通過光纖陣列掃描技術發現親和試劑和催化劑的製作方法
2023-07-18 21:09:56
本發明是在由空間與海上作戰系統司令部太平洋系統中心(spaceandnavalwarfaresystemscommandsystemscenterpacific)授予的合同號為n66001-14-c-4059的政府支持下完成的。政府對本發明享有一定權利。介紹針對生物、物理或化學性質篩選大的化合物集合的快速且成本有效的方法在許多行業中仍然是難題。製藥公司已經開發了高通量篩選操作，其可以在約幾個月內篩選多達200萬種化合物，但這些操作需要高端自動化、複合存儲和檢索系統以及若干fte來運行和維護。基於由sri開發的用於篩選循環腫瘤細胞(ctc)的光纖陣列掃描技術(fast)，我們設想使用同樣的平臺篩選被共價連接或吸附到珠上的化合物，所述珠的尺寸類似於白細胞(10-20微米，但可以98％的hplc純度，並且使用1d/2dnmr、ms和cd明確地歸屬結構。我們已經製備的規模>1克至純度≥98％[1-3]的非天然單體的實例包括：計算設計與優化。本發明提供了計算化學工具，其與用於肽和蛋白質結構和功能的建模的計算化學工具類似，以模擬非天然結構單元(buildingblock)、聚合物和庫設計。開發標準包括：非天然單體的參數化；對結構單元的量子力學(qm)計算，以獲得精確的電荷、鍵長和角度；對單體的二聚體和三聚體的qm計算，以獲得二面體偏好。在具有這些結構單元的聚合物上驗證計算工具；在可能的情況下，從具有相似結構單元的偽肽的蛋白質資料庫(pdb)提取數據集；使用來自數據集(1)的參數和來自初始命中的結構數據(nmr，x射線)運行相關的工具模塊；應用於新的生物活性聚合物的設計；使用更可能以新穎和多樣的方式摺疊並呈現結合或催化功能的序列設計偏好庫(biaslibrary)。大型(>108+)組合庫的產生。為了適應非天然聚合物的巨大的理論序列空間，使用組合分裂和匯集(splitandpool)合成策略[6]合成了>108-12種聚合物的庫。實施方案利用了已確定的固相合成方法，其中使用聚乙二醇(peg)-接枝的微珠作為固體支持物。主要使用fmoc化學方法添加單體單元，並在96孔過濾歧管(filtrationmanifold)中進行。使用perkinelmerjanus或biomekfx液體處理工作站進行試劑添加、洗滌和真空過濾步驟。在加入最終的單體單元後，將聚合物在珠上脫保護、洗滌並乾燥。由於我們的偶聯反應中的大多數基於已確定的fmoc化學，因此我們使用已有的用於標準肽偶聯的方案，並針對包括非天然單體單元的步驟優化反應條件。在實施方案中，使用範圍為20-30個單體單元的聚醯胺來確定能夠形成良好摺疊結構的最小長度。我們已經表明，通過分子動力學模擬能夠設計只有四個單體的天然多肽，通過1d和2dnmr評估[5]，它們可以摺疊成緊密的二級結構。還可以使用隨機變換[7]以及位置掃描方法[8]產生庫。篩選非天然聚合物庫以鑑定粘合劑和催化劑；癌症診斷劑。循環腫瘤細胞(ctc)是由腫瘤脫落進入血流中的單個癌細胞，並且被認為有助於轉移過程。ctc表型代表原發性腫瘤狀態，因此其通過簡單的血液抽取提供了癌症患者整個腫瘤狀態的「液體活檢」-用於非侵入性監測和直接癌症治療的潛在的非常強大的診斷工具。鑑定ctc的主要困難是它們是非常稀少的(在500萬中>1個細胞)；然而，被稱為光纖陣列掃描技術(fasttm)細胞儀的sri平臺基於採用掃描雷射「複印(xeroxing)」血液樣品的概念，並使用密集聚集的光纖陣列束收集樣品的高解析度捕獲圖像[9]。在fast過程中，使用標準微量滴定板的印跡將血液樣品鋪在載玻片上。載玻片塗覆聚賴氨酸移植物，用於確保單分散的細胞層的形成並將細胞固定到玻璃表面。然後使用螢光標記的ctc靶向劑處理在載玻片上的細胞單層，並使用fast系統掃描。僅需要60秒就能創建存在於載玻片上的螢光標記的ctc位置的數字圖像。這是一個特別靈敏的系統，我們已經證明其可以可靠地檢測在含有>25,000,000個白細胞的載玻片上的個位數的ctc。該系統經過良好的驗證並且是穩定的：sri已經在fast系統上處理了數千個血液樣品，目前被列為人類臨床試驗的診斷平臺，在癌症護理中驗證ctc分析。一旦它們的位置被fast系統確定，我們通常使用抽吸系統從載玻片挑選單個細胞，然後將在緩衝液中的單個細胞轉移到384-或1536-孔板用於進一步處理。大型組合庫的fast高通量篩選(hts)：非常快速和靈敏的篩選平臺，其可以在僅4分鐘內篩選>100,000,000種化合物(>108)的生物聚合物庫。為了便於在珠上篩選，在包含具有peg接枝共聚物表面的聚苯乙烯珠芯的tentagel-型樹脂上合成化合物。peg塗層有助於顯示結合到珠表面的化合物，用於在水性緩衝液中篩選。我們的方法提供了以多種新方法重新進行珠上固相篩選；例如：珠可以與細胞的尺寸相同：用於固相篩選的珠的直徑為5-500微米。在fast平臺上篩選的白細胞範圍通常為8-30微米。雖然趨勢是在較大的珠上合成化合物以使化合物的產量最大化，但是對於珠上篩選，我們僅需要足夠的聚合物以(i)證明親和性或催化活性和(ii)一旦選定為初步命中，確定該聚合物分子結構。通過在較小的珠(直徑為～10-20微米)上合成庫，我們可以在少至250-500mg的樹脂上合成100,000,000個成員的庫。可以使用fast平臺篩選珠：如同ctc篩選所使用的，可以使用在載玻片上的基於螢光的分析篩選25,000,000個成員的珠上庫。一旦聚合物庫已經在固相載體上合成，就將其分散到fast載玻片上，用螢光標記的靶試劑處理，並在fast掃描儀上篩選親和性或酶活性。srifast系統可以在4分鐘內掃描並識別108個成員庫中的命中(每張載玻片60秒)。可以選擇珠用於表徵：使用與開發用於fastctc挑選相同的細胞挑選系統，我們可以從載玻片挑選出選定的珠，並將其遞送至384或1536孔板，以用於樹脂裂解和lc/ms/ms表徵(參見下面的測序部分)。單個細胞挑選花費15-20秒/細胞。例如，假設在平板上檢測到100次命中，珠挑選將僅需33分鐘，或者對於整個108庫僅需～2小時。我們將該實施例規模化為108的庫，但整個過程容易地擴展為更大的庫(110-12)或多個不同的庫。該方法也容易地應用於篩選與生物靶點的結合，所述生物靶點例如有機塗層片段或蛋白、寡糖、蛋白質、dna/rna序列、細胞因子或肽-基本上是可以使用螢光標記標記並直接施加到如上所述的在用於讀取的載玻片上的庫的任何試劑。對於一些小分子，使用螢光標記標記可以顯著影響試劑的物理化學性質及其結合譜，因此在供選擇的方法中，我們通過在合成的每個庫化合物開始和結束時摻入螢光和淬滅標記來使用螢光共振能量轉移(fret)分析，然後在施加試劑之前和之後使用fast確定載玻片上單個珠的螢光調製。可以針對該類型的分析優化fret分析和螢光團，但是fast掃描儀已具有檢測螢光強度和波長的甚至微小變化所需的靈敏度。測序和表徵非天然聚合物。在實施方案中，我們使用直徑10-20微米的peg-接枝的聚苯乙烯珠來合成大型庫。通常，這些類型的樹脂具有每克樹脂0.2-0.3mmol化合物的負載能力。假設產物從珠合成、裂解和分離100％成功，則在一克樹脂中有大約2.5億個20微米的珠，這相當於～1pmol的化合物/珠。即使假設在只有1％的產量的最差的情況下，來自最大負載為1pmol的單個珠的30聚體的聚合物將產生10fmol的產物。該產物的量可以通過1dlc/ms/ms分析容易地確定。可以構建包含庫的所有可能序列的資料庫，並用於由ms和ms/ms數據鑑定生物聚合物。對於珠上的單一化合物，僅有少量的[ms，ms/ms]光譜對通過碎片模式數據從其他匹配的ms庫成員去卷積。驗證。測序後，可以通過再合成和基於二次溶液的結合分析(包括kd的測量)證實命中。通過nmr或x射線晶體學對一系列親和試劑命中的構象分析(單獨和結合到靶試劑)能夠優化預測模型，例如通過以下步驟：比較命中與非命中的整體(1d)和結構(3d)特性分析命中與非命中的構象和靶點結合行為基於計算特性的集群庫集中於其中命中顯著過度表示的集群導出結構-活性模型該集合可以用於建立在篩選中和下一代庫設計中發現的用於在結合基序中表示的新的二級結構類型的模型，並用於通過結構-活性關係(sar)繪圖優化用於與特定靶試劑結合的親和試劑。參考文獻1.keej-m,villanib,carpenterlr,muirtw(2010)developmentofstablephosphohistidineanalogues.jamchemsoc132:14327-14329.2.webbtr,eigenbrotc(1991)conformationallyrestrictedarginineanalogs.jorgchem56:3009-3016.3.webbtr,jiangl,sviridovs,venegasre,vlaskinaav等，(2007)applicationofanoveldesignparadigmtogenerategeneralnonpeptidecombinatorialtemplatesmimickingβ-turns:synthesisofligandsformelanocortinreceptors.jcombchem9:704-710.4.webbtr,venegasre,wangj,deschenesa(2008)generationofnewsyntheticscaffoldsusingframeworklibrariesselectedandrefinedviamedicinalchemistsyntheticexpertise.jcheminfmodel48:882-888.5.songb,kiblerp,maldea,kodukulak,galandeak(2010)designofshortlinearpeptidesthatshowhydrogenbondingconstraintsinwater.jamchemsoc132:4508-4509.6.salmonse,lamks,leblm,kandolaa,khattrips等，(1993)discoveryofbiologicallyactivepeptidesinrandomlibraries:solution-phasetestingafterstagedorthogonalreleasefromresinbeads.procnatlacadsciusa90:11708-11712.7.menendeza,scottjk(2005)thenatureoftarget-unrelatedpeptidesrecoveredinthescreeningofphage-displayedrandompeptidelibrarieswithantibodies.analbiochem336:145-157.8.houghtenra(1993)thebroadutilityofsolublepeptidelibrariesfordrugdiscovery.gene137:7-11.9.liux,hsiehhb,campanad,brucerh(2012)anewmethodforhighspeed,sensitivedetectionofminimalresidualdisease.cytomparta81a:169-175.本發明的另外的描述在一方面，本發明包括：基於功能豐富的分子框架的類藥單體，其被組裝到具有特別功能的非天然聚合物(nnp)中；和/或光纖陣列掃描技術(fast)在<5，<10或<30分鐘內對108-10個成員的庫進行基於螢光的篩選；使用摻入到序列結構中的ms「條形碼」將nnp設計為固有地自身可讀的分子；新的生物活性nnp的結構分析揭示了用於分子識別的方式。非天然單體的設計。用於開發類藥單體骨架的標準包括：穩定的、手性的、合成上規模可改變的、最小的分子量、適度的柔韌性、官能團密度加上可靠的化學性質和正交側鏈保護基等。這些標準用於製備單體組，例如通過候選組1-3示例的，其中-oh/cl和fmoc位置產生單體鏈連接：單體組可以設計為對不同的骨架扭轉角取樣以潛在地探索新型聚合物摺疊幾何形狀。設計併合成單體組1，二氫異喹啉酮：通過sfc或共結晶手性拆分對映異構體示例性單體可裂解的二級結構約束；誘導三級結構採用專門的單體、二級結構約束(ssc)將三級結構誘導成nnp。ssc也可能被設計為可裂解的，以便於nnp的基於ms的測序：nnp子庫構型。構建具有單體和ssc的～30聚體的構型，以最大化多樣性；圖3。可以加入零間隔單體(例如β-丙氨酸)以簡化序列和合成。總庫＝4.03x108使用無孔(well-fee)板進行珠上的庫的fast篩選，其中化合物附著到珠而不是孔，並且通過珠大小(例如直徑)測定分析/板的數量；例如，對於50-100um的珠為1×105-6；10um珠為25x106。fast超大篩選每分鐘能夠篩選數百萬種化合物。在示例性的分析中：在管中將螢光靶點與108個珠的庫結合，孵育和洗滌，轉移～25m10um珠/載玻片，fast掃描(～1分鐘/平板)，分級並測定信號強度，其中雙波長可以減少假陽性，自動化挑選珠並轉移至384孔板，從珠裂解nnp並測序。篩選：創建並展示可通用的篩選策略和平臺。將珠分散並附著到載玻片-螢光分析、結合或酶活性-fast定位命中-adm驗證命中-珠挑選-測序。命中的表徵。針對結合親和性或催化活性表徵命中親和試劑：通過表面等離子體共振(spr)確定結合親和性以測量締合和解離常數(ka，kd)催化：使用michaelismenten模型確定vmax(最大速度)，km(米氏常數(michaelisconstant)，1/2vmax)。催化常數(kcat)示差掃描螢光分析(dsf)、動態光柵(dls)、分析尺寸排阻色譜(ansec)摺疊、複合物形成、溶解性、穩定性針對最多3次命中/靶點的x射線結構確定nnp的ms確定珠直徑nnp的理論摩爾數/1個珠*ms+ms/ms檢測靈敏度90微米21pmol可操作的10微米63fmol可操作的(快工作周期蛋白組學)*具有10％的nnp分離產率用於nnpms碎片的測序方法：檢測測序離子：a、b、c、x、y、z；用於複雜nnp骨架的額外的骨幹碎片；圖4。用於簡單和快速測序的庫設計；自身可讀的nnp如圖5所示。用於序列測定的同位素編碼的ms標籤：摻入ms標籤提高了測序的靈敏度，並實現從較小的聚合物碎片重建全長序列，圖6。可以使用多個和/或供選擇的碎裂(fragmentation)模式：測序可以被優化，例如，針對每種類型的nnp優化每種碎裂方法；產生更多的測序離子：使用多種碎裂方法；msn；庫。設計；使用每種方法比較用於已知的nnp的確定的測序離子，方法的組合；支持向量機器學習分析等。自身可讀的聚合物的自動測序實施標準：複雜數據的軟體分析，改編，使用nnp碎裂數據比較不同的檢索引擎；使用上述類別中的最佳性能的蛋白質組學引擎分析來自已知nnp的初始數據集；使用引擎組合；組合的碎裂數據，msn等；庫設計，例如無等壓單體。本發明包括所述特定的和優選的實施方案的所有組合。應當理解，本文描述的實施例和實施方案僅出於說明目的，並且鑑於其本領域技術人員得到各種修改或改變的建議，並且各種修改或改變包括在本申請的精神和權限內以及所附權利要求的範圍內。本文引用的所有出版物、專利和專利申請，包括其中的引用文獻，出於所有目的通過引用整體併入本文。當前第1頁12當前第1頁12