群腦膜炎球菌外膜蛋白峰，與多糖結合後，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
圖5、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白共價結合物柱層析圖。圖中的上層峰C群腦膜炎球菌莢膜多糖峰，結合後，分子量增大，以V0附近高分子量化合物為主；下層峰B群腦膜炎球菌外膜蛋白峰，與多糖結合後，分子量隨之增大，以V0附近高分子量化合物為主。
實施例1B群腦膜炎球菌外膜蛋白的製備啟開B群腦膜炎球菌菌株接種於半綜合斜面，擴菌傳至第五代液體罐培養，連續離心收集菌體，用0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5MCH3COONa混合物提取外膜蛋白。35-45℃振蕩1-3小時。離心4000-8000轉/分×1小時，收集上清，繼而加乙醇濃度至60-80％沉澱外膜蛋白。用注射溶液復溶後，通過超濾收集400KD過濾液，再經30KD超濾膜濃縮。用SDS-PAGE檢測所需1、2類或1、3類外膜蛋白含量。Sephacryl S 200-400層析，收集所需1、2類或1、3類外膜蛋白。檢測蛋白含量(Lowry法)、主要成份及1、2類或1、3類外膜蛋白的純度(SDS-PAGE法)和內毒素含量(鱟試劑法)、無菌試驗(見中國生物製品規程2000年版)。
實施例2A群腦膜炎莢膜球菌多糖偶聯A群腦膜炎莢膜球菌多糖稀釋至4mg/ml加溴化氰活化多糖，23±3℃下作用1-1.5小時，調PH並維持pH9-11，繼後加已二醯肼2.5～5mg/mgps，維持pH8-10作用10-30分鐘，在2-8℃攪拌10-20小時，透析去除小分子物質，取樣測溴化氰殘餘量，己二醯肼衍化率。加等量B群腦膜炎球菌外膜蛋白與多糖混合，加碳二亞胺15-25mg/ml混合物，5-15℃作用1-1.5小時，調整PH5-7。偶聯原液透析去除小分子物質。300KD膜包超濾濃縮，經Sepharose CL-4B柱層析，收集高分子量的偶聯化合物(參見圖4)，除菌過濾檢測磷含量，蛋白含量，計算多糖，蛋白比值，分子量測定及KD0.3回收率，多糖蛋白鑑別試驗、內毒素含量、無菌試驗(見中國生物製品規程2000年版)。各項檢驗合格後，待稀釋合併、分裝。
實施例3C群腦膜炎球菌莢膜多糖偶聯C群腦膜炎莢膜球菌多糖稀釋至4mg/ml，加溴化氰(CNBr)活化多糖，20～30℃下作用1-1.5小時，調PH並維持PH9-11，繼後加已二醯肼(ADH)2.5～5mg/mg多糖，維持PH8-10，反應30分鐘，在2-8℃攪拌10-20小時，透析去除小分子物質。取樣測CNBr殘餘量，ADH衍化率。加等量B群腦膜炎球菌外膜蛋白與多糖混合，加碳二亞胺(EDAC)15～25mg/ml混合物，5-15℃反應1-1.5小時，調PH5-7。偶聯原液透析去除小分子物質，300KD膜包超濾濃縮，經SepharoseCL-4B柱層析，收集高分子量的偶聯化合物(參見圖5)，除菌過濾，檢測唾液酸含量，蛋白含量計算多糖，蛋白比值，分子量測定及KD0.3回收率，多糖、蛋白鑑別試驗、內毒素含量、無菌試驗(見中國生物製品規程2000年版)，各項檢定合格後，待稀釋，合併、分裝。
實施例4不含有佐劑的A、C群腦膜炎球菌結合疫苗根據A、C群多糖偶聯原液測定結果，稀釋分裝，使每支結合疫苗0.5ml裝量，含有A、C群多糖各10μg，並分別測定PH值，NaCl含量，A、C群多糖含量硫柳汞含量，高分子結合物含量，鑑別試驗，急性毒性安全試驗，鑑別試驗，無菌試驗，熱原質試驗，免疫原性試驗，合格製品存放於2-8℃存。
實施例5氫氧化鋁(佐劑)吸附A、C群腦膜炎球菌結合疫苗稀釋、分裝根據A、C群腦膜炎球菌偶聯物半成品原液多糖測定的含量，以滅菌、無熱原的氫氧化鋁稀釋液稀釋疫苗原液。使每劑量含有A、C群多糖各8-14g，氫氧化鋁0.6-1.4mg，NaCl 0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀釋過程中緩慢加入氫氧化鋁稀釋液，並充分混勻，使之形成均勻分布的懸濁液。無菌、無熱原分裝結合疫苗，使每劑量≥0.5ml。
實施例6緩衝生理鹽水稀釋、分裝A、C群腦膜炎球菌結合疫苗根據A、C群腦膜炎球菌偶聯物半成品原液多糖測定的含量，以滅菌、無熱原的緩衝生理鹽水稀釋液稀釋疫苗原液。使每劑量含有A、C群多糖各8-14g，NaCl0.75-1.0％，PH5.4-7.0。在疫苗稀釋過程中緩慢加入緩衝生理鹽水稀釋液，並充分混勻，使之形成均勻分布的清亮懸液。無菌、無熱原分裝結合疫苗，使每劑量≥0.5ml。
實施例7A、C群腦膜炎球菌結合疫苗檢測根據A、C群腦膜炎球菌多糖偶聯原液測定結果，稀釋分裝，使每支結合疫苗≥0.5ml裝量，含有A、C群多糖各8-14μg，並分別測定高分子結合物含量、PH值，NaCl含量、A、C群多糖含量、硫柳汞含量、鑑別試驗、急性毒性安全試驗、鑑別試驗、無菌試驗、熱原質試驗、免疫原性試驗(見中國生物製品規程2000年版)，合格製品存放於2-8℃存。
實施例8A、C群腦膜炎球菌結合疫苗接種劑量比較分別選用SPF級，Balb/c小鼠每組20隻，每組小鼠分別皮下接種各含A、C群多糖各5μg、2.5μg，1.25μg，0.625μg的結合疫苗於0、14天各免疫一劑，第21天採血分離血清，用ELISA測定每隻小鼠血清的IgG抗體滴度，計算GMT統計學處理，分析接種劑量的影響因素，兩次試驗結果列於表1。
表1.A、C群腦膜炎球菌結合疫苗接種劑量比較
兩次動物試驗結果證實，2.5μg免疫劑量效果較為理想，既節省了抗原量，又達到了較高的抗體滴度。
實施例9A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫途徑比較試驗分別選用SPF級Balb/C小鼠，每組20隻，各接種A、C群多糖各2.5μg的結合疫苗分別於0、14天各接種一針，第21天採血，分離血清，ELISA測定抗體濃度計算GMT，其免疫途徑分別採用皮下，肌肉，腹腔注射。現將兩次實驗結果列於表2。
表2.A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫途徑比較
以上三種免疫途徑兩次實驗比較說明，其IgG GMT結果相似，統計學處理無顯著性差異P＜0.05。但腹腔接種較麻煩，安全性較差，故可選擇肌肉或皮下接種。
實施例10A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫免疫針次比較試驗分別選用SPF級Balb/c小鼠，每組20隻，分別皮下接種含A、C群多糖各2.5μg的結合疫苗，免疫程序為0、14、28天各接種1針，末次免後2周採血，分離血清，測定每隻小鼠血清的IgG抗體濃度，計算每組小鼠的GMT，實驗結果統計如表3。表3. A、C群腦膜炎球菌結合疫菌免疫針次比較試驗
以上結果表明，結合疫苗具有明顯的免疫回憶反應，三針免疫後，抗體增長明顯，因此，免疫接種推薦使用三針。
實施例11A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫原性研究在以上實驗工作的基礎上進行了A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫原性研究，選用SPF Balb/c小鼠，每組20隻，分別皮下接種含A、C群多糖各2.5μg的結合疫苗於0、14、28天各免疫一針，第42天採血，分離血清，採用ELISA分別測定每隻小鼠血清的抗體滴度，並計算GMT，實驗結果統計如表4。
表4.A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫原性研究
實驗結果表明A.C群腦膜炎球菌結合疫苗具有較好的免疫原性。
實施例12用氫氧化鋁吸附劑和緩衝生理鹽水兩種稀釋液配製的A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫原性比較研究選用SPF Balb/c小鼠，每組20隻，分別皮下接種兩種稀釋液配製的含A、C群多糖各2.5μg的結合疫苗於0、14、28天各免疫一針，於免後1、2周分別採血，分離血清，採用ELISA分別測定每隻小鼠血清的抗體滴度，並計算GMT，實驗結果統計如表5。表5.兩種稀釋液配製的A、C群腦膜炎球菌結合疫苗免疫原性比較
動物試驗證明，兩種稀釋液配製的A、C群腦膜炎球菌結合疫苗均能產生明顯的抗體應答和免疫回憶反應。但兩者在刺激機體快速產生抗體應答、加強免疫後的回憶反應、抗體滴度及免疫持久性方面有明顯差異。
實施例13A.C群腦膜炎球菌結合疫苗的安全性對A.C群腦膜炎球菌結合疫苗的安全性進行考核，分別採用小鼠、豚鼠異常毒性試驗法，考核其安全性。
選用豚鼠、腹腔接種10個人用劑量A.C群腦膜炎球菌結合疫苗，分別於免前、免後10天稱體重，並隨時觀察接種反應。
選用SPF級Balb/C小鼠，腹腔接種2個人用劑量A.C群腦膜炎球菌結合疫苗，分別於免前、免後10天稱體重，並隨時觀察接種反應。
實驗結果列於表6、表7。
表6.A.C群腦膜炎球菌結合疫苗豚鼠安全性試驗
表7.A.C群腦膜炎球菌結合疫苗小鼠安全性試驗
急性毒性試驗表明A.C群腦膜炎球菌結合疫苗具有可靠的安全性。
權利要求
1.一種A、C群腦膜炎球菌莢膜多糖與B群腦膜炎球菌外膜蛋白偶聯的結合疫苗。
2.根據權利要求1所述的結合疫苗，其中所述A群腦膜炎球菌多糖可來自菌株CMCC(B)29201，所述C群腦膜炎球菌多糖可來自菌株CMCC(B)29205，以及所述B群腦膜炎球菌外膜蛋白可來自菌株CMCC(B)29356和/或CMCC(B)29361。
3.根據權利要求1或2所述的結合疫苗，其中所述的B群腦膜炎球菌外膜蛋白的主要成份是含有1類和2類或1類和3類的外膜蛋白。
4.根據權利要求1所述的結合疫苗，其中所述偶聯由單個A群或C群腦膜炎球菌多糖經活化後的多個位點同時結合多個B群腦膜炎球菌外膜蛋白實現。
5.根據權利要求1所述的結合疫苗，其中所述偶聯由活化後的單個B群腦膜炎球菌外膜蛋白的多個位點同時結合多個A群或C群腦膜炎球菌多糖實現。
6.根據權利要求1，2，4和5中任一項所述的結合疫苗，其中所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結合疫苗的每劑免疫劑量中各有1.25-2.5g。
7.根據權利要求6所述的結合疫苗，其中所述A和C群腦膜炎球菌莢膜多糖在所述結合疫苗的每劑人用免疫劑量中各有5-20g。
8.根據權利要求6所述的結合疫苗，其可以用鋁佐劑和/或緩衝生理鹽水稀釋液。
9.一種製備B群腦膜炎球菌外膜蛋白的方法，該方法包括(1)在收集的培養菌體中加入適量由0.3-0.6M LiCl和0.2-0.5M CH3COONa組成的混合物，離心收集上清；(2)向步驟(1)所得上清中加乙醇至60-80％，沉澱外膜蛋白；(3)收集步驟(2)的沉澱物，再次溶解進行超濾；(4)收集400KD超濾液，用30KD超濾膜濃縮；(5)柱層析收集外膜蛋白組分。
全文摘要
本發明涉及一種腦膜炎球菌疫苗及其製備方法。將純化的A群腦膜炎球菌多糖和C群腦膜炎球菌多糖分別與B群腦膜炎球菌外膜蛋白進行化學偶聯而形成單價結合物，再將單價結合物混合配製而成。這種疫苗可以用於預防嬰幼兒由A、C群腦膜炎球菌引起的流行性腦脊髓膜炎及敗血症疾病。
文檔編號A61P31/00GK1457879SQ03131108
公開日2003年11月26日 申請日期2003年5月12日 優先權日2003年5月12日
發明者範玉柱 申請人:範玉柱