約氏乳桿菌及其菌劑、應用和預混料的製作方法

2023-07-15 00:54:21 1

專利名稱：約氏乳桿菌及其菌劑、應用和預混料的製作方法
技術領域：
本發明屬於微生態製劑技術領域，具體涉及一種約氏乳桿菌及其菌劑、應用和預混料。
背景技術：
隨著人們對抗生素飼料添加劑帶來負面效應的意識不斷提高，飼料微生態製劑是作為一種新型的抗生素替代品，具有無毒副作用、無耐藥性、無殘留、效果顯著等諸多優點， 受到了養殖業的歡迎。複合活菌製劑作為微生態製劑的一種，已被廣泛應用於畜牧業養殖。其主要有兩種或兩種以上的不同益生菌菌屬組成，注重不同菌屬之間的互補性，總體上發揮正組合效應。將具有不同生物功能的益生菌組合成複合活菌製劑以達到維持胃腸道內環境穩定的目的，以助於飼料中各種營養成分消化率的提高。目前，通常應用的菌種主要是乳酸桿菌、芽孢桿菌以及酵母桿菌等，約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)是目前歐盟新被批准使用，在我國和美國尚待批准使用的飼用微生物菌種，國內外對其研究較少。約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)是普遍存在於人和動物腸道中的有益乳酸菌，可承受胃酸和膽汁的作用而到達小腸的上部並粘附於小腸壁，因而能夠有效地抑制腸道病源微生物的生長，從而用於預防和治療腹瀉，防治畜禽壞死性腸炎，調整腸道菌群平衡和調節機體免疫反應等，對人和動物無害，具有很好的市場前景。我國衛生部也於2003 年批准約氏乳桿菌作為保健食品益生菌種。嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)從動物腸道中分離得到，能分泌抗生物素類物質(嗜酸乳菌素、嗜酸桿菌素、乳酸菌素)對腸道致病菌產生拮抗作用，抑制腸道不良微生物的增殖，調整腸道菌群平衡。另外，短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)經發酵可產生乙酸、琥珀酸、蘋果酸和乳酸組成的有機酸。在飼餵過程中添加該菌株，可提高原料的利用率以及改善其適口性。約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌和短小芽孢桿菌聯合應用製備成微生態製劑或預混料， 國內外尚無報導。

發明內容
本發明的目的是提供一種約氏乳桿菌以及含有該菌株的菌劑。本發明的另一目的是提供該菌劑在製備飼料添加劑中的應用及包含該菌劑的預混料。本發明的目的是通過如下技術方案實現的本發明提供一種約氏乳桿菌(LactcAacillus johnsonii)，其保藏編號為CGMCC No.4926。本發明還提供了包含該約氏乳桿菌的菌劑。進一步，本發明的菌劑還包含嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus) CGMCC No. 5093、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756，菌劑中約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌的配比為約氏乳桿菌嗜酸乳桿菌短小芽孢桿菌= 1-10 1-10 1-10。更進一步，菌劑中約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌的配比為約氏乳桿菌 嗜酸乳桿菌短小芽孢桿菌=1 1 1。為保證菌劑中各種菌的活性，本發明的菌劑中還包含凍幹保護劑，每克菌劑中凍幹保護劑的添加量為125mL。其中，所述的凍幹保護劑的組成及含量如下250mL保護劑中蔴糖10g_15g，山梨醇10g-15g，脫脂奶粉13g-18g，蒸餾水加至250mL。本發明的菌劑可製備成飼料添加劑應用。本發明的菌劑添加到預混料可製備成含該菌劑的預混料，其中，預混料中菌劑添加的質量體積比是1-10%0。本發明所述的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)CGMCC No. 4擬6是申請人從北京豬大腸中篩選出來，經過胃酸、膽鹽的馴化和選育得到的，此株約氏乳桿菌抗逆性比較強，具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性。該菌株已在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏，保藏日期為2011年6月8日，地址北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，簡稱CGMCC，保藏號是CGMCC No. 4擬6。本發明的嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)為申請人從豬糞便中分離得到，其生物學特徵如下菌落圓整，表面光滑，不透明，乳白色，邊緣光滑，革蘭氏陽性菌；單個菌體為杆狀。本發明的嗜酸乳桿菌經過人工胃液、膽汁液及抗逆性的篩選；可以耐受pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液，可以耐受0.3%的人工膽汁液，也可以抑制致病性大腸桿菌K88，痢疾桿菌和金黃色葡萄球菌，具有較強的產酸和抑菌能力。本發明的嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)申請人已於2011年7月沈日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，簡稱CGMCC，地址同上，保藏編號為CGMCC No. 5093。本發明的短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)為申請人首次在國內分離到的一株來源於動物消化道的新的短小芽孢桿菌，為申請人從牛的瘤胃中分離得到的一株芽孢桿菌優勢菌株，經過生理生化及 16s RNA分析鑑定，表明該菌屬於短小芽孢桿菌，其分類命名為短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)，已於2011年4月8日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 地址同上,簡稱CGMCC，保藏編號為CGMCC No. 4756。本發明中的約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)CGMCC No. 4擬6容易在豬腸道內存活並發揮益生作用，其安全性亦有保證。此外該菌具有很強的胃酸耐受能力，同時具有一定的膽鹽耐受能力，對動物腸道常見致病菌大腸桿菌K88，K99和金黃色葡萄球菌有抑制作用，這些都符合微生態製劑的要求。另外，本發明中的嗜酸乳桿菌(LactcAacillus acidophilus)CGMCC No. 5093、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756亦為申請人從眾多菌株中篩選得到，具有很好的益生功能和抗逆性能。上述三種菌聯合使用製備成菌劑、製備成飼料添加劑及添加到預混料中，國內外尚無報導。本發明的含上述三種菌的活菌製劑作為飼料添加劑添加到飼料中，經飼養動物後，可顯著提高斷奶仔豬生產性能，降低仔豬腹瀉率，提高經濟效益。具有推廣應用前景，並且為尋找抗生素替代品提供了理論與實踐基礎。
具體實施例方式
通過下列實施例將更具體的說明本發明，但是應理解所述實施例僅是為了說明本
發明，而不是以任何方式限制本發明的範圍。 實施例1約氏乳桿菌CGMCC No. 4926抗逆性的驗證取約氏乳桿菌CGMCC No. 4擬6菌液ImL接種於IOmL MRS培養基中，37°C恆溫厭氧培養20h，然後取菌懸液3mL，12000rpm離心5min後，棄去上清，將菌體沉澱加入IOml pH2.0，l%胃蛋白酶的人工胃液中，37°C靜置池；12000rpm離心5min，棄去上清，將菌體沉澱加入IOml濃度為0. 3%的人工膽鹽中，37°C靜置池。振蕩混勻後，取菌懸液ImL用無菌生理鹽水梯度稀釋塗MRS培養基平板。37°C恆溫厭氧培養20h後，純化菌落。初篩得到的菌株再進行進一步復篩。(1)人工胃液的耐受性取約氏乳桿菌CGMCC No. 4926菌液ImL接種於IOmLMRS培養基中，37°C恆溫厭氧培養20h後，取ImL菌液用無菌生理鹽水梯度稀釋塗MRS培養基平板計活菌數。另外取ImL 上述菌液加入9mL人工胃液中，37°C靜置池，平板菌落計數法計殘存活菌數，殘存活菌率為 93. 7%。(2)人工膽鹽的耐受性取約氏乳桿菌CGMCC No. 4926菌液ImL接種於IOmL MRS培養基中，37°C恆溫厭氧培養20h後，取ImL菌液用無菌生理鹽水梯度稀釋塗MRS培養基平板計活菌數。取ImL上述菌液加入9mL人工膽鹽培養基中，37°C靜置池，平板菌落計數法計殘存活菌數，殘存活菌率為85. 7%。驗證性實驗表明本發明的約氏乳桿菌CGMCC No. 4926的抗逆性強，可以耐受人工胃液，人工膽鹽，因此在經過動物胃腸道環境後，還有大量活菌可以順利進入動物的腸道， 在腸道中存活，發揮益生功能。生理鹽水的配置方法是0. 85%的氯化鈉，高壓滅菌後備用。人工胃液的配製方法是胃蛋白酶，0.85%的氯化鈉，用HCl調pH值到2. 0，細菌過濾器過濾備用。人工膽鹽的配置方法是在液體肉湯中添加0. 3%的豬膽鹽(分析純)，高壓滅菌後備用。 實施例2約氏乳桿菌CGMCC No. 4926抑菌能力的驗證將LB固體培養基融化，冷卻至45°C。加入過夜培養的E. coli K88、K99和金黃色葡萄球菌(每毫升培養基加入1微升菌液)，震蕩混勻，倒入無菌平板，水平凝固，在每個瓊脂平板上輕輕放置4隻牛津杯，其間距應相等。每隻牛津杯中加入50 μ L約氏乳桿菌菌液， 蓋好皿蓋，小心移至37°C培養箱，平皿正放靜置培養。培養20h後，打開皿蓋，移去牛津杯， 用卡尺測量抑菌圈直徑(結果見表1)。表1抑菌圈的測定
權利要求
1.一種約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)，其保藏編號為 CGMCC No. 4926。
2.一種含有權1所述的約氏乳桿菌的菌劑。
3.權2所述的菌劑，其特徵在於還包含嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus) CGMCC No. 5093、短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)CGMCC No. 4756，菌劑中約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌的配比如下約氏乳桿菌嗜酸乳桿菌短小芽孢桿菌= 1-10 1-10 1-10。
4.權3所述的菌劑，其特徵在於菌劑中約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌的配比為約氏乳桿菌嗜酸乳桿菌短小芽孢桿菌=1:1:1。
5.權2所述的菌劑，其特徵在於還包含凍幹保護劑，每克菌劑中凍幹保護劑的添加量為 125mL0
6.權5所述的菌劑，其特徵在於所述的凍幹保護劑的組成及含量如下250mL保護劑中蔗糖10g_15g，山梨醇10g-15g，脫脂奶粉13g-18g，蒸餾水加至250mL。
7.權2所述的菌劑在製備飼料添加劑中的應用。
8.一種包含權2所述的菌劑的預混料，其特徵在於預混料中菌劑添加的質量體積比是 1-10%0。
全文摘要
本發明屬於微生態製劑技術領域，具體涉及一種約氏乳桿菌及其菌劑、應用和預混料。本發明中的約氏乳桿菌、嗜酸乳桿菌、短小芽孢桿菌具有很好的益生功能和抗逆性能，將上述三種菌聯合使用製備成菌劑、製備成飼料添加劑及添加到預混料中，經飼養動物後，可顯著提高斷奶仔豬生產性能，降低仔豬腹瀉率，提高經濟效益。具有推廣應用前景，並且為尋找抗生素替代品提供了理論與實踐基礎。
文檔編號C12R1/07GK102399733SQ20111041641
公開日2012年4月4日 申請日期2011年12月14日 優先權日2011年12月14日
發明者劉婷, 劉瀅, 胡婷, 趙莉莉 申請人:北京大北農科技集團股份有限公司, 哈爾濱大北農牧業科技有限公司, 漳州大北農農牧科技有限公司