血管緊張素轉化酶抑制肽的製作方法

2023-07-18 07:47:36

專利名稱：血管緊張素轉化酶抑制肽的製作方法
技術領域：
本發明涉及具有血管緊張素轉化酶(在下文中也稱為ACE)抑制活性的肽。更具 體地，本發明涉及具有ACE抑制活性的肽，當其作為降血壓劑用於藥用組合物以及用作患 有高血壓的人用特別用途食品、營養食品、功能性食品、特定保健用食品、標榜有降血壓作 用的食品和飲品等時，其廣泛地適用於抑制血壓上升以及適用於預防高血壓等。
背景技術：
ACE為在血壓和體液量調節中起重要作用的蛋白水解酶，並且在控制血壓上升 的凝乳酶_血管緊張素系統中具有將血管緊張素I轉化為具有強的高血壓活性的血管緊 張素II的活性。已經對這種酶的抑制劑進行了多種研究，並且已知它們具有降低血壓的 活性(D. W. Cushman 等人，Biochemical Pharmacology, Vol. 20，第 1637-1648 頁(1971)； Robert J. L.等人，The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, Vol. 204，第281-288頁(1977))。關於ACE抑制劑，已經研究了多種藥劑，並且有多 禾中為市售的(Yoshihiro Kaneko 等人，「Igaku no Ayumi，，(Progress in Medical Science), vol. 122，第 62-85 頁，1972 ；Toshio Hisayoshi 等人「Hitome de Wakaru Koketsuatsu 「 (Hypertension Recognizable at a Glance),2nd edition,第 54-55 Jit, 1998 ；Noboru Toda 等 Α " Jyunkankei Chiryoyaku no Sayo Mekanizumu" (Action Mechanism of Circulating system Therapeutic Agents),第 260-265 頁，1998)。另夕卜， 已經從酪蛋白和多種食品如明膠、沙丁魚和鰹中發現能夠抑制ACE的肽。例如，酪蛋白 由來的肽 VPP(Val-Pro-Pro，IC50 :9 μ Μ)、酪蛋白由來的肽 IPP (Ile-Pro-Pro，IC50 :5μΜ)、 和酪蛋白由來的肽VAP(Val-Ala-Pr0，IC5tl :2 μ Μ)、和玉米蛋白α-玉米醇溶蛋白由來的 LQP (Leu-Gin-Pro, IC50 :2 μ Μ)為已知的(Yasunori Nakamura 等人，Journal of Dairy Science, Vol. 78，第 777-783 頁(1995) ；Shinsuke Miyoshi 等人，Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 55(5),第 1313-1318 頁(1991) ；Susumu Maruyama 等人， Agricultural and Biological Chemistry, Vol. 51 (6)，第 1581—1586 頁(1987))。

發明內容
如上所述，考慮到其中已經廣泛地對ACE抑制劑進行研究和開發的現有技術狀 況，本發明的發明人努力開發一種全新的並且有效的ACE抑制劑。為了實現上述目的，本發明人從不同的觀點進行研究，結果，著眼於肽而合成了大 量的肽，特別是寡肽，然後對如此得到的肽進行篩選。結果，發現了具有優異的ACE抑制活 性的肽，並且體外試驗的結果確認了這些肽可用作降血壓劑，從而完成了本發明。本發明涉及以下的第(1)到(9)項
(1)包括由SEQ ID NO 1表示的胺基酸序列的肽；或
包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO :1表示的胺基酸序列中的氨基 酸序列並且具有血管緊張素轉化酶抑制活性的肽。
(2)包括由SEQ ID NO 2表示的胺基酸序列的肽；或
包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO :2表示的胺基酸序列中的氨基 酸序列並且具有血管緊張素轉化酶抑制活性的肽。
(3)包括由SEQ ID NO 3表示的胺基酸序列的肽；或
包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO :3表示的胺基酸序列中的氨基 酸序列並且具有血管緊張素轉化酶抑制活性的肽。
(4)血管緊張素轉化酶抑制劑，其包括第(1)到C3)中任一項的肽作為活性成分。
(5)包括第⑴到(3)中任一項的肽的食品或飲品。
(6)包括第⑴到(3)中任一項的肽作為活性成分的藥用組合物。
(7)權利要求(6)的藥用組合物，其為用於預防和/或治療由血管緊張素轉化酶異 常引起的疾病的藥劑。
(8)第(1)到(3)中任一項的肽在生產血管緊張素轉化酶抑制劑中的應用。
(9)第⑴到(3)中任一項的肽在生產用於預防和/或治療由血管緊張素轉化酶 異常引起的疾病的藥劑中的應用。


圖1表示乳酪由來肽的HPLC色譜圖。
具體實施方式
本發明的肽的具體例子包括以下(a)到(f)的肽
(a)包括由SEQ ID NO 1表示的胺基酸序列的肽；
(b)包括由SEQ ID NO 2表示的胺基酸序列的肽；
(c)包括由SEQ ID NO 3表示的胺基酸序列的肽；
(d)包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO :1表示的胺基酸序列中的 胺基酸序列並且具有ACE抑制活性的肽；
(e)包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO 2表示的胺基酸序列中的 胺基酸序列並且具有ACE抑制活性的肽；和
(f)包括其中將一個或多個胺基酸加入到SEQ ID NO 3表示的胺基酸序列中的氨 基酸序列並且還具有ACE抑制活性的肽。
在下文中，包括由SEQ ID NO :1表示的胺基酸序列(Met-Ala-Pro)的肽、包括由 SEQ ID NO :2表示的胺基酸序列(Ile-His-Ala)的肽、和包括由SEQ ID NO 3表示的氨基 酸序列(Ile-Gln-Ala)的肽還分別稱為MAP、IHA和IQA。
關於包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQ ID NO :1到3表示的胺基酸序列 中的胺基酸序列並且還具有ACE抑制活性的肽，對於被加入的胺基酸沒有具體限制，可以 使用任選的胺基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。對於要加入的胺基酸的數目沒有具 體限制，可以使用任選數目的胺基酸，只要得到的肽具有ACE抑制活性。然而，通常，加入的胺基酸的數目為1到10，優選為1到5，更優選為1到3，更優選為1或2，特別優選為1。具體例子包括以下的肽包括由SEQ ID NO :4表示的胺基酸序列 (Leu-Met-Ala-Pro)的肽、包括由 SEQ ID NO :5 表示的胺基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro)的 肽、包括由SEQ ID NO :6表示的胺基酸序列(Met-Ala-Pro-Pro)的肽、包括由SEQ ID NO 7 表示的胺基酸序列(Arg-Met-Ala-Pro-Pro)的肽、等等。本發明的肽可為向其加入工業用鹽如鹽酸鹽、乙酸鹽、硫酸鹽、琥珀酸鹽或酒石酸 鹽的那些，但是優選加入可食用的或可藥用的鹽。本發明的肽可單獨使用和作為兩種或多種肽的混合物使用。本發明的肽可通過常規的肽合成法生產，或者，它們可通過乳蛋白如酪蛋白的酶 促水解或化學水解製備。此外，可採用微生物發酵。本發明的ACE抑制劑包含本發明的肽，並且可以不同的形式被使用，如食品和飲 品、特定保健用食品、營養功能性食品、特別用途食品、健康食品、準藥物(quasi-drug)、藥 用組合物等。例如，其可作為藥用組合物或準藥物直接給用，或作為如健康食品和特定保健 用食品的特別用途食品、或營養功能性食品直接攝取；或者通過預先將其加入到各種食品 中而被攝取，各種食品如牛乳、軟飲品、發酵乳、酸乳、乳酪、麵包、小點心、脆餅、和比薩片。為了生產上述食品，可以將水、蛋白質、糖類、脂類、維生素類、礦物質類、有機酸、 果汁、香料等作為主要成分合併。例子包括動植物性蛋白如全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂 奶粉、乳清粉、乳清蛋白、乳清蛋白濃縮物、乳清蛋白分離物、α -酪蛋白、β -酪蛋白、κ -酪 蛋白、β-乳球蛋白、α-乳清蛋白、乳鐵蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白及其水解物；多種 乳由來成分，如黃油、乳清礦物質、奶油、乳清、乳清礦物質、非蛋白氮、唾液酸、磷脂和乳糖； 碳水化合物，如蔗糖、葡萄糖、果糖、糖醇類、麥芽糖、低聚糖類、改性澱粉(糊精以及可溶性 澱粉、British澱粉、氧化澱粉、澱粉酯、澱粉醚等)和食用纖維；動物性油脂，如豬油和魚 油；植物性油脂，如棕櫚油、紅花油、玉米油、菜籽油、椰子油及其分餾油(fractional oil) 包括氫化油、酯交換油等；多種維生素，如維生素A、維生素B類、維生素C、維生素D類、維生 素E、維生素K類、維生素P、維生素Q、尼克酸(niacin)、煙酸(nicotinic acid)、泛酸、生物 素、肌醇、膽鹼、葉酸；礦物質如鈣、鉀、鎂、鈉、氯、銅、鐵、錳、鋅、硒、氟、矽、碘；和有機酸和 有機酸鹽，如蘋果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸等；並且可任選地選擇和加入其中的一種或兩種 或多種。如有需要，除了合成產品之外，還優選將它們作為含有大量它們的食品加入。當本發明的產品用作藥用組合物或準藥物時，它們可作為多種鹽給藥。例如可將 其作為與鹽酸、乙酸、甲酸等的鹽給藥。給藥方法包括經口給藥、經皮給藥、經腸給藥、經血 管給藥、靜脈內注射、肌肉內注射、滴鼻劑、滴眼劑、吸入、直腸給藥等。另外，它們可以不同 的形式給藥。例如，可以片劑、錠劑、膠囊、顆粒、粉末、糖漿、懸浮液、溶液等形式給藥。這些 不同的藥劑可以根據常用方法使用通常用於藥劑生產技術領域的常規助劑製備，常規助劑 如填料、粘合劑、崩解劑、潤滑劑、矯味劑、增溶劑、助懸劑和具有基本試劑的包衣劑。因為本發明的肽具有ACE抑制活性，它們可用於預防和/或治療與凝乳酶_血管 緊張素系統、奎寧-激肽釋放酶系統等中的與ACE有關的疾病。與ACE有關的疾病包括高 血壓、動脈硬化、血管肥厚、心肌梗塞、心力衰竭、心臟肥大、腎機能不全、糖尿病等。本發明的活性成分表現出優異的安全性，因為其完全沒有毒性或具有極小毒性， 並且在將其以每天500mg的劑量對小鼠經口給藥時，發現根本沒有急性毒性。因此，當將其以食品或飲品形式使用時，在其用於預防、保健和飲食品的每種情況中，對於活性成分的使 用量都沒有限制，並且當將其用作藥物時，可根據每名患者而定在上述範圍內選擇性地使 用本發明的活性成分。例如，在經口攝取的情況中，本發明活性成分的使用量隨症狀、年齡、 體重、給藥方法、劑型等的不同而不同，但是通常，其以每名成人約0. Img到l，500mg的量給 藥，一天一次或一天數次將日劑量分開給用。另外，因為活性成分即使在大量攝取時也不表 現出特別的急性毒性，可任選地以超過上述範圍的較大量使用。
以下通過參考MAP作為本發明的肽的例子描述本發明肽的生產方法。也可同樣地 生產IRA、IQA、和包含這些肽作為部分肽的其它的肽。
1. MAP的製備方法
優選通過以下方法製備MAP。
在以下製備方法中，使用包含MAP作為其部分結構的底物和能夠從底物切斷MAP 的酶的組合。關於底物，優選使用酪蛋白，但是也可使用動植物性蛋白，如乳、乳由來成 分、全脂奶粉、脫脂奶粉、部分脫脂奶粉、酪蛋白、大豆蛋白、卵蛋白、肉蛋白、豆類或小麥、或 其水解物。β-酪蛋白富含脯氨酸，脯氨酸佔其序列的約17%。另外，因為在乳酪蛋白膠束 中包含33.6%的β-酪蛋白，可從中大量製備β-酪蛋白。
將底物溶解於水中，濃度為0. 1到70重量％，優選為0. 1到60重量％，更優選為 0.3到50重量％。向其中加入基於底物蛋白含量為0. 1到10重量％、優選0.3到2重量％ 的蛋白酶N「Amanc^G(由Amano Enzyme Inc.生產)，然後使用有機酸或無機酸如檸檬酸溶 液、乳酸、或鹽酸將其PH調節到4. 5到6. 0，優選4. 5到5. 0，隨後在15到50°C、優選在20 到400C、更優選在30到40°C下攪拌，從而引起降解。在降解40到50小時之後，向其中加入 基於底物蛋白含量分別為0.01到10重量％、優選0. 1到5重量％的每種Umamizyme G(由 Amano Enzyme Inc.生產)禾口 Flavourzyme (由 Novozymes Corporation 生產)，然後將其 PH調節到3. 5到5. 0，優選3. 5到4. 0。在攪拌下在15到50°C、優選20到40°C、更優選30 到40°C繼續降解5到10天。通過在50到110°C、優選60到100°C、更優選80到100°C熱 處理10到20分鐘使酶失活，然後將其pH調節到4. 5到6. 0，優選4. 5到5. 0。
2.確認MAP生成的方法
對於確認MAP生成的方法，通過LC-MS分析酶消解樣品的水溶性部分和MAP標準 樣品中的每一個，並且通過有或沒有與MAP標準樣品相同的MAP保留時間峰來判斷MAP的 生成。將上述1中製備的酶消解樣品在4°C和10，OOOg下離心40分鐘，回收水溶性部分並 進一步冷凍乾燥。將每個冷凍乾燥樣品再以100yg/ml的濃度溶解於以下流動相中，並注 射其5 μ 1部分。將MAP標準樣品以5 μ g/ml的濃度溶解於以下流動相中並注射其5 μ 1的 部分。當MAP標準樣品在以下分析條件下進行分析時，在約17分鐘的保留時間觀察到MAP 的峰。通過在相同分析條件下分析酶消解樣品的水溶性部分，在約17分鐘觀察到峰的樣品 被判斷為是「MAP-陽性的」，沒有觀察到該峰的樣品被判斷為是「MAP-陰性的」。
柱=CAPCELPAK C18 MG ( Φ 2. 0x250mm,由 SHISEID0 CO.，LTD.生產)
流動相包含0. 05%甲酸的4%乙腈溶液
流速0. 17ml/min
柱溫40°C
檢測器ESI(+)
分子量318
參考實施例進一步詳細地描述本發明，但是本發明不受其限制。
實施例1
將IOOg份的Denmark脫脂乳酪(用絞肉機粉碎)與50g的無菌水混合，然後加入 18g 的起動細菌(3 禾中，包括Lactococcus lactis subsp. Lactis、Lactococcus cremoris 禾口 Lactococcus diacetylactis)和0. 34g的氯化鈉，隨後進行攪拌。隨後向其中加入0. 6g的 蛋白酶N「AmanoT(由Amano Enzyme Inc.生產)，並將混合物在:34°C下振搖，從而進行降 解。四十八小時之後，用檸檬酸調節其PH到4. 1，並且向其中加入各自為0. 3g的Umamizyme G (由 Amano Enzyme Inc.生產)禾口 Flavourzyme (由 Novozymes Corporation 生產)，隨後 在34°C振搖，從而進行降解。六天之後，調節其pH到7. O並且隨後加入無菌水，使總量為 200g。通過在110°C加熱15分鐘使酶失活。通過離心除去不溶性物質，然後將肽通過HPLC 純化。使用 YMC-Pack R&D ODS 柱(由 YMC Corporation 生產，20x250mm)，通過從 0. 三 氟乙酸水溶液到含有0. 1 %三氟乙酸的70%乙腈水溶液的線性梯度進行洗脫(50min)(流 速7. 5ml/min，檢測波長:214歷，柱溫:40°C )。HPLC色譜圖如圖1中所示。將從27到31 分鐘洗脫下來的級分D分級，然後通過同樣的柱色譜法純化，從而分離具有Met-Ala-Pro、 Ile-His-Ala 和 Ile-Gln-Ala 序列的三月太。
實施例2
使用肽自動合成儀合成SEQ ID NO 1到7的每種肽。通過反相HPLC確認如此得 到的每種肽的純度為95%。將這些合成肽的每一種都溶解於0. IM硼酸鹽緩衝液(pH 8. 3) 中。隨後，與0. Iml的酶溶液(血管緊張素轉化酶2單位/ml)和0. (Mml的每種樣品溶液 混合，隨後加熱到37°C。向其中加入0. Iml份的底物溶液(馬尿醯基-His-LeiuN-苯甲醯 基-Gly-His-Leu)，隨後充分攪拌。在使混合物在37°C反應60分鐘之後，通過加入0. 13ml 的IN鹽酸終止反應。然後，向其中加入0.85ml的乙酸乙酯，隨後振搖1分鐘，然後將混合 物在3，OOOrpm下離心10分鐘。回收0.7 ml份的上清液，並使用離心蒸發器除去溶劑(約 30分鐘)。通過加入0. 5ml的蒸餾水將殘餘物溶解，並測量在228nm波長的吸光度。
通過以下數學式1計算ACE抑制活性(％ )。
數學式1
ACE 抑制活性(% ) = {(A-B) - (C-D)} / (A-B) xlOO
在這方面，數學式中的A為使用酶時對照的吸光度，B為沒有使用酶時對照的吸光 度，C為使用酶時樣品的吸光度，和D為沒有使用酶時樣品的吸光度。另外，在對照中使用 0. IM的硼酸鹽緩衝液代替樣品溶液。
根據如此得到的ACE抑制活性，計算每種肽的IC5(I。結果如以下表中所示。
表 權利要求
1.包括由SEQID NO :3表示的胺基酸序列的肽。
2.包括其中將一個或多個胺基酸加入到由SEQID NO :3表示的胺基酸序列中的氨基 酸序列並且具有血管緊張素轉化酶抑制活性的肽。
3.血管緊張素轉化酶抑制劑，其包括權利要求1或2的肽作為活性成分。
4.包括權利要求1或2的肽的食品或飲品。
5.包括權利要求1或2的肽作為活性成分的藥用組合物。
6.權利要求4的食品或飲品或權利要求5的藥用組合物，其為用於預防和/或治療由 血管緊張素轉化酶異常引起的疾病的藥劑。
7.權利要求1或2的肽在生產血管緊張素轉化酶抑制劑中的應用。
8.權利要求1或2的肽在生產用於預防和/或治療由血管緊張素轉化酶異常引起的疾 病的藥劑中的應用。
全文摘要
本發明涉及血管緊張素轉化酶抑制肽，和包含所述肽的食品和飲品和/或藥物。
文檔編號C07K5/11GK102030818SQ20101054747
公開日2011年4月27日 申請日期2004年12月1日 優先權日2003年12月1日
發明者內田勝幸, 小田宗宏, 殿內秀和, 鈴木匡之 申請人:明治乳業株式會社