體內染色組合物,其製法及用於確認發育異常組織的方法
2023-07-04 22:43:56 3
專利名稱：體內染色組合物,其製法及用於確認發育異常組織的方法
本申請以我在1997年11月13日申請的國際申請PCTUS/97/20981和我在1998年7月6日申請的美國專利申請09/110788號為基礎要求多個公約優選權。
本發明涉及新的適於人體內局部使用的生物染色組合物。
具體地說，本發明涉及新的甲苯胺藍O(「TBO」)染色產品，以一定比例含有TBO和特定TBO衍生物的產品。
另一方面，本發明涉及製備TBO組合物的新方法，所述組合物包括這些新的TBO產品，如我的在先國際申請所述。
此外，本發明涉及改進的製備方法，TBO的產量更高，製備起來更經濟，生產設備的製造能力更高，如我的USA申請所公開的那樣。
另一方面，本發明涉及這種新的TBO組合物在體內使用，來確定懷疑發育異常即不正常組織的方法。
另一個進一步的方面，本發明涉及組合物，用其在體內診斷的方法，和製備它的方法。該組合物特別適於確定懷疑為發育異常的口腔組織，特別是癌症及癌症前期的組織。
另一方面，本發明涉及新的經合成、分離鑑定和回收的TBO的N脫甲基產物。
另一方面，本發明涉及分析含有構象異構體和其他結構相關的化合物的TBO產物的HPLC方法。
從下面說明書連同權利要求和附圖的詳細說明中，本領域技術人員將明了本發明的多種實施方式以及實踐意義。
圖1是254nmHPLC曲線圖，描繪已知的和可商購的TBO產物組合物的典型特徵峰值。
圖2是254nmHPLC曲線圖，描繪本發明典型的TBO產物組合物的特徵峰值。
圖3是生產流程圖，描繪我所發現的製備TBO產物包括本發明的新TBO產物組合物的方法。
多數口腔疾患是外傷導致的。但其他的口腔疾患則是發育異常的組織，其中一些可能是良性的，另一些則可能是癌症的或癌症前期的。此外，許多發育異常的組織非常小，容易在常規的外表檢查中被牙科醫生忽略。
體內診斷試驗是已知的確認和描述懷疑為發育異常口腔組織的方法。在授予Mashbergd的美國專利4321251和授予Tucci等人的美國專利5372801中描述了這一篩選試驗。近來，已經開發了試劑盒使診斷人能更快更容易地進行該試驗，成為其他常規牙科檢查過程的一部分，從而在患者並無症狀或當發育異常疾患還非常小而通常的外部檢查容易忽視其的情況下一次就確認和/或描述被懷疑的部位。一旦由Mashberg方法確認了被懷疑發育異常疾患，可提取活組織檢查試樣進行組織檢查，從而確定該疾患是否是惡性的或癌症前期的。進行這一試驗的試劑盒包括由Zila公司許可的、以適宜的量和濃度預混的染色和漂清溶液，可從加拿大由Germiphene公司以ORASCANTM商標購得，和從英國、澳大利亞由Stafford-Miller公司以「ORASCREEN」商標購得。
已經發現可從賣主處商購的現有技術TBO產品中的有機染料含量相當低。典型地，代表這些現有技術產品中的TBO構象異構體的254nmHPLC峰的結合面積(參見實施例3,HPLC方法)只有代表全部TBO和TBO相關成分(即TBO的兩個構象異構體加最多到六個TBO相關成分)的254nm HPLC峰的結合面積的約2％-75％。
參見圖1,HPLC峰7和峰8代表TBO的兩個構象異構體(此處為氯化物鹽)
HPLC峰5和峰6被確認為TBO的兩個構象異構體的N-脫甲基衍生物
HPLC峰2和峰3被確認為TBO的兩個構象異構體的N,N-脫甲基衍生物
HPLC峰1和峰4代表的化合物的準確結構尚未確定。
在任何情形下，峰1-4代表的化合物在圖1代表的典型現有技術TBO組合物中的存在量高於在本發明中的(見圖2)，而峰5-8代表的化合物的存在量則低於在本發明TBO產品中的存在量。現有技術(圖1)中，峰5和峰6代表的TBO構象異構體的兩個N-脫甲基衍生物以較高的量存在，典型地為有機染料含量的20％以上，高於在本發明TBO產品中的存在量。
1989年11月30日授予Dandliker等人的美國專利418055舉例說明了TBO的傳統生產方法。此合成是三個氧化反應步驟(1)氧化N,N-二甲基-對-苯二胺，例如用重鉻酸鉀，得到2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸；(2)用鄰-甲苯胺縮合硫代磺酸，形成相應的吲噠胺硫代磺酸；和(3)吲噠胺硫代磺酸的閉環反應，例如在氯化鋅存在下，於沸騰溫度下約30分鐘，得到TBO。然後將反應混合物冷卻，將閉環反應得到的TBO產物複合並鹽析出來，例如用氯化鈉和氯化鋅處理，沉澱出TBO複合物，例如TBO/AnCl2複合物。可以通過重複進行重溶解和重沉澱進行純化，例如在熱的氯化鋅水溶液中重溶解和用氯化鈉/氯化鋅重沉澱。
已知的是以前的工作人員用TBO對發育異常進行體內確認時，使用的是上述的現有技術TBO產品，即TBO的構象異構體加N-脫甲基和N,N-脫甲基衍生物的量低於染色組合物的80％的組合物，且其中構象異構體的兩個N-脫甲基衍生物構成染料組合物的約20％以上。根據我的信息，以前的工作人員不知道他們的「TBO」產品的準確組成，生產者不能再現性地製備出現有技術的TBO產品。事實上，TBO質量的文獻描述普遍為簡單的「色值良好的甲苯胺藍」。生物染料委員會規定了一種分析滴定方法僅僅用來測定材料中的「有機染料成分」。現有技術中對這種模糊定義「TBO」的使用帶來的結果是不規則的臨床報告以及在獲得生產和銷售這種用於人的診斷過程的產品所必須的正規許可所面臨的嚴重問題。
簡短地說，實現本發明的新組合物是一種TBO產物，其中包括TBO的構象異構體和這些構象異構體的N-脫甲基衍生物，TBO異構體與它們的N-脫甲基衍生物的比例是這樣的，即代表TBO異構體的254nm HPLC峰的結合面積與代表它們的N-脫甲基衍生物的峰的結合面積(根據實施例3中HPLC方法測定)之比是至少約6∶1。因此，如圖2所示，代表TBO構象異構體的254nm HPLC峰(峰7和8)的結合面積是代表它們相應的N-脫甲基衍生物的254nm HPLC峰(峰5和6)的結合面積的至少約六倍。在本發明優選的實施方案中，峰5,6,7,8代表的成分等於產品中有機染料含量的至少約95％。在最優選的實施方案中，峰8(254nm)的面積代表產品中有機染料含量的至少58％。
本發明還涉及體內確認人體發育異常組織的方法，包括將上述新TBO產品用於人體組織的步驟。
本發明的另一實施方案是再現生產包括上述新TBO產物的TBO組合物的新的一般方法，其中在Dandliker合成的閉環步驟(第三步)之前將複合劑加入到反應混合物中，優選在方法的第一氧化步驟(圖3,11)之前加入。
現有技術中Dandliker方法包括以下步驟在第一反應混合物中氧化N,N-二甲基-對-亞苯基二胺離子，得到第一中間體，2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸，氧化第一中間體，在第二反應混合物中用鄰-甲苯胺縮合該氧化物，得到第二中間體，吲噠胺硫代磺酸，在第三反應混合物中氧化第二中間體使吲噠胺閉環，形成溶解於第三反應混合物的TBO反應產物，向所述的第三反應混合物中引入複合劑，形成TBO複合產物，和從所述第三反應混合物中分離所述的TBO複合物。
我對這一現有Dandliker方法的改進包括，在第三反應混合物形成之前，優選在第二反應混合物形成之前加入複合劑。
根據更進一步和目前優選的、特別適於生產本發明新TBO產物組合物的實施方案，氧化步驟中反應混合物的溫度保持在不高於約10℃。
在另一進一步和目前優選的、特別適於改進TBO產品的質量的實施方案中，氧化步驟中反應混合物的pH值保持在如下範圍第一反應混合物約2.8-3.8(優選3.3)，第二反應混合物約3.1-4.1(優選3.6)和第三反應混合物約3.0。
在另一優選的實施方案中，改進了我的如上簡述新方法大幅提高TBO產物的產量。
如圖1所示，典型的以前可商購的TBO有兩個代表TBO的構象異構體的254nm HPLC峰(峰7和8)，和兩個已發現是構象異構體的脫甲基衍生物的254nm HPLC峰(峰5和6)。在這個典型的現有技術產品中，TBO的構象異構體與它們的N-脫甲基衍生物的量的比例即構象異構體與N-脫甲基衍生物的峰面積的比小於4∶1。在分離出的現有技術TBO產物中偶爾存在有較高的比例，接近或超過6∶1，但這樣的產物的相對量尚不知道或認為不重要。現有技術生產方法在任何情況下都不能再現製備這樣的比例較高的TBO產物。
根據最近的臨床試驗的一般需要，被用於確認發育異常組織人體診斷方法(一般根據Mashberg方法)的TBO中TBO構象異構體與N-脫甲基衍生物的254nm HPLC峰面積的比例至少為約6∶1，即，254nm HPLC峰7和8的結合面積必須至少比254nm HPLC峰5和6的結合面積大六倍。
非常需要提供符合人體診斷試驗方法需要的TBO產物組合物，其中構象異構體的254nm HPLC峰的面積與它們的脫甲基衍生物的面積比為至少6∶1。此外，非常需要提供能可靠和再現地製備具有這種一定TBO異構體與TBO脫甲基衍生物比例的TBO產品，並能可靠和再現製造其他TBO產品並提高產量和普遍純度的生產方法。
圖2描繪了本發明典型組合物的254nmHPLC分析圖，從中可以看出TBO構象異構體與N-脫甲基衍生物的峰面積比大於約6∶1，即由254nm的結合面積表明為6.68∶1。HPLC峰7和8比峰5和6的結合面積大6.68倍。普遍純度由HPLC和燃燒試驗確定，定義為[100減燃燒殘渣的百分數]乘以本發明TBO產物的HPLC純度(即，峰5,6,7和8的峰面積之和除以總的峰面積)，至少為大於75％，與之相比大多數現有技術組合物的為2-10％。偶爾，現有技術中可得到純度較高的產品，但不能再現。
根據我的發明，在2-位有環上甲基(如參見式Ⅰ)的峰(峰3,6和8)面積與在4-位有環上甲基(如參見式Ⅱ)的峰(峰2,5,7)的面積比為約2.5∶1。相反，據我所知，現有技術產品的此比例不大於1.5∶1。
據我所知現有技術產品中尚無這種峰7+8面積∶峰5+6面積比例高同時峰3+6+8∶峰2+5+7面積比也高的。因為峰8是TBO峰的主要峰，其結構被廣泛接受為TBO結構，故峰3,6和8比峰2,5和7要優選。當然，峰7和8比峰5和6要優選，而峰5和6又比峰2和3要優選。故在本發明的最優選的實施方案中，所得產品同時滿足了上述兩個比例要求。
圖3是製備TBO產品的方法的工藝流程圖，所述產品滿足根據Nashberg方法進行臨床使用的常規需要。
圖3合成方法的起始原料10是可商購的高純度N,N-二甲基-對-亞苯基二胺
第一種反應混合物的形成氧化11起始原料10的水溶液，優選在低於10℃，特別是低於約5℃下，與適宜的氧化劑12，如重鉻酸鉀12反應，在有酸、硫酸鋁和試劑13(據信用於中間體複合，在本方法較後步驟中用來複合TBO組合物成分)如氯化鋅的存在下進行。然後加入硫代磺酸離子14，如硫代磺酸鈉，形成含有第一中間體2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的第一反應混合物15
第二種反應混合物的形成然後，在縮合步驟18中第一反應混合物15進一步反應，優選在不高於約10℃的溫度下與附加的氧化劑16如重鉻酸鉀和鄰-甲苯胺鹽酸鹽17反應，在第二反應混合物19中形成第二中間體，一種縮合產物，吲噠胺硫代磺酸
第三種反應混合物的形成然後，第二反應混合物19進一步氧化21，優選加入適宜的氧化劑22，如重鉻酸鉀，在不高於約10℃的溫度下進行。跟著加入硫酸銅、氯化鋅複合劑及酸，並加熱至100℃使吲噠環閉環，在第三反應混合物24中形成TBO。此時，從第三反應混合物中分離TBO並提純。TBO的分離/純化舉例來說，在本發明方法的優選實施方案中，用適宜的複合劑25如氯化鋅進行複合24，將TBO從第三反應混合物中沉澱出來形成複合的TBO-氯化鋅復鹽。從液相中將沉澱過濾26出來並用氯化鈉溶液27洗滌。經洗滌的濾餅在臨界1體積的水29中重溶解28，形成TBO溶液30，然後過濾31除去未溶解的固體32a並將其丟棄。然後向濾液32中加入氯化鋅、臨界2體積/氯化鈉濃溶液33再將TBO-氯化鋅復鹽沉澱出來，如圖所示(只表示了一種構象異構體)
從混合物中過濾分離出TBO-氯化鋅復鹽，產生TBO-氯化鋅/TBO氯化物濾餅34。[1如果使用太多的水會阻止TBO的分離。如果水太少(1)不能使全部的TBO溶解，降低產率及(2)降低產品的純度。2如果使用的氯化鈉太少，就不能將全部產物鹽析出來，降低產率。如果氯化鈉的量太大，會使雜質隨TBO一起沉澱出來降低產物的純度。]如虛線35所示，TBO濾餅可被重溶解、過濾、重沉澱和重分離多次，獲得理想的純度並製得TBO。然後，經提純的最終濾餅複合物產物34經乾燥35，如用傳統的對流爐和/或真空爐，乾燥的濾餅36經粉碎和混合37，得到最終的TBO產品38。最終的TBO產品中含有TBO的氯化鋅復鹽(式Ⅹ)和TBO的氯化物鹽(式Ⅰ和Ⅱ)。
在第三反應混合物形成之前即吲噠胺硫代磺酸氧化之前引入複合劑，複合所得TBO反應產物以形成TBO-複合物，製得一種TBO構象異構體與其N-脫甲基產物的比例有所改進的TBO複合產物。如果在第三反應混合物形成之前引入複合劑，就可以得到至少6∶1的比例。當然，本領域技術人員將會知道，要獲得這種異構體與脫甲基衍生物的改進比例在某些程度上還依賴於其他操作參數的控制。在下面的本發明方法的優選實施方案的描述中將對此進行討論，這些參數對提高TBO-複合產物的產率和純度均是理想的。但是，即使如此控制其他的改進產率和純度的參數，也得不到異構體與N-脫甲基產物的理想改進比例，也得不到甲基在2位與甲基在4位的峰的理想改進比例，除非至少在第三反應混合物形成之前，即吲噠胺硫代磺酸的氧化之前加入複合劑將所得的TBO產物複合。
目前，我相信較早加入複合劑，即在第三反應混合物形成之前加入將改進最終產物的異構體N-脫甲基衍生物比例，因為起始原料和/或硫代磺酸和/或吲噠胺硫代磺酸複合物的較早形成對脫甲基化具有明顯的位阻作用。換句話說，由於尺寸和結構的加大，複合物形成位阻(可能有電荷影響)將N-甲基保護起來不致氧化脫甲基。由於三個反應步驟全都包括氧化和可能的脫甲基化，這種複合物越早形成越好，這就是我之所以建議複合劑近可能早使用的原因。
根據本發明進一步和最優選的實施方案，如上述我以前的美國專利申請所公開的，由於向第一反應混合物中引入硫代磺酸離子形成第一中間體，並保持反應混合物在約10℃的較低溫度下，在升高溫度至較高溫度之前持續在這一較低溫度下進行反應，我的上述方法的產率明顯提高。因此，在吲噠胺硫代磺酸中間體的生產中，包括氧化含有氧化劑的反應混合物中的N,N』-二甲基-對-亞苯基二胺，引入硫代磺酸離子，然後升高溫度至較高溫度將近30分鐘，形成溶於反應混合物的吲噠胺硫代磺酸溶液，通過在升高溫度形成吲噠胺硫代磺酸反應混合物溶液之前保持氧化-硫代磺酸化混合物的溫度等於或低於約10℃將近30分鐘，使得從整個方法得到TBO產物的總產率大幅提高。
實施例下面實施例舉例說明了本發明的實施，以便本領域技術人員製造和使用新的TBO組合物，用這種新TBO組合物實踐新診斷方法，實踐製備TBO組合物的新方法和本發明的許多實施方案，並向本領域技術人員描述目前已知的實施本發明的各實施方案的最好方式。這些實施例僅作為舉例說明，對發明的範圍不作限制，發明範圍僅由所附權利要求定義。
實施例1
製備方法本實施例詳細說明符合GMP條件一般要求、以普通工業規模批量生產TBO染料產品的準確方法。
原料溶液的製備儀器/器材A、Ohaus IP15KS天平B、AnD HV150KAI天平C、Fairbanks H90-5150天平D、OHAUS WB25/1-20W天平E、Cole Parmer(51201-30)和Thermolyne(S25535)攪拌器F、取樣器，如鋼匙，取樣筒等G、Erlyenmeyer燒瓶、燒杯、壇和其他適宜的玻璃器具H、製備溶液的標籤安全要求處理化學試劑時應按照MSDS指南穿戴安全防護服裝，如手套、安全眼鏡、實驗室服裝和面罩。原料溶液製備方法向1364.2g(±5.5g)鹽酸中加入1364.2g(±5.5g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向1779.1g(±7.0g)硫酸鋁十六水合物中加入2548.9g(±10.0g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向7384.6g(±30.0g)氯化鋅中加入2786.7g(±11.0g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向2102.9g(±8.0g)重鉻酸鉀中加入25203.8g(±100g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向1526.6g(±6.0g)硫代硫酸鈉五水合物中加入2043.6g(±8.0g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向509.7g(±2.0g)硫酸銅五水合物中加入1613.1g(±6.0g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向600.0g(±2.0g)硫酸中加入600.0g(±2.0g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
向70.4kg(±250g)氯化鈉中加入234.4kg(±850g)USP純水。攪拌直至溶液澄清。
合成合成儀器和器材LFE控制板(3000)20加侖有蓋夾層玻璃管線提純罐(E71224)兩個100加侖有蓋夾層玻璃管線提純罐(P1,PT-001)(P2,L-13621)FTS循環冷卻器(RC96C032)和500加侖冷卻儲罐(500CST)三個帶有旋轉軸和葉輪的Caframo混合器(BDC-1850)(R1,18500961)(P1,18501148)(P2,18501173)Lightning混合器(L1U08)(201550)三個熱交換器(Gardner Machinery)(R1,01960763)(P1,01960764)(P2,08950727)三個12KW夾層液流循環器(Watlow,BLC726C3S20)三個循環泵(Sta-Rite,JBHD-62S,C48J2EC15)Masterflex數字式蠕動泵(A94002806)
Masterflex蠕動泵(L95003320)Cole Parmer蠕動泵(B96002074)Neutsche過濾裝置(70-2038,43421-1)兩個Buchner過濾裝置(Z11,624-6,Z10,441-8)西門子真空泵(F2BV2)60加侖有蓋玻璃管線收集器(86854,E164-1186)空氣壓縮機(DF412-2)(9502312538)液流控制器(3-5500)(69705069190)六個容量控制器(3-5600)(#1,69705069191,#2,69705069199,#3,69705069194,#4,69705058829,#5,69705058805,#6,69705069195)六個流量傳感器(#1,69704295165,#2,69704024995,#3,69704024994,#4,69704025027,#5,69612178606,#6,69703120990)四個薄膜式泵(M1)四個平壓裝置(A301H)(#2,15557,#3,15561,#4,15558,#5,15559)四個空氣調節器(CFR10)四個電磁閥(與空氣調節器一起使用)四個低液流傳感器(FS-500)三個電磁閥(EASM5V16W20)空氣過濾器/調節器(T1R)PTFE/F06R113AC過濾介質，聚乙烯(7211-1)過濾介質，Whatman級52PharMed管(-18,-82,-90)pH計；Hanna9321(1303675)及Orion620(001911)分光光度計20(3MU7202070)Fisher科技真空爐(9502-033)VWR1370FM壓力空氣爐(1370FM)
Dust/Mist面罩Thomas Wiley實驗室用磨(3375-E10)Patterson-Kelley混合器(Blendmaster,C416578)OHAUS TS4KD天平OHAUS IP15KS天平Mettler AG104天平AnD HV150KA1天平Fairbanks H90-5150天平OHAUS AS123印表機OHAUS AS142印表機AD-8121多功能印表機Citizen iDP 3540點陣印表機Hewlett Packard HPLC(1050)超聲清洗機(8892-DTH,QCC9601005C)K型熱電偶溫度記錄儀(KTx,6292753,6355146)Erlenmeyer燒瓶(8L,6L,4L,1L)燒杯(8L,6L,500mL,250mL)壇(4L,10L,50L)HDPE轉筒(55加侖，100加侖)容量燒瓶(100mL)塑料漏鬥Pastuer移液管和球管和Volumetric移液管(10mL,5mL)和球管風箱(25mL,50mL)稱量紙刮勺包裝材料(容器，蓋，標籤)原料溶液合成步驟12-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的合成檢查USP水系統的完整性。向反應器中加入稱量過的USP級純水(28000g±100.0g)並以190±10RPM攪拌。在水分散開時記錄USP水的導電性。
加入N,N-二甲基-1,4-亞苯基二胺(5.128mol,720.0g±3.0g)。物料應以粉末的形式(無團塊)加入。攪拌10分鐘(±5分鐘)。
加入鹽酸(6N,1136.9g±5.0g)。攪拌15分鐘(±5分鐘)。
按照SOP#LM-007校準pH計。用塑料取樣器取將近10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS1a。檢測pH值並記錄。pH值必須在2.8-3.8@25℃±5℃。
加入硫酸鋁十六水合物(4328.0g±21.0g)。以275±10RPM攪拌10分鐘(±5分鐘)。
加入氯化鋅溶液(3641.5g±18.0g)。冷卻至4℃±1℃。
一旦溫度(PV1)為4℃±1℃，在20分鐘(±5分鐘)的時間裡加入(6532.4g±32.0g)重鉻酸鉀溶液。添加完成後攪拌20分鐘(±5分鐘)，然後將主菜單的設定點(SP1)改為25.0℃。
溫度達到20.0℃±3.0℃時加入硫代硫酸鈉五水合物溶液(3570.2g±18.0g)。在25℃下攪拌溶液30分鐘(±5分鐘)。
將設定點改為60℃。當溫度(PV1)達到60.0℃±3.0℃時攪拌反應混合物5分鐘(±3分鐘)，將LFE控制儀上的設定點改為10.0。
當溫度達到13.0℃±2.0℃時用塑料取樣器取約10ml反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS1b。檢測pH並記錄。pH必須為3.1-4.1@25℃±5℃。
合成步驟2吲噠胺硫代磺酸的合成稱量出鄰-甲苯胺(604.0g±2.5g)並在冰浴中冷卻至18℃±3℃。向鄰-甲苯胺中緩慢加入鹽酸(6N,1230.7g±5.0g)。從冰浴中取出鄰-甲苯胺鹽酸鹽並將溶液冷卻至38℃±3℃。將溶液加入反應混合物中攪拌5分鐘(±3分鐘)。
在20分鐘(±5分鐘)時間裡加入重鉻酸鉀溶液(6532.4g±32.0g)。添加完畢時攪拌10分鐘(±5分鐘)。
將控制儀設定點(SP1)改為60.0。反應混合物的溫度達到60.0℃±3℃時攪拌混合物25分鐘(±5分鐘)。將形成含有綠色吲噠胺的沉澱。
用移液管取約10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS2。記錄溶液顏色。
合成步驟3甲苯胺藍O和甲苯胺藍O氯化鋅復鹽的合成將LFE控制儀的設定點設至7.0。當反應混合物的溫度達到10.0℃±3℃時以20分鐘(±5分鐘)的時間裡加入重鉻酸鉀溶液(6532.4g±32.0g)。添加完畢後攪拌20分鐘。
以20分鐘(±5分鐘)時間加入重鉻酸鉀溶液(5225.9g±26.0g)。添加完畢後攪拌20分鐘(±5分鐘)。
用移液管量取約10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS3。
加入氯化鋅溶液(3641.5g±18.0g)。以350±10RPM攪拌20分鐘(±5分鐘)。
加入硫酸銅五水合物(2122.8g±10.0g)。攪拌15分鐘(±5分鐘)。
用移液管取約10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS4。
將控制儀設定點(SP1)改為100.0。當反應混合物溫度達到67.0℃±3℃時開始加入硫酸溶液至pH2.9±0.3，通過加入等分試樣(500mL,250,125mL，等)。個個添加過程完畢時攪拌5-10分鐘，檢測pH。
反應混合物溫度達到100.0℃±3℃時攪拌混合物35±5分鐘。
將控制儀設定點(SP1)改為35.0。當反應混合物溫度達到70.0℃±3℃時用移液管取約10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS5。
將控制儀設定點(SP1)改為2.5。在4小時內冷卻至2.5℃並在2.5℃±2.0℃下保持4-18小時。
用移液管取約10mL反應混合物試樣。標明試樣號#.IPS6。記錄溶液顏色。檢測pH值並記錄。用0.45微米濾紙過濾試樣。取約100毫克沉澱溶解在約100mL HPLC水中。用0.45微米濾紙過濾溶液。標明試樣號#.IPS7並用RP-HPLC甲苯胺藍O分析方法分析試樣。見實施例3。記錄結果。
提純步驟1用適宜的過濾介質(Whatman級52)對反應混合物試樣進行過濾。
當反應器空著的時候稱量24.0kg±150.0g 30％NaCl溶液並加入24.0kg±150.0g USP水(記錄分散水的導電性)。關閉反應器的底閥並向其中加入15％NaCl溶液。短暫地攪拌溶液。當過濾完成時向過濾裝置中加入NaCl溶液漂清濾餅。將濾液收集在同一容器中並標明#.HW1(有害廢物1)。
按照廢物處理規程處理濾液(#.HW1)。
檢查100加侖夾層玻璃管線提純罐#1的狀況，確保已經標明「清潔」、日期和籤名。給提純罐裝上HDPE蓋，Caframo攪拌器，攪拌軸，槳葉和插入塑料熱電偶孔中的熱電偶探頭。檢查底閥關閉、出口蓋緊。
給提純罐標明#.P1A(提純1A)。
稱量190.0kg±1.0kgUSP水，注入HDPE容器中(記錄分散水的導電性)，將水移至提純罐1。以350RPM攪拌混合物。當用NaCl洗滌濾餅完成後邊攪拌邊將濾餅加入到提純罐1中。
攪拌混合物2-4小時。取約50mL試樣(從底閥)。作上標記#.IPS8。記錄溶液顏色。
將提純罐1的LFE控制儀設定在75.0(SP1)。
當混合物溫度(PV1)達到75.0℃±3℃時，將控制儀的設定點改為40.0。
在40℃下以350RPM攪拌混合物12-36小時。
取約50mL試樣(由底閥)。標明試樣號#.IPS9。記錄溶液顏色。檢測pH並記錄。用1.0mL移液管量取1.0mL試樣並在100mL容量燒瓶中稀釋到100mL。標明試樣號#.IPS9A。然後用10.0mL移液管量取10.0mL此溶液並在100mL容量燒瓶中稀釋到100mL。標明試樣號#.IPS9B。用分光光度計20+測量這些試樣的吸收。記錄結果。試樣9B的吸收應≥0.220。
提純步驟2在過濾裝置中用過濾介質將混合物過濾。將濾液收集在有蓋的Tared HDPE容器中。
檢查100加侖夾層玻璃管線提純罐#2的狀況，確保已經標明「清潔」日期和籤名。給提純罐裝上HDPE蓋，Caframo攪拌器，攪拌軸，槳葉和插入塑料熱電偶孔中的熱電偶探頭。檢查底閥已標明「清潔」、關閉(水平位置)、出口蓋緊。
給提純罐標明#.P2A(提純2A)，日期和籤名。
當過濾完成時稱量容器和溶液。扣除容器重量。記錄溶液重量。計算溶液體積。
(TBO溶液重量g)(100.0mL TBO溶液/100.42gTBO溶液)=TBO溶液的mL將濾餅標明#.HW2(有害廢物2)並按廢物處理規程處理。
稱量等於上面記錄溶液體積的30％NaCl溶液，注入清潔的HDPE容器，用下式(TBO溶液的mL)(116.91gNaCl溶液/100.0mL NaCl溶液)=NaCl溶液g樣品≈10mL的過濾試樣，檢測pH。標明#.IPS10。pH必須3.0-4.0。將濾液(重量)轉至提純罐2。以350RPM攪拌溶液。
加入氯化鋅溶液(1636.3g±6.5g)。
將NaCl溶液(重量)移入提純罐2。
將提純罐2的LFE控制儀設定在75.0(SP1)。
當混合物溫度(PV1)達到75.0℃±3℃時，將控制儀的設定點改為5.0。
在6小時時間內冷卻至5℃並保持在5℃±4.0℃4-24小時。
取約50mL試樣(從底閥)。標明試樣號#.IPS11.PT2.。
製作方法Ⅰ．過濾在過濾裝置中用配衡過濾介質(Whatman級52)過濾混合物。
稱量12kg±50g 30％氯化鈉溶液，用12kg±50g USP水稀釋(記錄分散水的導電性)。向布氏漏鬥中直接加入15％氯化鈉溶液洗滌濾餅。過濾完畢時小心移出裝有甲苯胺藍O產物的濾紙。
按廢物處理規則處理#.HW3(有害廢物3)。
ⅱ．乾燥將TBO產物放入乾燥箱，在50.0℃±3.0℃乾燥5±1小時。給乾燥箱標明#.PRE-DRY。
從強制空氣乾燥箱中取出產物，放入真空箱。在45.0℃±3.0℃@28」Hg±2」Hg下乾燥10±2小時。給乾燥箱標明#.DRY。
ⅲ．稱重取出產物並稱量甲苯胺藍O和濾紙重量。扣除濾紙重量並記錄TBO重量。
用不鏽鋼刮勺小心地從濾紙上除下產物。戴上Dust/Mist面罩。稱量甲苯胺藍。
ⅳ．粉碎將產物移到「甲苯胺藍O完成區」。檢查Thomas Wiley實驗室磨的狀況，確保已經標明「清潔」、日期和籤名。使用0.5mm篩網。將清潔的容器連到輸送槽上。艙室的門必須關閉和鎖住。
關閉漏鬥底部的滑動開關，打開漏鬥蓋，加入試樣。蓋上漏鬥蓋。開啟磨，輕輕打開滑動開關。緩慢將試樣裝入磨的艙室使磨不至於慢下來或堵住。
粉碎完全時小心地從輸送槽上取出瓷瓶。
ⅴ．混合檢查Patterson-Kelly實驗室混合器的狀況，確保已經標明「清潔」、日期和籤名。
將甲苯胺藍O產物移至混合器容器中並關閉蓋子。設定時間為15分鐘±5分鐘。
ⅵ．測試作產物試樣以備測試。用RP-HPLC甲苯胺藍O分析方法分析試樣。記錄結果。
實施例2臨床試驗方法臨床試驗溶液的製備此實施例描述實施例1的TBO產物用於鑑別口腔發育異常的用途。
將實施例1的TBO產物、覆盆子香精(IFF覆盆子IC563457)，醋酸鈉三水合物緩衝劑和H2O2(30％USP)防腐劑(見US專利5372801)溶解在純水(USP)、冰醋酸和SD18乙醇中，製得TBO試驗溶液，其組成如表A所列表A成分 重量％TBO產物1.00香精.20緩衝劑 2.45防腐劑 .41醋酸 4.61乙醇 7.48水83.85100.00在純水中用1wt％的醋酸預漂洗和後漂洗試驗溶液，準備好苯甲酸鈉防腐劑和覆盆子香精。
臨床方法給患者披上圍布以便保護衣物。估計會有痰，故給患者提供一個10oz的杯子，咳出物可傾倒於有害廢物容器或可直接倒進洗滌盆下水道中央以免汙染洗滌盆。將可能被汙染的環境表面或物品罩起或從試驗區移走。
進行口腔癌的目視檢查，不使用任何會使軟組織產生劃痕或切口的器械。用預染色在軟組織和牙齒上作出標記。
讓患者用約15ml預漂洗溶液漱口約20秒然後吐出，吐去過多的唾液使口腔環境恆定。然後再用預漂洗溶液重複此步驟。
然後，患者用水漂洗和漱20秒，吐出。
然後，患者用30mlTBO試驗溶液漂洗和漱口1分鐘，吐出。
患者用15ml後漂洗溶液漂洗20秒，吐出。然後重複這一步。
患者用水漂洗和漱口20秒，吐出。然後重複這一步。
對口腔進行觀察，必要時使用適宜的軟組織檢測技術，包括退縮(retraction)、平衡光(well-balanced lighting)和放大。預計的疾患處被染上藍色，記錄位置、大小、形態、顏色和表面特徵。
為了減少錯誤的陽性結果，請患者在10-14天後返回重複上述檢測方法。在這一期間讓時間去治癒任何第一次檢查時存在的潰瘍或創傷或刺激病源。第二次檢查之後，在第一次檢查確定的預計區域出現的陽性染色被認為是癌或癌症前期的表示，應進行活組織檢查來確認這一結論。
早期無核紅細胞染上藍色，經常為點彩或塊狀圖樣。但是，舌背上的不規則乳頭縫被染上藍色是正常的，不表示陽性。保持藍色但不認為是陽性的其他區域包括每顆牙齒的牙斑、牙齦邊緣，從舌背保留的染色移走的染料在軟顎上形成的滲出染色，以及容易確診的潰瘍。在任何情況下，當某一疾患被高度懷疑但用本檢測不呈陽性染色時，無論如何都要進行活組織檢查。
實施例3HPLC方法本實施例描述一種分析TBO試樣的方法，可在確認、分析和提純試驗中使用。
儀器和器材乙腈，HPLC級冰醋酸，試劑級乙酸銨，試劑級去離子水，適宜於進行HPLC分析的pH計，配有標準pH4.0和7.0緩衝劑實驗室玻璃器皿，包括容量瓶和移液管超聲浴分析天平磁性攪拌器壓縮氦有0.45微米尼龍過濾器的過濾裝置100μL注射器HPLC色譜儀和輔助設備，包括Hewlett Packard系列1050泵，或能夠isocratic高壓液流的等效設備Hewlett Packard系列1050二級管陣列探測器，或相當的波長UV探測器Hewlett Packard Vectra系列3磁碟驅動器(計算機控制器)配有超VGA 1280顯示器和雷射印表機或等效的積算記錄儀Prodigy,5μ,QDS(3)100A,2.5cm×4.6mm，或等效的HPLC柱固定環形注射器(10或20μL)柱加熱器流動相的製備將0.77g乙酸銨移到1000mL容量瓶中製得1升0.01M乙酸銨溶液。加水，混合至溶解並用水稀釋至刻度。將0.010M乙酸銨溶液移到Earlenmeyer燒瓶中，用磁性攪拌器攪拌。使用事先用pH4.0和7.0緩衝劑校準的pH計，用乙酸將溶液的pH值調節到3.3和3.6之間。用0.45μL過濾器將溶液過濾。用Millipore過濾裝置通過0.45μ尼龍過濾器過濾乙腈，並向攪拌的乙酸銨水溶液中精確加入250mL。將盛裝此流動相的容器放在HPLC泵的入口處，用氦清掃5-10分鐘。
TBO試樣的製備準確稱出50mgTBO試樣，移至100mL容量瓶中並用水稀釋到刻度線。蓋上燒瓶，超聲30分鐘並混合。這是約0.5mg/mL的儲備液。
將10.0mL儲備液移到100mL容量瓶中，用水稀釋到刻度線並混合。給這一約0.05mg/mL稀釋的TBO工作溶液作上適當的標籤。
色譜條件注射量-10或20μL流速-約1.5mL/分鐘柱溫-40℃探測器波長-254nm靈敏度和衰減設定適宜於所使用的儀器積分-相應面積試樣的HPLC分析裝配HPLC並用流動相使之達到平衡。用USPⅩⅩⅢ系統適用性試驗檢驗所得HPLC數據的精確度和準確度。
每次分析，計算以下參數精確度最少對比五次注射的工作試樣。相對標準誤差(RSD)必須等於或小於2.0％。峰5-8的結合面積的RSD大於2.0％，但小於3.0％時作六次注射。
解析度計算試樣的一個色譜圖上峰7和8(主要的峰)的基線解析度，用下面等式R=2(t2-t1)w1+w2]]>其中t1=峰7的保留時間，mmt2=峰8的保留時間，mmw1=峰7的峰寬，mmw2=峰8的峰寬，mm峰7和8之間的解析度必須大於1.5。
拖尾測定峰的對稱性確保峰下面的面積精確。計算試樣的一個色譜圖上峰7和8的拖尾因子(T)，用下面等式T=W0.05÷2f其中W0.05=從峰高的基線峰的5％處測定的峰寬f=峰最大值與W0.05處峰前部位之間的距離T應是小於3的因子。
記錄色譜，測定主要峰(5,6,7和8)以及所有出現在色譜上的雜質峰(所有的峰，除了前面的溶劑峰)的相應面積。
計算和其他HPLC測定同一性(TBO藥物與藥產品)製備試樣的色譜輪廓應當與圖2色譜的輪廓(峰的存在和峰的強度)相同。
相關物質(藥物)計算每種雜質峰(峰1、2、3和4所示的已知雜質加任何其他雜質的峰)的面積相對於色譜上所有峰的總面積的百分數。
TBO藥物的分析按照針對雜質的方法，計算四個主要TBO峰(峰5-8)中每一個的百分數，即
經過對我的發明的如此描述，本領域技術人員能夠理解和實施本發明，並確定了目前優選的最好方式。
權利要求
1．一種新的組合物，包括(A)甲苯胺藍O的構象異構體；和(B)所述異構體的N-脫甲基衍生物，代表所述異構體的254nmHPLC峰的結合面積與代表所述N-脫甲基衍生物的峰的結合面積的比為至少約6∶1。
2．一種新的組合物，包括(A)第一組成分，包括-2位上有環上甲基的甲苯胺藍O的構象異構體，它的N-脫甲基衍生物和它的N,N-脫甲基衍生物；和(B)第二組成分，包括-4位上有環上甲基的甲苯胺藍O的構象異構體，它的N-脫甲基衍生物和它的N,N-脫甲基衍生物；代表所述第一組成分的254nmHPLC峰的結合面積與代表所述第二組成分的HPLC峰的結合面積的比為至少約25∶1。
3．一種新組合物，包括甲苯胺藍O的構象異構體，其中-2位上有環上甲基的異構體(峰8)構成所述組合物的有機染料成分總量的至少58％。
4．在確認發育異常組織的方法中，將在液體載體中的權利要求1組合物用於人口腔組織的步驟。
5．在製備甲苯胺藍O(「TBO」)的方法中，該方法包括如下步驟(A)在第一反應混合物中氧化N,N-二甲基-對-亞苯基二胺，形成第一中間體2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸，(B)在第二反應混合物中用鄰甲苯胺氧化所述第一中間體並縮合該氧化物，得到第二中間體吲噠胺硫代磺酸，(C)氧化所述第二中間體使吲噠環閉合，得到溶於第三反應混合物中的含TBO的反應產物，(D)向所述第三反應混合物中引入複合劑，形成溶於所述第三反應混合物中的TBO複合物產物，(E)從所述第三反應混合物中沉澱所述TBO複合物產物，和(F)從所述第三反應混合物中分離含有TBO的構象異構體和它的N-脫甲基和N,N-脫甲基衍生物的所述TBO複合物產物，該改進的方法包括在所述第三反應混合物形成之前向反應混合物中引入所述複合劑。
6．權利要求5的方法，其中反應混合物的溫度保持在不高於約10℃。
7．權利要求5的方法，其中反應混合物的pH值保持為第一反應混合物中約2.8-3.8，第二反應混合物中約3.1-4.1和第三反應混合物中約3.0。
8．甲苯胺藍O的構象異構體之一的N-脫甲基衍生物。
9．甲苯胺藍O的構象異構體之一的N,N-脫甲基衍生物。
10．分析甲苯胺藍O染色產品的HPLC方法，所述方法包括製備流動相，製備TBO樣品溶液，用流動相流動平衡HPLC柱，和將樣品溶液注射到HPLC柱中，確認樣品的染色成分和分析、測定所述試樣的純度的改進，所述改進包括將所述流動相製成包括有機酸水溶性鹽的組合物。
11．權利要求5的方法，包括向所述第一反應混合物中引入硫代磺酸離子的步驟，其時保持所述第一反應混合物的溫度不高於約10℃。
12．合成2-氨基-5-二甲基氨基苯基硫代磺酸的方法，包括在硫代硫酸根離子存在的情況下氧化N,N』-二甲基-對-亞苯基-二胺，其時保持反應混合物的溫度不高於約10℃。
全文摘要
合成、分離和確定甲苯胺藍O(「TBO」)的兩個構象異構體N－脫甲基和N,N－脫甲基衍生物的方法。體內生物染料組合物,包括TBO的構象異構體和這些N－和N,N－脫甲基衍生物。這些異構體與這些脫甲基衍生物的比例為至少6∶1。確定發育異常口腔組織的改進方法,包括將這種在液體載體中的TBO產物應用於口腔細胞。確定含有TBO構象異構體和它們的N－和N,N－脫甲基衍生物的TBO產物的HPLC方法。流動相包括有機酸化合物的水溶液。
文檔編號A61B10/00GK1225278SQ9812414
公開日1999年8月11日 申請日期1998年11月10日 優先權日1997年11月13日
發明者D·D·布凱特 申請人:濟拉公司