用於控制注射劑釋放的合成物和方法

2023-07-04 23:17:41

專利名稱：：用於控制注射劑釋放的合成物和方法
技術領域：
：本發明總體上涉及控制注射藥物的釋放的方法，特別是用於控制疫苗的釋放，通過將藥物或疫苗緩慢釋放到循環系統中，從而在注射後很長時間內，延長了注射藥物的作用時間或免疫應答的觸發時間。2.發明背景目前，接種疫苗為了產生一種具有保護性記憶的免疫應答，需要隨時間多次注射。由於免疫系統對最初的抗原接觸僅產生中度應答，重複注射是必要的。免疫力是一個適應性的或習得性的過程，在該過程中，後續每一次對抗原的暴露都會引起更強的抗體反應。該反應的增強，不僅表現在生成抗體的數量上，而且表現在平均親和力(抗體與抗原吸附或結合的強度)上。所述親和力的增強是因為在免疫應答的後期，隨著抗原濃度的下降，僅僅選擇性地觸發了B細胞的增殖和生存，所述B細胞具有高親和力的受體。當然，在注射後的早期，抗原濃度很高，足以觸發高親和力和低親和力的受體。隨著抗原的重複注射，通過上述增殖和生存能力的提高，產生了「記憶性」B淋巴細胞，該淋巴細胞形成了更多數量的特異性抗體，抗體的數量因此而增加。典型地，兒童免疫接種白喉、破傷風和百日咳(DTP)程序要求在兒童2個月大時給予疫苗的最初劑量，4個月大時第一次加強注射，6個月大時第二次加強注射，15-18個月大時再給予一次劑量，並建議在4-6歲時給予最後一次劑量(疾病預防控制中心，國家免疫接種項目)。其它疫苗要求相似的程序。上述疫苗的注射會引起疼痛和不適，尤其是對嬰兒；因此，兒童-保健提供者經常無法對兒童反覆進行後續的注射。結果，免疫接種程序受到了危害，無法完全保護兒童不生疾病。世界衛生組織(WHO)認為這種依從性的失敗是一種廣泛發生的事件，其結果危及了群體免疫接種運動。(JodarL.，AguadoT.，LloydJ.andLambertP-H(1998)RevolutionizingImmunizations.Gen.Eng.News18p.6.)為了解決這個問題，做了大量努力來發展減少必需的注射次數的技術。一種方法是控制疫苗的釋放，該方法通過將疫苗緩慢釋放到血液循環中，可在每次注射後的很長時間內，延長免疫應答的觸發時間。當前的工作主要致力於將破傷風疫苗封裝在生物-易蝕性的塑料微球體中，該塑料微球體由聚丙交酯/乙交酯聚合體製成。[(XingD.K.L.McLellanK，CorbelM.J.andSesardicD.(1996)Estimationofantigenictetanustoxoidextractedfrombiodegradablemicrospheres.Biologicals24，57-65]。疫苗注射後，這種生物易分解性的塑料緩慢溶解在體液中，從而從分解了的疏水顆粒中逐步釋放疫苗。然而，已發現上述疫苗在體內不穩定，所以早期的結果是令人失望的，不過新的配方設計已經解決了這些問題，現在破傷風疫苗能在該系統中很適度地發揮作用。然而在人體內37℃時，其它脆性疫苗在塑料顆粒中是不穩定的。因為這個原因，當前沒有其它控制釋放的疫苗投入應用。在研製穩定的注射用液體的過程中，[(美國專利申請No.09/271，204Compositionandmethodforstableinjectableliquids]公開了將破傷風疫苗包裹於可溶解的糖玻璃微球體中，並懸浮於無水油或全氟碳化合物液體中的穩定配方。所用的穩定劑是一種可溶解的糖醇-甘露醇玻璃，其通過與體液接觸，預料可立即溶解，並以常規的初次劑量釋放其疫苗。在預-臨床試驗中，將上述穩定的配液皮下注射到一組幾內亞豬(10隻)身上。在幹疫苗製成後立即進行試驗(結果見圖1)；以及將上述疫苗在37℃下加速衰變3個月，並檢測其穩定性後進行試驗(結果見圖2)。將幹疫苗的等分試樣(穩定於糖玻璃中)在注射前溶於水中，並作為對照組，同時將新鮮來源的疫苗作為標準生物對照的疫苗配製品。測量注射後第4、8、以及12周時的抗體反應。結果發現，所有的對照疫苗在給予初次劑量後，產生了典型的抗體滴度動力學反應，特異性地，抗體水平在4-8周時達到高峰，然後下降，直至12周。然而，當在兩組動物上注射穩定的疫苗(置於玻璃微球體中，並懸浮於生物相容的無水液體中)時，該兩組動物的抗體水平在注射後的整個12周中持續上升。該結果以前在幾內亞豬的破傷風類毒素免疫作用中未出現，這一結果提示，抗體作用的動力學發生了不同的變化。比較對幾內亞豬重複注射標準疫苗的抗體動力學歷史研究結果，本研究顯示了對抗原的控制性釋放。本研究中，在12周時出現了抗體水平的上升，該結果提示，本發明對動物的保護與標準可溶性疫苗多次注射後相同。儘管已證實在為脆性生物分子提供一個穩定的環境上，糖玻璃是有效的，但其它水溶性玻璃如羧酸金屬鹽及類似玻璃(SlowReleaseVitreousSystemsPCTNoWO90/11756)、磷酸玻璃(PhosphateGlassCeramicsforBiologicalnaMedicalApplications.美國專利No4,698,318)，都能以與糖玻璃化合的形式或獨立製成玻璃微球體(Amorphousglassesforstabilizingsensitiveproducts.PCT申請號WO99/47174)，並具有其它良好的特性，從而使它們適用於本系統。這些良好的特性包括預先決定玻璃溶解率的能力，該溶解率通過用鹽混合物來配製玻璃而實現，所述鹽在水中分別具有不同的溶解率(ControlledDeliveryDevices美國專利No5,270,048)。對生物相容性無水液體的穩定液體配方的開發最初是為了解決兩個主要的問題即為貯藏而冷凍藥物或疫苗的需要，以及在注射前用消毒過的水重新配製它們的需要。本技術不僅完全解決了上述困難，而且看起來，其無水液體配方也解決了依從性的問題。本發明中，一種方便的、易於注射的、穩定的疫苗提供了單次注射後的完全免疫過程。假定某些可溶性玻璃微球體(包含了穩定的疫苗)可通過保持受無水液體的環繞，而保護其在體液中的釋放。它們僅僅在注射後的某些時間溶解以釋放其疫苗，這使它們充當了一種加強劑量，從而在實驗的整個12周裡都使抗體水平提高。相比水溶性的抗原，無水液體配製的抗原在第4周時的平均抗體水平較低。注射了無水懸浮液疫苗的動物組的早期抗體滴度較低，是由於抗原在注射後早期釋放的劑量較低造成的，這一點是有爭議的。一些人可能認為上述現象提示了免疫啟動延緩的問題，但本系統中的抗體保護水平大約為每毫升血液0.1個國際單位。在幾內亞豬上，第4周時所見的抗體水平大於每毫升血液1個國際單位，遠高於甚至在如此早期時的保護水平。發明簡述本發明是一種用於控制注射劑釋放的製劑和方法，其通過使用可溶解懸浮於無水液體如油、聚矽酮液或全氟碳化合物中的玻璃微球體，從而在注射後的很長時間內，緩慢、可控制地分解微球體和釋放抗原。為了更好地理解本發明及其另外或更進一步的目的，結合附圖參照下面的說明，本發明的權利範圍在附加的權利要求中列出。附圖簡述圖1中示出了第0天對各組幾內亞豬注射0.5ml疫苗，然後在第4、8以及12周後滴定時的各組平均抗體滴度，每組包括10隻幾內亞豬。圖2中表示了第0天對各組幾內亞豬注射0.5ml疫苗，然後在第4、8以及12周後滴定時的各組平均抗體滴度，每組包括10隻幾內亞豬。詳細說明在圖1列出的實施例中，以10隻幾內亞豬為一組，若干組幾內亞豬分別在第0天時注射0.5ml疫苗，然後在第4、8以及12周後進行滴定。在第一組中，對動物注射來自生產商的新鮮液體疫苗(MedevabatchT022)。注射了新鮮疫苗的動物的平均抗體滴度高於注射了幹疫苗的動物組，該結果表明烘乾過程部分損失了疫苗的致免疫性。在第二組中，對10隻動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並在注射前立即用水再水化。第三組中，對動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並懸浮在0.5ml角鯊烷油中。第四組中，對動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並懸浮在0.5ml全氟萘烷中。最後，在第五組中，對動物注射不含疫苗的糖玻璃微球體粉末，該粉末懸浮在0.5ml角鯊烷油中，而在第六組中，對動物注射不含疫苗的糖玻璃微球體粉末，該粉末懸浮在0.5ml全氟萘烷中。儘管前兩組動物(注射了用水製備的疫苗)的平均抗體滴度在注射後的第12周時下降了，但在注射了用油或PFC製備的疫苗的兩組動物中，其平均抗體滴度在注射後的第12周時沒有下降。第五組和第六組動物(只注射了載體製劑)沒有發生抗體反應。圖2例示的實施例中，以10隻幾內亞豬為一組，若干組幾內亞豬分別在第0天時注射0.5ml疫苗，然後在第4、8以及12周後進行滴定，測量各組的平均抗體滴度。在第一組中，對動物注射來自生產商的新鮮液體疫苗，該疫苗已經在4℃下貯存了3個月。在第二組中，對動物注射來自生產商的新鮮液體疫苗，該疫苗已經在37℃下貯存了3個月。第三組中，對動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並已在37℃下貯存了3個月，注射前立即用水再水化。第四組中，對動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並懸浮在0.5ml角鯊烷油中，注射前該疫苗已在37℃下貯存了3個月。最後，第五組中，對動物注射幹疫苗，該疫苗被烘乾成一種含糖玻璃微球體的粉末，並懸浮在0.5ml全氟萘烷中，注射前該疫苗已在37℃下貯存了3個月。在本特定實施例中，注射了新鮮疫苗的動物的平均抗體滴度高於注射了幹疫苗的動物，該結果表明烘乾過程部分損失了疫苗的致免疫性。儘管前兩組動物(注射了用水製備的疫苗，該疫苗已在37℃下溼或幹的狀態下貯存)的平均抗體滴度在注射後的第8-12周時下降了，但在注射了用油或PFC製備的疫苗的兩組動物中，其平均抗體滴度在整個12周中逐漸上升。上述體外實驗表明，PFCs可能使懸浮於其中的玻璃微球體立即釋放。將一種水溶性染料(媒染藍9)與糖玻璃微球體混合，並以10％w/v的濃度將其懸浮在全氟萘烷中。當在0.5ml該混濁的深藍色懸浮液中加入1.5ml水時，PFC懸浮液下降到試管的底層，試管上層為清澈的水。劇烈渦旋混合大約1分鐘，並再靜置1分鐘後，上面的水層變成非常清澈的藍色，PFC層淨化成水樣的白色。混濁的變清表明，PFC中的懸浮顆粒已經溶解了。藍色從PFC層移到水層表明，所有的親水性染料已象預期一樣溶解到了水中。例1使用一種易於測定的蛋白質為模板疫苗來證實上述結果。本實施例選用鹼性磷酸酶。製備下述溶液佐劑級磷酸鈣10％w/v(superphosKemia/s)；海藻糖，10％w/v；Zncl2，1mM；Mgcl2，1mM；鹼性磷酸酶，20U/ml，於5mMTris鹽酸緩衝液中，PH7.6。將懸浮液在37℃下徹底混合10分鐘，以使不溶解的磷酸鈣吸附可溶解的鹼性磷酸酶。測量該吸附作用，測量時將懸浮液分成小等份進行離心，以從懸浮液中沉澱出磷酸鈣，然後從上清液中取樣，並以p-磷酸硝基苯為酶底物、在405nm波長下測量其酶動力學。然後將剩餘的懸浮液進行噴霧-乾燥，製成精細的粉末。將該粉末再水化後，如同上述過程，在上清液中測量酶的解吸附作用。將上述粉末以20％w/v的濃度懸浮於全氟菲中，並使之形成一種穩定的懸浮液。表1結果，92％的酶被磷酸鈣佐劑吸收(表1)。最後，將上述所有酶置於海藻糖玻璃微球體中並懸浮於PFCs中後，復原所有的酶並測定其活性。象上述藍色染料例子一樣，這些酶都再溶解在水中。本實驗表明，當將懸浮於PFCs中的玻璃微球體與水在體外混合時，玻璃微球體快速溶解，這提示該製劑在體內也將會快速釋放其抗原。這顯然不是事實。令人驚訝的是，經過注射後的很長時間，看來抗原緩慢、可控制地釋放。本系統中抗原的釋放與在某些水油乳性佐劑中的釋放相似，該乳性佐劑以油為基礎，用於動物，如弗氏完全佐劑。弗氏完全佐劑的無機物油性沉積物中分散著許多抗原液滴，從該抗原液滴中緩慢滲漏出抗原，通過這種方式，大大增強了在動物免疫過程中發現的免疫應答(FreundJ.Someaspectsofactiveimmunization.Ann.Rev.Microbiol1291(1947).)。將抗原穩定在糖玻璃微球體裡，並懸浮在生物相容的無水液體中進行免疫接種後，發現了相似的結果。弗氏完全佐劑和本系統的一個主要不同是前者是抗原油液滴用水配製後形成的液體乳劑，因此是內在不穩定的，而後者是一種穩定的、置於玻璃微球體懸浮液中的乾燥固體，因此是內在穩定的。另外，弗氏佐劑有劇烈刺激性，用於人體是無法被接受的(ImmunologicaladjuvantsreportofaWHOscientificgroupmeetingheldinGenevafrom6to10October1975)1976)，而本發明中所用的PFC配方是無毒的。注射後不會立即或延緩性地引起刺激或炎症。因此本發明理想地適用於發展一種用於人體的單次-劑量疫苗，尤其是用於兒童，其無刺激性是附帶的優點。上述PFC配方能夠控制穩定於可溶性微球體中的活性的釋放，這種能力當然不僅僅局限於疫苗。為發揮其療效，還有大量藥物需要重複注射。實際上對於注射用藥物在單次注射時發揮效率而言，本發明是非常適用的。在任何情況下，活性分子從固態溶液(於可溶性玻璃中)到游離溶液(於人體體液中)的釋放率都需要準確控制，而且對不同的活性分子，該釋放率需要是不同的。儘管本系統中可以使用各種生物相容的無水液體，但因為PFCs的理化穩定性、無毒性、低粘度和低表面張力性以及高密度性，所以PFCs是優選的。表2一些全氟碳化合物的理化特點通過將特定的母體碳氫化合物分子進行氟化可以得到多種PFC液。從組織到血流的吸收率、以及從人體呼氣呼吸的消除率，可能是PFC的蒸汽壓在體溫下的功能。一般而言，蒸汽壓依次與分子量成正比例(見表2)。通過仔細選擇特定的PFC，有可能控制釋放率，使之在一個很大的範圍內變動。因為PFC液可以混合，所以通過選擇一個合適的比例來混合PFC液，可以精確確定釋放率。被用作密度匹配劑的磷酸鈣在水中是不可溶的，並能形成一種高質量的、高水化的膠體懸液，該膠體懸液能夠從溶液中逆轉結合大量大分子，尤其是蛋白質分子。在本研究中所用的破傷風類毒素疫苗中，大部分抗原既與氫氧化鋁佐劑(原用於疫苗)結合，也與磷酸鈣懸液(用作密度匹配劑)結合。在動物研究中可以看到，結合在上述無機物膠體上的蛋白質抗原充當了一種貯主，以延緩其釋放。在釋放的整個分布中可以看到，當疫苗懸浮在PFC液中時，其延緩釋放的程度遠大於在用水製備的懸浮液中，該用水製備的懸浮液被用作對照組。該結果表明，在控制疫苗從無機物膠體的釋放率時，無水PFC液充當了非常重要的成分。需要進行進一步的實驗來證明如果蛋白質游離在玻璃微球體的固態溶液中，相比蛋白質結合在一種無機物膠體上，兩者是否能以同樣程度從PFC液中延緩釋放。除了能夠用來匹配糖玻璃微球體與PFC液的密度之外，上述配方中所用的磷酸鈣還有其它用途。因為骨自身的無機成分包含磷酸鈣，該磷酸鈣以羥基磷灰石的形式存在，所以該添加劑的化學性質是生物相容的、無毒的。可以確證下述過程是安全的即以該方式注射磷酸鈣將是局部無毒的，而且最終將會緩慢從注射部位和/或局部引流淋巴結溶解，不會有過剩。在上述過程發生之前，磷酸鈣在注射部位的沉積還充當了一種正向免疫標記物，其可以通過醫學影像技術(如X-線、MRI、甚至可能通過超聲或測磁法)檢測到。在局部記錄保持不完善、以及病人對自身免疫史的認識不完全時，這種對已具有免疫力病人的正向鑑別能力，有時在疾病根治計劃中是十分重要的。若取代為其它密度-調節物質如硫酸鋇、二氧化鈦、以及其它不溶於水的、高密度無機沉積物或上述物質的定義混合物，有可能利用不同密度匹配的化學藥品從而唯一性地標記不同的疫苗。然後通過相對表面的醫學影像或檢測技術，可以檢測出準確的免疫史。儘管這裡對被認為是本發明的優選實施例進行了描述，但本專業技術人員會理解，在不偏離本發明的實質的情況下，可對本發明進行其它或進一步的變化和修改，這裡旨在要求所有的這些變化和修改都落入本發明的真正範圍中。權利要求1.一種藥物的合成物包括一種病人注射用的穩定的藥物或疫苗，其中所述藥物或疫苗包裹於可溶解的玻璃微球體中，而且所述可溶解的玻璃微球體懸浮於一種生物相容的無水液體中，從而防止所述藥物或疫苗分解，保持其受無水液體的圍繞，因此在注射很長時間後，通過將藥物或疫苗緩慢釋放到病人的循環系統中，延長了藥物發生作用或疫苗觸發免疫應答的持續時間。2.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述藥物選自一組包括激素、止痛藥、麻醉藥、麻醉藥拮抗藥、化學治療藥、免疫抑制劑、生長和分化調節因子和要素、免疫調變劑、避孕藥、血管作用劑、凝固修飾因子、心臟作用藥、消炎藥和CNS藥。3.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述疫苗選自一組包括毒素、類毒素、活菌或滅活菌、活病毒或滅活病毒、活原生動物或滅活原生動物、重組蛋白質、DNA、RNA、多糖、脂蛋白、脂質以及重組或合成肽。4.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述可溶解的玻璃微球體選自一組包括非降解性的糖和糖醇、羧酸金屬鹽以及磷酸玻璃。5.根據權利要求4所述的藥物的合成物，其中所述非降解性的糖選自一組物質，其中包括蔗糖、海藻糖、綿子糖以及水蘇糖。6.根據權利要求4所述的藥物的合成物，其中所述糖醇選自一組物質，其中包括甘露醇、阿拉伯糖醇、肌醇、山梨醇、半乳糖醇、木糖醇、麥芽糖醇、乳糖醇、吡喃葡萄糖-山梨醇以及吡喃葡萄糖-甘露醇。7.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述生物相容的無水液體選自一組物質，其中包括不含水的親水液、不含水的疏水液、不含水的聚矽酮液、或者不含水的全氟碳化合物。8.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述玻璃微球體包含一定數量的不溶於水的生物相容性高密度劑，其數量足以提高微球體的平均密度，以與其懸浮的生物相容性無水液體的密度匹配。9.根據權利要求8所述的藥物的合成物，其中所述不溶於水的生物相容性高密度劑選自一組物質，其中包括磷酸鈣、磷酸鋁、氫氧化鋁、硫酸鋇以及二氧化鈦。10.根據權利要求1所述的藥物的合成物，其中所述疫苗是破傷風類毒素。11.根據權利要求10所述的藥物的合成物，其中所述疫苗吸附在一種佐劑上。12.根據權利要求11所述的藥物的合成物，其中所述佐劑選自一組物質，其中包括氫氧化鋁、磷酸鋁或磷酸鈣。13.根據權利要求10所述的藥物的合成物，其中加入了一種含磷酸鈣、海藻糖、氯化鋅、氯化鎂、Tris緩衝液的溶液，以有助於形成所述包裹於玻璃微球體中的、穩定的破傷風類毒素。14.根據權利要求13所述的藥物的合成物，其中所述溶液被噴霧-乾燥成一種精細的粉末。15.根據權利要求14所述的藥物的合成物，其中所述粉末被懸浮在全氟碳化合物中，形成了一種穩定的懸浮液。16.根據權利要求15所述的藥物的合成物，其中所述全氟碳化合物選自一組物質，其中包括全氟己烷、全氟萘烷、全氟辛烷以及全氟菲。17.一種有關藥物或疫苗的配製方法，能夠在給予藥物或疫苗的有效劑量時，延長其作用時間，所述藥物或疫苗通過下列方法配製將所述藥物或疫苗混合在可溶解的玻璃微球體中，並將所述可溶解的玻璃微球體懸浮在一種生物相容的無水液體中，從而防止所述藥物或疫苗分解，同時保持其受該無水液體的圍繞，因此將藥物或疫苗緩慢釋放到病人的循環系統中。18.根據權利要求17所述的方法包括生成可溶解的玻璃微球體的步驟選自一組方法，其中包括噴霧-乾燥、空氣乾燥、真空乾燥、乳膠體固化、沉澱、或溶解研磨成一種精細的粉末。19.根據權利要求18所述的方法，其中所述精細的粉末被懸浮在生物相容的無水液體中，該生物相容的無水液體為全氟萘烷。20.根據權利要求19所述的方法，其中所述全氟碳化合物選自一組物質，其中包括全氟己烷、全氟萘烷、全氟辛烷以及全氟菲。全文摘要本發明涉及一種用於控制藥物或疫苗在病人體內釋放的藥物的合成物和方法，其可使藥物或抗原在注射後很長時間內緩慢、可控制地釋放。所述藥物或疫苗被包裹在糖玻璃微球體中，然後置於一種無水液體中，該無水液體優選全氟碳化合物，從而防止疫苗分解，同時保持受無水液體的環繞。這種簡單的無毒系統，適用於目前的注射器或現在及將來的無針系統，不僅便宜可靠，而且可通過降低重複注射的需要，從而有助於腸道外注射藥的傳送或群體免疫接種運動。文檔編號A61K9/34GK1668275SQ02805096公開日2005年9月14日申請日期2002年2月14日優先權日2001年2月16日發明者布魯斯·羅瑟,阿卡迪奧·加西亞·德·卡斯楚申請人:劍橋生物穩定性有限公司,埃迪亞有限公司