二苯乙烯苷衍生物的製作方法
2023-07-14 16:47:46
專利名稱：二苯乙烯苷衍生物的製作方法
技術領域：
本發明屬於醫藥技術領域，涉及何首烏中有效單體2，3，5,4'-四羥基二苯乙烯 -2-CH3-D-葡萄糖苷的分離純化工藝；還涉及2，3,5，4'-四羥基二苯乙烯-2-0-|3-0-葡萄糖苷的晶體及其製備方法，以及以其為主要成分的藥物組合物。
背景技術：
何首烏為蓼科植物何首烏(pllygonummultiflorumThunb.)的塊根，為常用中藥，藥用歷史悠久，國內外的大量研究結果表明何首烏具有免疫調節，保肝，抗氧化，抗腫瘤、降血脂等多方面藥理活性。隨著研究的深入，對其化學成分的研究也越來越清晰，大量研究表明，何首烏中的起主要作用的是2，3，5,4'-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷(以下簡稱二苯乙烯苷)。二苯乙烯苷的生 理活性主要有抗衰老作用、降血脂作用、保肝護肝作用、改善記憶功能、抗 腫瘤作用等(參見魯堅、侯雙秋等，二苯乙烯苷的研究進展，安徽化工，2006(3)， 10~13)。中國專利ZL01134284.6中公開了二苯乙烯苷在治療痴呆症中的應用。 中國專利申請CN01134283.8中公開了二苯乙烯苷在治療缺血性腦血管疾病中的 應用。隨著二苯乙烯苷的藥用功效不斷被發現，工業上希望獲得大量的適合藥用 的二苯乙烯苷原料，所述適合藥用的二苯乙烯苷原料至少應該具備較高的純度 和製備製劑所要求的物理性質。但由於工藝水平的限制，高純度二苯乙烯苷的 分離純化仍然一直處在實驗室極少量製備的水平，未見有適合工業化生產規模 的高純度二苯乙烯苷製備工藝的報導，因此，開展適合藥用的二苯乙烯苷的分 離純化工藝研究具有重要意義。目前，現有技術中主要採用高效液相色譜法、結晶法、樹脂柱等方法來制 備高純度的二苯乙烯苷。高效液相色譜法雖然能夠得到純度極高的二苯乙烯苷，但其純化效率難以 提高，純化成本也相對較高，因而此法主要用於實驗室製備，難以應用於工業 化生產。班翊等人公開了一種結晶精製二苯乙烯苷的方法(參見班翊、劉其禮、金悠等，二苯乙烯苷的穩定性研究，中草藥，2004， 35(11)， 1235~1237)。該方法 利用乙醇回流法所得的何首烏浸膏，用適量蒸餾水稀釋後以等量乙醚萃取3次， 分離出水層；水層用兩倍體積的醋酸乙酯熱回流5 6小時，收集醋酸乙酯層， 減壓濃縮至原體積的1/10，室溫靜置，析晶，濾過，得粗品。粗品於適量熱水 或熱醋酸乙酯中溶解，趁熱濾過，放冷析晶，如此反覆結晶，得灰色無定型結 晶粉末，mp.l62 163'C，經分析，二苯乙烯苷純度為99.94%。此法雖能夠得到 純度很高的二苯乙烯苷產品，但需反覆多次結晶，工藝繁瑣，有機溶劑消耗量 大，資源利用率低，而且要用到乙醚等易燃易爆的試劑，不適合工業化生產。另一些文獻公開了採用大孔吸附樹脂分離純化二苯乙烯苷的方法(參見朱 海升等，大孔吸附樹脂分離純化何首烏有效成分二苯乙烯苷的研究，解放軍藥 學學報，2006， 22(4)， 269 273和呂麗爽等，大孔樹脂純化何首烏中二苯乙烯苷 的工藝研究，食品科學，2005， 6(26)， 178-181)。這些文獻也都是基於實驗室 研究所進行的基礎研究，所用的樹脂量一般也只有幾克，和工業化生產工藝還 無法相比，而且製得的二苯乙烯苷純度也遠未達到單體的質量要求。另外，中國專利ZL98120290.X公開了一種製備二苯乙烯苷的方法，該方法 將用於分離純化的層析柱進行破壞性切割，再進行取樣分離，過程煩瑣，成本 極高，也是典型的實驗室製備微量樣品的方法，無法達到工業化生產的要求。本發明提供了一種二苯乙烯苷的提取分離方法，此法操作簡便，成本低廉， 收率穩定，完全能夠滿足工業化生產規模的需求，製得的二苯乙烯苷純度在保 證低成本和高收慮的同時，能獲得高純度的二苯乙烯苷結晶，達到了工業化生 產的要求。此外本發明還提供一種新物理形態的二苯乙烯苷，以及含有該形態 的藥物組合物，新的物理形態具有更適宜製備製劑的物理性質。發明內容本發明的目的在於提供一種提取分離結構如式l的化合物的方法，所述的 提取分離方法如下式Ia) 提取取何首烏藥材，酌於碎斷，加入一定量的水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上溶劑組成的混合溶劑，調節提取液的pH至7.0-8.0，加熱提取1 4次， 每次1 3小時，加熱溫度為4(TC 回流溫度，合併提取液，放冷，過濾。其中提 取溶劑優選水；調節提取液pH值的可以是酸、鹼或鹽，優選氫氧化鈉、亞硫酸 鈉、亞硫酸氫鈉、碳酸鈉，最優選為亞硫酸鈉；提取液的pH值優選為7.5;加 熱提取優選提取3次，每次1.5小時。b) 分離將上述提取液過大孔樹脂柱，加水充分洗脫去除提取液中的無機鹽及 其它雜質後，改用一定濃度的有機溶劑洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液。大 孔樹脂的型號可以為HPD-400、 HPD-IOO、 AB-8、 D1300，優選的大孔樹脂型號 為HPD-400;洗脫溶劑可以為乙醇、甲醇或丙酮，優選為乙醇，更優選濃度為 70°%的乙醇。c) 萃取將洗脫液在60 80'C下減壓濃縮至原洗脫液體積的1/10^1/30 (V/V)， 如濃縮液體積較小可以加入適量的水，加入濃縮液體積1 2倍的石油醚、乙醚、 氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取24次，收集有機層萃取液，將有機層萃取液減 壓濃縮至幹，得到固體粗提物；優選將洗脫液濃縮至原體積的1/20。萃取所用 的有機溶劑優選乙酸乙酯；優選用濃縮液體積的1倍的有機溶劑萃取3次。d) 純化上述粗提物溶於適量的有機溶劑，過層析柱，選用適當溶劑進行洗脫， 收集含二苯乙烯苷成份的洗脫液，濃縮，乾燥，得二苯乙烯苷粗品。層析柱的 填料可以為矽膠或氧化鋁，優選氧化鋁；目數是100-200目或200-300目，優選 為200-300目；柱層析前溶解粗提物所用溶劑可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，優 選為乙醇；柱層析過程中所用洗脫液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯 仿中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑，優選為乙酸乙酯。e) 結晶將上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種 或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱溶解，優選的結晶溶劑為丙酮水乙酸乙 酯的混合溶劑，其比例為1~10: 5~20: 1 10 (V:V:V)，最優選丙酮水乙酸 乙酯為2:10: l(V:V:V)，結晶溶劑的用量是為二苯乙烯苷粗品的1 10倍(V/W)， 優選的溶劑用量為二苯乙烯苷粗品的5倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析 晶，結晶溫度為-20 10。C，優選為-10 5。C，最佳溫度為-4。C，過濾，乾燥，即 得到高純度的二苯乙烯苷。本發明的二苯乙烯苷提取物以高效液相色譜法檢測其純度可達到90%以 上，優選在95%以上，最優選985^以上。本發明中二苯乙烯苷的含量測定採用高效液相色譜(HPLC)法進行。其中 使用的2,3，5,4，-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷對照品購於中國藥品生物制 品檢定所；使用的流動相為乙腈水=15: 85;檢測器為JASW UV-1575;流 速為lmL/min;色譜柱採用Agilent Extend C-18 (4.6mmx250mm，5Mm);柱溫為 30'C，具體測試方法如下 1.標準曲線的建立精密稱取2，3，5，4，-四羥基二苯乙烯-2-0-P-D-葡萄糖苷對照品5.15 mg，用水 溶解並定容至100 ml，配成對照品儲備液，分別取儲備液1 ml， 2 ml， 4 ml， 6 ml， 8 ml，各自加水定容至10ml，分別取上述各濃度的對照品溶液20nJ,依次注入 色譜儀，得到表一所示的峰面積數據，由此製得表二所示的二苯乙烯苷標準曲 線，可見進樣量與峰面積間呈良好的線性關係。線性範圍5 50|xg/ml 回歸方程為Y=80909X+19722 相關係數R-0.9992表一 二苯乙烯苷標準品濃度與峰面積數據濃度(嗎/ml)5.1510.3020.6030.卯41.20峰面積(mv/s)4157978881281706896244592233921922. 二苯乙烯苷樣品的含量測定方法準確稱取二苯乙烯苷對照品(簡稱對照品)和自製的二苯乙烯苷樣品(簡 稱供試品)各20.00mg,分別用水溶解，並定容至100ml，各取1 ml加水稀釋 定容至10ml，得到對照品溶液和供試品溶液。分別吸取上述兩種溶液各20^1 依次注入色譜儀，記錄峰面積，運用外標法計算，得到供試品中二苯乙烯苷的 含量。本發明的二苯乙烯苷和二苯乙烯苷對照品(購於中國藥品生物製品檢定所) 的高效液相色譜圖如附圖5和附圖6所示。本發明的另一個目的在於提供二苯乙烯苷的新型晶體及其製備方法，本發明的再一個目的在於提供含有所述的二苯乙烯苷晶體的藥物組合物。本發明的二苯乙烯苷晶體基本不含水和其它有機溶劑，其X-射線粉末衍射 光譜圖(該圖譜是在X、TRA-X射線衍射儀上用Cu-Ka輻射測量)，在d值為 4.772、 4.471、 3.678、處有衍射峰，典型的在14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622處有衍射峰，更典型的在14.572、 12.200、 7.320、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622、 3.343、 2.384處有衍射峰。本發明的二苯乙烯苷晶體的差示掃描量熱分析(採用NETZSCHDSC 204 Fl 儀器)，以10K/分鐘的速率升溫，其吸收熱轉變峰值約為178°C。本發明的二苯乙烯苷晶體用KBr壓片測定的紅外吸收光譜在3333cm—1 (寬 峰)、1607cm—、 1593cm"、 1515cm"處有吸收峰。本發明的二苯乙烯苷晶體的熱失重分析圖譜如附圖4所示。本發明的二苯乙烯苷晶體可由如下方法製備將二苯乙烯苷粗品或純品在 丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱 溶解，優選的結晶溶劑為丙酮水乙酸乙酯的混合溶劑，其比例為1 10: 5 20:1 10 (V:V:V),最優選丙酮水:乙酸乙酯為2: 10: 1 (V:V:V)，結晶溶劑的 用量是為二苯乙烯苷粗品的1 10倍(v/w)，優選的溶劑用量為二苯乙烯苷粗 品的5倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析晶，結晶溫度為-2(Kl(TC,優選 為-10~5匸，最佳溫度為-4t:，過濾，乾燥，即得到高純度的二苯乙烯苷結晶。根據上述步驟製得的二苯乙烯苷晶體，還可以與適當的藥用輔料混合，制 成一定形式的組合物，包括片劑、膠囊、滴丸、軟膠囊、注射液或其它適於施 用的製劑形式，以方便臨床上施用。本發明提供了一種含量高、成分明確、質量可控、藥效確切、副作用小的 新型二苯乙烯苷結晶及其製備方法，二苯乙烯苷結晶不同於無定型的二苯乙烯 苷，其更穩定，同時溶解度和生物利用度都不同，其中二苯乙烯苷結晶更容易 製備成藥劑。所以本發明包括了含有高純度二苯乙烯苷結晶的藥物組合物，該 藥物組合物在治療高血脂症、動脈粥樣硬化、抗氧化等效果明顯。本發明的制 備工藝已經通過多批生產驗證，證明其重複性、穩定性都好，並且總收率高， 只需一步結晶，既適合於工業化大生產又降低了生產的成本。本發明所提供的 方法製備的二苯乙烯苷純度高，雜質少，不但改善了中成藥常有的服用劑量大、 成分不明確等缺點，而且其在臨床上藥效顯著，具有很好的適用性。
圖l 二苯乙烯苷晶體的x射線粉末衍射光譜圖。圖2 二苯乙烯苷晶體的差示掃描量熱分析(DSC)圖譜。 圖3 二苯乙烯苷晶體的紅外吸收圖譜。 圖4 二苯乙烯苷晶體的熱失重分析(TGA)圖譜。 圖5 二苯乙烯苷晶體的高效液相色譜圖。圖6 二苯乙烯苷對照品的高效液相色譜圖。 圖7 二苯乙烯苷標準曲線
具體實施例方式以下非限制性實施例是為了更好地說明本發明所提供的新型高純度二苯乙 烯苷晶體的製備方法，並不意味著對本發明的任何限制。下列實施例中，所用的提取用水為自來水；所用乙醇為藥用級；何首烏藥 材產地為安徽亳州中藥材市場；矽膠和氧化鋁均購自青島海洋化工有限公司。 實施例l取乾燥的何首烏藥材100kg，切成l-3mm的薄片，裝入熱回流提取罐，加 入10倍量的水及亞硫酸鈉適量，調節提取液pH至7.6，加熱回流提取3次，每 次1小時，合併提取液，過濾，收集濾液。濾液過HPD-400大孔吸附樹脂柱， 加水500L洗脫後，加80%乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計200L， 於6(TC減壓濃縮至IOL，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量IOL， 60。C減壓濃縮 乙酸乙酯液至幹，得二苯乙烯苷粗提物2.5kg。取上述粗提物，加入乙醇5.0L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾，濾液過 200-300目中性氧化鋁層析柱，上柱完成後改用乙酸乙酯洗脫，薄層監測，收集 含二苯乙烯苷組分的洗脫液，於5(TC減壓濃縮至幹，得到二苯乙烯苷粗品1.82kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(2: 10: 1， V/V/V) 9L, 60。C力口 熱至溶解，加入適量活性炭後，加熱回流15分鐘，趁熱過濾，濾液置-5'C條件 下靜置15小時，析晶充分後，過濾，乾燥，得到白色二苯乙烯苷結晶1.28化8。 取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量為90.3%， 二苯乙烯苷結晶的含量為98.9%。實施例2取乾燥的何首烏藥材100kg，粉碎成粗粉，裝入熱回流提取罐，加入8倍量的水及亞硫酸氫鈉適量，調節提取液pH至7.5，加熱回流提取2次，每次2 小時，合併提取液，過濾，收集濾液。濾液過HPD-100大孔吸附樹脂柱，加水 600L洗脫後，加70°/。乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計300L，於 70'C減壓濃縮至15L，加入正丁醇萃取2次，每次用量15L， 8(TC減壓濃縮，濃 縮正丁醇至幹，得二苯乙烯苷粗提物2.3kg。取上述粗提物，加入乙酸乙酯8.0L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾，濾液 過200-300目矽膠層析柱，上柱完成後改用乙酸乙酯丙酮(2: 1)洗脫，薄層 監測，收集含二苯乙烯苷組分的洗脫液，於6(TC減壓濃縮至幹，得到二苯乙烯 苷粗品1.60 kg。取上述粗品，加入水乙酸乙酯(20: 1， V/V) 8L， 6(TC加熱至溶解，加 入適量活性炭後，加熱回流5分鐘，趁熱過濾，濾液置-l(TC條件下靜置10小時， 析晶充分後，過濾，乾燥，得到白色二苯乙烯苷結晶1.28kg，結晶為針狀，聚 集成簇。取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量 為91.1%， 二苯乙烯苷結晶的含量為99.6%。實施例3取乾燥的何首烏藥材120kg，粉碎成粗粉，裝入熱回流提取罐，加入7倍 量的水及碳酸鈉適量，調節提取液pH至7.8，加熱回流提取3次，每次1.5小 時，合併提取液，過濾，收集濾液。濾液過AB-8大孔吸附樹脂柱，加水600L 洗脫後，加90%乙醇洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，總計320L，於70。C減 壓濃縮至20L，加入乙酸乙酯萃取3次，每次用量20L， 80。C減壓濃縮，濃縮乙 酸乙酯至幹，得二苯乙烯苷粗提物2.92kg。取上述粗提物，加入丙酮12 L，加熱攪拌使其充分溶解，過濾,濾液過200-300 目中性氧化鋁柱，上柱完成後改用乙酸乙酯洗脫，薄層監測，收集含二苯乙烯 苷組分的洗脫液，於5(TC減壓濃縮至幹，得到二苯乙烯苷粗品1.9kg。取上述粗品，加入丙酮水乙酸乙酯(1: 10: 1， V/V/V) IOL， 50 。C加熱至溶解，加入適量活性炭後，加熱回流10分鐘，趁熱過濾，濾液置-(C條件下靜置20小時，析晶充分後，過濾，乾燥，得到白色二苯乙烯苷結晶1.51kg，結晶為針狀，聚集成簇。取上述樣品，用高效液相色譜法進行含量測定，二苯乙烯苷粗品含量為92.8%, 二苯乙烯苷結晶的含量為99.9%。
權利要求
1. top= "38" left = "68"/>a.取何首烏藥材，酌於碎斷，加入水、甲醇、乙醇中的一種或一種以上溶劑組成的混合溶劑，調節提取液的pH至7.0～8.0，加熱提取，放冷，過濾；b.將上述提取液過大孔樹脂柱，加水洗脫後，改用有機溶劑洗脫，收集含二苯乙烯苷的洗脫液，大孔樹脂的型號可以為HPD-400、HPD-100、AB-8、D1300，洗脫溶劑可以為乙醇、甲醇或丙酮；c.將洗脫液減壓濃縮，加入石油醚、乙醚、氯仿、乙酸乙酯或正丁醇萃取，收集有機層萃取液，將有機層萃取液減壓濃縮至幹，得到固體粗提物；d.上述粗提物溶於有機溶劑，過層析柱，收集含二苯乙烯苷成份的洗脫液，濃縮，乾燥，得二苯乙烯苷粗品，層析柱的填料可以為矽膠或氧化鋁，目數是100-200目或200-300目，柱層析前溶解粗提物所用溶劑可以是丙酮、乙醇、乙酸乙酯，柱層析過程中所用洗脫液可以是丙酮、乙酸乙酯、乙醇、甲醇或氯仿中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑；e.將上述二苯乙烯苷粗品在丙酮、水、甲醇、乙醇、乙酸乙酯中的一種或幾種溶劑組成的混合溶劑中加熱溶解，結晶溶劑的用量是為二苯乙烯苷粗品的1～10倍(V/W)，活性炭脫色，過濾，靜置析晶，結晶溫度為-20～10℃，過濾，乾燥，即得二苯乙烯苷。
2. 權利要求
3. 權利要求
4. 權利要求
5. 權利要求
6. 權利要求
7. 權利要求步驟a中，提取溶劑為水。步驟b中，大孔樹脂型號為HPD-400。步驟b中，洗脫溶劑為乙醇。步驟c中，萃取所用的有機溶劑是乙酸乙酯。步驟d中，層析柱的填料為氧化鋁。步驟d中，柱層析過程中所用洗脫液為乙酸乙酯,
8. 權利要求l步驟e中，結晶溶劑為丙酮水乙酸乙酯為1 10: 5~20: 1~10的混合溶劑，溶劑用量為二苯乙烯苷粗品的5倍。
9. 一種基本不含水和其它有機溶劑的二苯乙烯苷晶體，其特徵在於其X-射線 粉末衍射光譜圖在d值為4.772、 4.471、 3.678、處有衍射峰。
10. 權利要求9所述的二苯乙烯苷晶體，其X-射線粉末衍射光譜圖在d值為 14.572、 12.200、 4.772、 4.471、 3.678、 3.622處有衍射峰。
11. 權利要求9所述的二苯乙烯苷晶體，以10K/分鐘的速率升溫，其差示掃描量 熱吸收熱轉變峰值約為178'C。
12. —種藥物組合物，其特徵在於，含有權利要求9、 lO或ll所述的二苯乙烯苷晶體(
全文摘要
本發明涉及一種新型2，3，5，4』-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷晶體及其製備方法，以及含有該晶體的藥物組合物。高效液相色譜法測定所述晶體的含量為90～99.9％，所述方法是通過何首烏提取、有機溶劑萃取、柱層析分離及適當溶劑中結晶等步驟，得到所述高純度的二苯乙烯苷晶體。本發明提供的製備工藝得率高，成本低，適合工業化生產。
文檔編號A61K125/00GK101255180SQ20071002044
公開日2008年9月3日 申請日期2007年2月27日 優先權日2007年2月27日
發明者楊永安, 鴦 王 申請人:江蘇正大天晴藥業股份有限公司