鴨瘟皰疹病毒轉移載體及其製備方法

2023-07-28 22:57:36 1

專利名稱：鴨瘟皰疹病毒轉移載體及其製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種基因工程製品的製備方法，具體地說是一種鴨瘟皰疹病毒轉移載體以及它的製備方法。
背景技術：
在我國，鴨、鵝是重要的經濟禽類。近幾年來，養鴨、養鵝在我國的某些地區發展迅速，將成為繼養雞業後第二個實現資源配置和利潤合理化的產業。目前，傳染病仍然是危害鴨、鵝養殖業健康、持續發展的重要因素之一，加強對鴨、鵝傳染病的防治顯得尤為重要。鴨瘟是由鴨瘟皰疹病毒引起的鴨、鵝的急性、敗血性傳染病，以成年鴨、鵝常見，發病率、死亡率高，在我國被列入動物二類傳染病。目前國內外防治鴨、鵝傳染病仍使用傳統的疫苗進行預防接種，與其它疾病的防治手段相比，相對落後。
隨著DNA重組技術的發展和利用，基因工程疫苗的研究取得了快速發展，其中重組病毒活載體疫苗成為當前新型疫苗的研究熱點。重組病毒活載體疫苗是以病毒作為載體，在真核細胞中表達外源基因，它在病毒病的防治等方面展現了廣闊的前景，其中以皰疹病毒作為病毒載體的研究近年來十分活躍。與傳統疫苗相比，重組病毒活載體疫苗具有使用安全、免疫力持久、接近動物自然感染的方式，多價苗還可以達到一針預防多病的目的。

發明內容本發明的目的在於提供一種鴨瘟皰疹病毒轉移載體及其製備方法。
本發明的產品是是利用兼併PCR克隆鴨瘟皰疹病毒UL24、TK和gH基因，在獲得以上3個基因序列的基礎上，利用PCR克隆鴨瘟皰疹病毒TK基因及其側翼共2.9kb的DNA序列，將其亞克隆入克隆載體pUC18，構建重組質粒pUC-TK2.9，將lacZ基因表達盒插入載體pUC-TK2.9中的TK基因內，構建成的鴨瘟皰疹病毒重組轉移載體pUC-TK2.9-lacZ。
本發明產品中的(1)鴨瘟皰疹病毒TK基因及其側翼序列的大小為8481個鹼基，即8481bp，包含鴨瘟皰疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鴨瘟皰疹病毒UL24基因大小為1230bp，編碼409個胺基酸；TK基因大小為1077bp，編碼358個胺基酸；gH基因大小為2505bp，編碼834個胺基酸。
本發明產品的核酸序列為
AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTACAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCTGGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGTGCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCAGCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTTTTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATGGTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGACATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGCGTAGCTGAGTTATATCCTCCATAAGAAATAGAGGTTGGGCTCTCCCAAATACGGCCCCGGCAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCATCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGAACACAATGACCAGAAAGGGCAATTCGTTCCCCACTTCTGGGTTGGATGGCAAACTGACCCTTAGGTAATCTATCCATATCAAACCTATAACACAAGCGACCGCAATCGGAGGCGAGACGTTCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGTAGTTAAATGGTTGGCATTTAGTCTTGGCAGATGTAATCCTGTGATGTAGCTGTAGGCATAATATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGTAGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACCGTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTACCGAATAATACACCCCAACCAGAAGCCGAAGAGCCACCACGTGTTGAATAAATAATAGTTAACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTACTTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTCGGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAGCAGCATTCTCCAAATCTGCGATTACTGCTGTTACAGATTTTACTTGCTCTTCTATAGGTTTTAAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCGCCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCATGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCCTAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAAAGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAATCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACTCGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGCGTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATACTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCATGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGTATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAATAGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAACTCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATTTTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCGACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATATACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAATAGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCGGAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACTGCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCAGTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGTTCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGCAATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTTAAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCCACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCAGCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTCTTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCGCTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGCGCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTATGGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTTTATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTATACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAATTACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGACGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATCGGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAGCCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATAGTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCTGGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTA
ATACAATTTGGTATGCCAAACAAGCACCAATAATGTGGGACTGTGATAAATGGGACAAAGATTGGAGCTCGGTCCCAATATTTGATGACGATAGAAAGAAAATGTTAGAAGCGCGTGATTCAGTGCCTATTGTTGGTGGGAAAGAACGGCCAAGTCCATCAACGACTCTCTTGTCACTGTTCAAAGTACCTGAACTATGTGACGAATCATTTAGACTGCGTAAAGTCCATGAATGGAATCTGAGATGCGCATTAATTAAGTTGGCGGATTTGAATGCATATTTTATGGACATAAGTGGCAAGAGCCCCCAAGAGTGTGCCGCTGAAGTACGAGAGGCAACTAACGCGATGGACTTTACGCGCCTATCTTTTACCATGGCCGAGGATCTGGAACAAGCTGTTAACCAATACAATACCGAGATGACAATTAATTGATAAATATATTTGTTTTAAATAAAGCTCTGATGGGCGGTTCTGAAACTATGACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATTTGTTTTACTGTTTGGAGACAGTTAGTATATGTTCACGCGAGAATATAATGCGCCATTCCGCCGAGAGGACCTAGGCGAGCTTTCTGGGACCTCACCGCGGAGCTAGTTTTCTCTACGCGGCCGCGGTTCTGTCCCAGGTAAAGCTAACCGGCCAACTTTAGAATGTCGCAGCTTACGGTGCTAATATATACAGTCATAGTTTTTGAGGTTGTAAGTGCGGCGTGGATAGGTGTCGGGGAAGAAGATATGAGTTTAAACTTTACTCATCACGTTATATCGCCAGATGTTCTTCGCCATGCCTTTACAGGAATAGTAACGGACAGTGGACCAACTGGGCGTAGCACATCTACAATTCATGTATCGTCGGTTCTCGGCGCGCCGTACGGAATAAATTCCACCGATCTGAGTAATCTAAAATGGATACATGCAACCACAATATTCTTCTTCGTTACCAACCCCAAAGGAACGAAGTTTACAGGTACTTTGCTATTCGTACCTAGAGAAGCGGGCATAAAATTCAGATCAATTGACTATCCTGACAGCGTTATGCTTGCGTCGCCCAATTTTGCACGTTCTCTAGCATGTTCTGCAACGCCGGATAATTTATCAGAATATGGAAAGATAAAACTTAAAGAACACGTCGACGATATAAAACATGTACGTCCTGTTCGGCCCAAGCCCAGTGGCTCAAATCCTCCAAAGGACATTGCTAAAATTTCATTTTCTGACATACTCCGTCCTTCCGAAGCATTTTTTGATCCCAAAACGCTCCTACCATCAGCACTGGAAATCACACGCTTCGTGGATCCACTGGCCTCAGTTTGGCCAGTAGACTATTATAAGACGGCGGAATTACGTTTTGGAACTGATCGCGCGGAAGCTGTGGCCAATATTGGAGACACCTTTATGACATTGACCCTCTCGATGGCCAGTTCGCGCCCAATTGAAATTCTAATAGCGCATACTCGTTCTCCAATGTTTATGATATGGCCTCGTTTCGATACAGTATTCGAACCGCCACATCTCAGCATAAGCGACAAATTCAAAACATACATATTGGCAAGTTTCAAAAATTCTGCCGATAACGAATTTCGAGACATGACAGAACTTGGAGCCATTACAGCAGAAGTGTTGGAGCCACAGAACCATATATCAGAAGGACATCTACAACTTCTATTAATGTTATCCAATGCACAAGAAGAAGACGATGTTTATTTCTGGAGACGAATCGTTACACGTGTTGCTTTGATTGCATTTTCTTTCATAACTGAATCAAGTTCTTCCAAGTTTACAAGTCTGGAGGACTACATAGCAACGGACTTAAATACACGCTTCCTTGCAACCGCTGTGTGTAAAACTGCATTAACTGGAGACCCTGATACATTTTTTATGCGAACTGGATTAACATTATCCGAGAAGGCTACCAGTATATTAACTACACGGGTCATAGAATTGGTAGACGACATACATCGTAAGAGTGATTATGGCAAGCGCGAACCACTAGAAGAAGTACTAAATGTACTGCGCCTTGGGTATGGTCTGGCCGGCGATAAACGCCTAGACTCTGCACTAGATAAGCTCTCAACATCACTTATAAGTAACTTATATTCCGACATCGTAATGCTGCACATGGGATGGAACGTAACAGCCAAACACACGTTGTTTTTTGCAACTGAGTCCACGCTCGGCAGCTCCGTCCCTAGCATGGTGAGGGCTCGTTTTGTACTTCTGCTACTAACATCAATGTGTACTGATATACATGCGGCCTCTATAAATGTAAACCTGCAAGAAATATTCATTAGCGTTACTGATCGCGGCAATGATTTCAGTATGCTGGACCTATTTTCTCCATGTGCCACAGCATTGCGATACGACACACATGAAGGAATACATAAACTATACGTGCTTAGTTCAATTCCTGATAGGTTACGCCTCGTCGCGGCTCTAAAATCAGACAAAGATGGAGGAATACATAAAGAAGATAACCTAAATATGCGTGCTGAGAGGACTATAGGACGCTGGAGGAATCAGGACATAACTGCGATAAAACACTTCCTTCCCGAATTATTTGACTGTGGAGAAAGGTTAAATCTGTCGCCAGATAATGGCCTTGTTATGTTGCTGCCATTGACCCCCAACGGCACTTTTATTATTTCCAGACATTTCCTAGACGTCGGTGTAACATATCGCATTCTAGGCGTAGATGTTAACAACCCTTTATATATAACATTTAAACATGCCGGGTGTTCGTCCTCTAGTTCCAATATTGCGTCAGTACAACTTCCGCGACCAGGAACAAATACAGAGTGTCTGTACTGTGGGTGTGTAATCATGCGTTATACATCCACCGGAGCGGTTTTGTATTCTGTATATATAGCCGATCTGGCCATGCAGCGCGAATTTATGGCCGGGATAAATTCTTCCACTCCATTTTTCAATCCTGCATCATTTGGGGGTGCAGAATCATTACTATTATTTCCTAACGGAACAATAGTTAACATACTTGCCTTCGAACAAAAAATTGAGTATGTCATACCGGGCACGTATATCGCGATAGCGGTTGGGGGTATGGCTGTTGCCGTACTTGTCTTTTATGGGATAATTAAACTGATGTGTAATCTAATTAGAAATGGGGACTTAAAAGAACTGTTAAGCAATGAAGAATGATTTTATAACTCAATGCAGTCTGTTAAACCAATTTATTGTTCCTTTAAATAAATTATTAAACAGTATATAATTTTGCGTAATTTCATAACCAAAAGGATTTCGGTTAATCTAATACATATTGCCCTTCGACCCATCATATACGTCCACATTGCCTCAAGTGTTTGCGTCATTGAAACACACAGACTATCATTAATTATGACCAATTTCAGTAAACTATTCAAATATATGATCCCGTATACATAACTGATATATTAGAATCTTTACTGATATAAATACTAAAACACATTACCCTAATAGACCGGCGTTTTTTAAGCGGCGATCAATTAACGCGCCAAGTGTCAAAACACCCTTTTGAATATCACATTTTTCATCAAATATTGACGAGCACATCGCGTCAATTGTAGCGTTTAATATATACGAGTTCCCAAAACATC
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採用本發明的方法生產的產品可用於①本產品可用來構建鴨瘟皰疹病毒基因缺失疫苗。
②本產品可用來構建重組活載體疫苗。
本發明的產品優點表現在①所克隆用於構建轉移載體的TK基因及其側翼序列目前在國內外尚未見報導。
②構建的轉移載體為構建重組鴨瘟皰疹病毒搭建一物質平臺。
③應用此轉移載體可以構建多種重組活載體疫苗，預防鴨鵝等相關禽類的多種傳染病。
(四)具體實施方案上述已對本發明的產品作了具體地描述，本發明的產品可以採用這樣的方法來製備1)設計擴增UL24、TK和gH基因的引物根據鴨瘟皰疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，設計兼併引物。
位於TK基因內的兼併引物DP1和DP2DP15′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG 3′DP25′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC 3′
位於UL24基因內的兼併引物DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′位於gH基因內兼併引物DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′位於UL25基因內兼併引物DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′位於UL21基因內兼併引物DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG 3′2)通過PCR擴增獲得UL24、TK和gH基因的序列利用設計合成的引物，通過5次兼併PCR分別克隆TK基因的保守序列、TK基因的上遊側翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上遊序列FUL25-UL24、TK基因的下遊側翼序列FTK-gH和FTK-gH的下遊側翼序列FgH-UL21，將以上5個片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明該序列含有完整的UL24、TK和gH基因。
3)PCR擴增TK基因及其側翼序列(FTK2.9)根據所得DNA序列的結果，設計2條引物上遊引物為5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′，下遊引物為5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′，使用這兩條引物，通過PCR克隆大小為2.9kb的PCR產物FTK2.9。
4)重組載體pUC-TK2.9的構建將FTK2.9通過EcoRI和HindIII酶切位點亞克隆入克隆載體pUC18，形成重組質粒pUC-TK2.9。
5)轉移載體pUC-TK2.9-lacZ的構建將載體pUC-TK2.9用HpaI內切酶切開，並且用小牛鹼性磷酸酶去磷酸化。用PstI和EcoRI內切酶酶切質粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表達盒，並且用T4DNA聚合酶將黏性末端補平。將線性化的pUC-TK2.9和lacZ表達盒平端相連接，構建重組轉移載體pUC-TK2.9-lacZ。
權利要求
1.鴨瘟皰疹病毒轉移載體，其特徵是它是利用兼併PCR克隆鴨瘟皰疹病毒UL24、TK和gH基因，在獲得以上3個基因序列的基礎上，利用PCR克隆鴨瘟皰疹病毒TK基因及其側翼共2.9kb的DNA序列，將其亞克隆入克隆載體pUC18，構建重組質粒pUC-TK2.9，將lacZ基因表達盒插入載體pUC-TK2.9中的TK基因內，構建成的鴨瘟皰疹病毒重組轉移載體pUC-TK2.9-lacZ。
2.根據權利要求1所述的鴨瘟皰疹病毒轉移載體，其特徵是(1)鴨瘟皰疹病毒TK基因及其側翼序列的大小為8481個鹼基，即8481bp，包含鴨瘟皰疹病毒完整的UL24基因、TK基因、gH基因和UL25、UL21基因的部分序列；鴨瘟皰疹病毒UL24基因大小為1230bp，編碼409個胺基酸；TK基因大小為1077bp，編碼358個胺基酸；gH基因大小為2505bp，編碼834個胺基酸。
3.根據權利要求1或2所述的鴨瘟皰疹病毒轉移載體，其特徵是其核酸序列為AGGCCCCGTTCGTATTGCAAAGCTACCGCATCATGTGTCGTTAGTACCTCTTGAATAGGTACAGATATAGTCTTAGACCTGTTTTGCAATTCGACCGCAATGAGTCGCAAAAGGGCAGCCTGGGCTCTATTCGTTGACACGTCTAAGACATGGCGTGTAGCATTTTGTGTTTTTATGTTACGTGCATCCAAACAAAGAGCTACGAGACCAGGAAACATCTGTGTTATCTCAGTTTGCGGATCAGCTGCATATAATGAAGCCATATAACGCTCGCAAAGGAACGCGAAATTGCGATTATCGCTTTTCATGGTTTGGGCCCCCGCGGCCCCGCCATTGGACGCGCCGCGATTTAAGCGATCAGATGGTACTGCACCTGGCAACAACGTTCCGATCTGAAAATTATTACACATGCGATCCGCATAGACATTCGTATTCCATAATAATTTTCGCATGAGTATCAGTGATGTTATGGTATTTATAGTGGCGCGTAGCTGAGTTATATCCTCCATAAGAAATAGAGGTTGGGCTCTCCCAAATACGGCCCCGGCAGCTTTATTTACCTCATCTACATAAGCTCGTTGACTCTTATCAACATCCCTCGCAAGTCCATCTGGGGCGGCTACGCCAGGAGACAGCGGCAACACACCATGTTTTATAAGCATAGCTAGAACACAATGACCAGAAAGGGCAATTCGTTCCCCACTTCTGGGTTGGATGGCAAACTGACCCTTAGGTAATCTATCCATATCAAACCTATAACACAAGCGACCGCAATCGGAGGCGAGACGTTCTATAAAATTATCCAAATAAGCAGGTAGCTGCTCCACCATTCCTATAGCACTAGACGCGTAGTTAAATGGTTGGCATTTAGTCTTGGCAGATGTAATCCTGTGATGTAGCTGTAGGCATAATATCGCGCACTCTAGAGCTGTATAATGACGGACTCTTAAATACAAGCGCCCAGTGGCCTGTAGTGATACTATAGCAGTAGTCATAAACGTTTTGGACTGCCGTCCATCGCGCTGGTCTAACCGTTTGGACACAACAGGCCACTCAGTAATCAAACCGTCTTGGAGAGCTTTATACCAAGTACCGAATAATACACCCCAACCAGAAGCCGAAGAGCCACCACGTGTTGAATAAATAATAGTTAACAAGTCTGTACTCAAATTAGTGTCATAGCGCAATGGTGTATCGTTCTTAACTATCTGTACTTCGCGCCTTTCATCATTAGAATCACTTGTTTCTCCCAATTTATCCCCATCGCCGTCTTGTCGGCTACGTTCATATGATCCATCGATCTCATCAGCCGGCGTCCGTCGCTTCTGCCATAGCAGCAGCATTCTCCAAATCTGCGATTACTGCTGTTACAGATTTTACTTGCTCTTCTATAGGTTTTAAACGCATTTCTAATTCGGCTGATATACAGTTATTCTTGATGCTTAAATGATCCAACGCCGCCGATGCCGCAGTATTCCGTTGTTGTAATATACGTAATCTCTGTATCGCTGTTTCTTCTTCATGGCGATTTGCCTGCGATTTTGTCCAGTAGTGCGCTGGCCAATTCGGTGTTATAAAATTCCTAGAATCTGATATGTAGCCCGCGGAGCTATGTCCTTTGCACATATCAAGTGGGGAGAAAAAGAATCTTTCCATTGTTGATTATACAAGCCGATAGTTTTAAGAAATCCAATACACTTCTAATCGACAGACCCTCGCACAGCTAGTAACAAAAACCGTTGTCAAACAATTCTTTTTAAACACTCGCGACCAGAACTCCCGCCCATAATAATCAACACTGCCAGACAATAGGATGGTAATATGCGTTTCTGTAATAATGCACTAGTGTTTAGTTGGTCTGAATATGGATGCTACAAATCGCAATACTCCACCGCCTATTTGTGTCTCTGTATCGCTACAATTAATATCACTGTCTGATGCGACGCCATGCTTGCCATCATAACCGTATTCTCCATTAATACCATCTATATTCGTTTTGGGTTCTTCAGTATTGTTTAGTCCTGTATTTGTCTGTGGTGTAACCAACTGCCCATAACCCCATAGTCGCAATAGTCGTACGCTATGGATCCCAGTTGCATTGCCGTGTGGTATGTTCTCGCCTGCCGCAGAACTCGTCCCGACGCCTGGCGAAAATTCTTCCCACCAGCGTTTTTTCGCAAGACTGGAAGAATTTTCGCTGGGTGTACGAGCACATGTCGGGTTCATAATGGCATCATCGATGTCGTCTTTGTCGACAATTTTGCACGCATCTTTACTGTATAATTCGGACTCCAATTGAACATACTGGCTACATATACATTTAGCCTTCCGGCGCTTACCTTTGGTAGGTATATGATATTCTGATAAACCTGCAATAGAGGCTGATAATGCCGCAAAGTTGGAGGATACGCGCCGATGAGCAAATCGTGTAATTCGGAGTATGTCCAGACCGCGCTGGGCTACAAATACTAGCAACGGACATATTAAAAATTGACTGCATCCAGGGGGCATGATACGTTCCAACAAGATGGCCGATTCCATCAATTGTCTAATTCCAGTCCATGTTTGCTGTTGTTTACTTCCTGTTGTCATATTTTTTACAAACTTGCAAGTCTTGAGTTCCAAAATAATACATATGACATCTGCAGTTTCTGCCTCGCCTGTCTTAATCATGCATATGCAATCTGGGCGGCGCCTTCCTAAGTTGACTTCAAAAGTCAGCCTCACATCAAATGCAGTTTTAAGTGTCTGCAAAGACAGAGTGTGTTCGAATAGCCGCACAATCAGTTTACTGGGCGATCCACCATTTGAACGAAATTTGTTCAAATCGTTAGCCAGGGCGCCATAAAAACGATTGTGGCAGCGCACTCCAGCTTTGAGGCGACGTGCGACTGAACCGGACGTGTTGGCATCGGTTCGTCTCTTGGATCCTGCTACGCGTCTACAAGGCCGCTGTTCCGCGTTCTTAAGTGCGGCTGTCGTCGCTGCGCCAATACATTTCCGATCAAATGTCACTGCGCGACTCTTGCGAACGCTTAATCCGGCGCGCTTTTTCTGTACCTTCGATGCCATTATGCCTCGTCCGCGTATACCTAGACGGGCCGTATGGAACTGGCAAAACCACAACTGGCAAACTGTTGTCGGAGGATACCCTTGCAGCCACTCTTTATGTTGCCGAGCCAATGGCGTATTGGAGAAATCATTTTGAAGATGTAATAAAGGGCGTATACGAAACACAGGAAAGAAAAGCTCGAGGTGACATAGCAACAACTGACGCAAAAGCAATTACGGCTGCTCTTCAACTGCAATTTTTCGCACCATACAGTTCCTTTCATACATATGCATCGACGTTATTTGGAGTCGAAGCGCCAGAAAGAACACCACCAGATATTACGCTCATAACTGATCGGCACCCGACCGCCGCATGTCTTTGCTTCCCAGCAGCTCGTTTTGTAGTGGGGGATATGAGCCTTAATACTCTATTGGCTATGATATCCCTAATTCCTCGCGAACCCCATGGTGGAAATATAGTAATAATGGATTTGAATGAAGATGAGCATCTTGAACGATTGAGAGCTCGCCAACGTCCTGGCGAAGCAATTGACGTACGCTTCTTGCGCGTATTACATAATATATATAAGATGTTTGTTAATACAATTTGGTATGCCAAACAAGCACCAATAATGTGGGACTGTGATAAATGGGACAAAGATTGGAGCTCGGTCCCAATATTTGATGACGATAGAAAGAAAATGTTAGAAGCGCGTGATTCAGTGCCTATTGTTGGTGGGAAAGAACGGCCAAGTCCATCAACGACTCTCTTGTCACTGTTCAAAGTACCTGAACTATGTGACGAATCATTTAGACTGCGTAAAGTCCATGAATGGAATCTGAGATGCGCATTAATTAAGTTGGCGGATTTGAATGCATATTTTATGGACATAAGTGGCAAGAGCCCCCAAGAGTGTGCCGCTGAAGTACGAGAGGCAACTAACGCGATGGACTTTACGCGCCTATCTTTTACCATGGCCGAGGATCTGGAACAAGCTGTTAACCAATACAATACCGAGATGACAATTAATTGATAAATATATTTGTTTTAAATAAAGCTCTGATGGGCGGTTCTGAAACTATGACGCATATGTGTGTTTATTGCCTGCCACATTTGTAAATGCACGCCTTCGCTACTCCCTATTTGTTTTACTGTTTGGAGACAGTTAGTATATGTTCACGCGAGAATATAATGCGCCATTCCGCCGAGAGGACCTAGGCGAGCTTTCTGGGACCTCACCGCGGAGCTAGTTTTCTCTACGCGGCCGCGGTTCTGTCCCAGGTAAAGCTAACCGGCCAACTTTAGAATGTCGCAGCTTACGGTGCTAATATATACAGTCATAGTTTTTGAGGTTGTAAGTGCGGCGTGGATAGGTGTCGGGGAAGAAGATATGAGTTTAAACTTTACTCATCACGTTATATCGCCAGATGTTCTTCGCCATGCCTTTACAGGAATAGTAACGGACAGTGGACCAACTGGGCGTAGCACATCTACAATTCATGTATCGTCGGTTCTCGGCGCGCCGTACGGAATAAATTCCACCGATCTGAGTAATCTAAAATGGATACATGCAACCACAATATTCTTCTTCGTTACCAACCCCAAAGGAACGAAGTTTACAGGTACTTTGCTATTCGTACCTAGAGAAGCGGGCATAAAATTCAGATCAATTGACTATCCTGACAGCGTTATGCTTGCGTCGCCCAATTTTGCACGTTCTCTAGCATGTTCTGCAACGCCGGATAATTTATCAGAATATGGAAAGATAAAACTTAAAGAACACGTCGACGATATAAAACATGTACGTCCTGTTCGGCCCAAGCCCAGTGGCTCAAATCCTCCAAAGGACATTGCTAAAATTTCATTTTCTGACATACTCCGTCCTTCCGAAGCATTTTTTGATCCCAAAACGC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4.一種鴨瘟皰疹病毒轉移載體的製備方法，其特徵是1)設計擴增UL24、TK和gH基因的引物根據鴨瘟皰疹病毒UL25、UL24、TK、gH和UL21基因的保守序列，設計兼併引物，位於TK基因內的兼併引物DP1和DP2DP15′TCTCGAC(T)GGA(G，C，T)GCA(G，C，T)C(T)AC(T)GG 3′DP25′GCGATTGGA(G)TGG(C，T)CG(T)A(G)TC 3′位於UL24基因內的兼併引物DP3 5′CGGCACGA(T)C(T)TTC(T)AA(G)C(T)TC 3′位於gH基因內兼併引物DP4 5′ATCATCGTACCA(G)TTAGG 3′位於UL25基因內兼併引物DP5 5′AGGCCCTIT(G)TTCG(A)TAT(C)TG 3′位於UL21基因內兼併引物DP6 5′GCTTAC(T)TTC(T)A(G，C，T)T A(G，C，T)TA(G)C(T)GG A(G，C，T)GG 3′2)通過PCR擴增獲得UL24、TK和gH基因的序列利用設計合成的引物，通過5次兼併PCR分別克隆TK基因的保守序列、TK基因的上遊側翼序列FUL24-TK、FUL24-TK的上遊序列FUL25-UL24、TK基因的下遊側翼序列FTK-gH和FTK-gH的下遊側翼序列FgH-UL21，將以上5個片段拼接，共得到8481bp的DNA序列，序列分析表明該序列含有完整的UL24、TK和gH基因；3)PCR擴增TK基因及其側翼序列FTK2.9根據所得DNA序列的結果，設計2條引物上遊引物為5′CCGGAATTCATTTGTCTGTGGTGTAAC 3′，下遊引物為5′CCCAAGCTTAGTGCTGATGGTAGGAG 3′，使用這兩條引物，通過PCR克隆大小為2.9kb的PCR產物FTK2.9；4)重組載體pUC-TK2.9的構建將FTK2.9通過EcoRI和HindIII酶切位點亞克隆入克隆載體pUC18，形成重組質粒pUC-TK2.9；5)轉移載體pUC-TK2.9-lacZ的構建將載體pUC-TK2.9用HpaI內切酶切開，並且用小牛鹼性磷酸酶去磷酸化，用PstI和EcoRI內切酶酶切質粒pSV-β-Galactosidase，切出lacZ表達盒，並且用T4DNA聚合酶將黏性末端補平，將線性化的pUC-TK2.9和lacZ表達盒平端相連接，構建重組轉移載體pUC-TK2.9-lacZ。
全文摘要
本發明提供的是一種鴨瘟皰疹病毒轉移載體及其克隆方法。它是利用兼併PCR克隆鴨瘟皰疹病毒UL24、TK和gH基因，在獲得以上3個基因序列的基礎上，利用PCR克隆鴨瘟皰疹病毒TK基因及其側翼共2.9kb的DNA序列，將其亞克隆入克隆載體pUC18，構建重組質粒pUC－TK2.9，將1acZ基因表達盒插入載體pUC－TK2.9中的TK基因內，構建成的鴨瘟皰疹病毒重組轉移載體pUC－TK2.9－1acZ。本產品可用來構建鴨瘟皰疹病毒基因缺失疫苗。可用來構建重組活載體疫苗。
文檔編號C12N15/869GK1635121SQ20041004410
公開日2005年7月6日 申請日期2004年12月8日 優先權日2004年12月8日
發明者王君偉, 韓先傑, 馬波 申請人:東北農業大學