以SecA動力泵為靶點的抗革蘭氏陰性細菌藥物篩選模型及用途的製作方法

2023-06-13 19:44:26 2

專利名稱：以SecA動力泵為靶點的抗革蘭氏陰性細菌藥物篩選模型及用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種secA缺失的溫度敏感型重組大腸桿菌，其高效表 達革蘭氏陰性細菌例如綠膿桿菌secA基因。本發明還涉及一種以SecA 動力泵為靶點的新型抗革蘭氏陰性細菌藥物微生物細胞水平篩選模 型，其利用高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸 桿菌，以及野生型大腸桿菌和綠膿桿菌，用於針對SecA動力泵靶點對
藥物;選。所述模型還可用於針對候選化合物的篩選。
背景技術：
當前，革蘭氏陰性細菌仍然是醫院與社區感染中最重要的致病菌， 而且耐藥問題在革蘭氏陰性細菌的感染治療中也越來越成為一個難 題。耐藥革蘭氏陰性細菌多為條件致病菌，佔醫院臨床檢出的耐藥病 原菌60%~ 81%[1、 9、 10]。常見的致病菌有綠膿桿菌、大腸桿菌 及腸桿菌屬、陰溝桿菌、沙雷菌屬、沙門菌屬、枸椽酸菌屬、肺炎杆 菌、不動桿菌、流感桿菌等。耐藥機制主要有細菌細胞膜通透性改 變；細菌主動外排系統；PBPs改變；產生p-內醯胺酶、鈍化酶、酯 酶、乙醯轉移酶等滅活酶。而解決這一問題最為有效的方法就是尋找 和發現新的作用機制的、與已有的抗生素無交叉耐藥的新型抗革蘭氏 陰性細菌的藥物。
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa),又名綠膿桿菌，是 假單胞菌屬中的代表菌種。最早是在1882年從病人化膿的傷口中分離 出來，但到目前為止，它仍然是一種重要的院內感染條件致病菌，常 常感染免疫力低下的病人，引起菌血症，肺炎，泌尿系統感染。近幾年的研究還表明綠膿桿菌與大多數嚢性纖維化病人的發病率和死亡率
有關[4],在成年的病人中，81%的感染了綠膿桿菌[5]，綠膿桿菌中磷 脂酶C的產生與病人肺功能的降低與病情的惡化相關[6]。由於綠膿杆 菌外膜通透性低並存在著外排多種物質的主動外排系統(Active Efflux Systems),使得綠膿桿菌具有先天的多重耐藥性，而當細菌 與抗生素接觸後，又可以產生抗生素的修飾酶；降低抗生素作用位點 的敏感性而獲得的後天的耐藥性，導致經常表現對p-內醯胺類、氯黴 素類、喹諾酮類、磺胺類等多種抗生素的多重高度耐藥，臨床治療十 分困難， 一旦感染，死亡率很高，已經成為臨床醫生面臨的治療難題 之一。因此，迫切需要發現新的抗綠膿桿菌等革蘭氏陰性細菌的藥物。
從成千上萬個微生物代謝產物中挑選所需的抗菌藥物是非常艱難 的一個過程。目前開發新型有用的微生物藥物，雖然仍有很大的潛力， 但研究工作的難度越來越大，耗時越來越長，需要的資金也越來越多。 因此，針對候選微生物的簡單、快速、特異的篩選模型是關鍵。為擺 脫篩選的盲目性，提高效率，有必要進行定靶篩選，從細菌生存所必 須的組成成分或者臨床有效抗生素的作用機理和細菌的耐藥4幾理來i殳 計篩選模型，有目的地篩選具有某種作用機理的抗生素，試圖獲得抗 菌作用強、對耐藥菌有效、毒性小的新抗生素。
為獲得新抗革蘭氏陰性細菌藥物，本發明人引入了一個嶄新的藥 物作用靶點，即以SecA動力泵為靶點，通過本發明所述篩選模型， 篩選新的抗綠膿桿菌或大腸桿菌以及其它耐藥菌的新化合物。

發明內容
眾所周知，蛋白質的翻譯是在細胞質中進行的，但是研究表明在 革蘭氏陰性細菌中，大約有三分之一的蛋白質必須穿過細胞內膜運送 到周質或分泌到細胞外才能發揮它們正常的功能["。細菌中含有多種 蛋白質轉運的途徑，但最主要的途徑,皮稱之為分泌途徑(secretion pathway),簡稱為Sec途徑。大多數的分泌蛋白和一些整合膜蛋白的 轉運都是通過這條途徑進行的[8]。分泌蛋白是以前體的形式合成的，其氨基端都含有信號肽。它們通過共翻譯或翻譯後轉運的形式穿過細
胞內膜[9]。這一過程是由轉運酶所催化的[IO]。轉運酶是由多個亞基 組成的複合體，其中的核心部分包括SecY、 SecE和SecG組成的膜整 合區以及SecA二聚體組成的外周區[11]。而其它的組分包括SecD、SecF 和YajC都不是蛋白質轉運所必須的，但與蛋白質轉運信道的穩定性和 轉運效率有關[12]。蛋白前體以非摺疊的形式，通過ATP和PMF的能量 輸入形式進行跨膜轉運，最終信號肽在周質中被信號肽酶水解除去。 釋放的成熟蛋白或在周質伴侶分子的作用下摺疊成它正確的構象或繼 續被運送到細胞外或嵌合到細菌外膜中。
SecA是蛋白質轉運途徑中的"動力泵"，它是一種ATP酶，可通過 水解ATP產生的能量推動著多肽鏈穿過SecYEG信道。目前的證據表明在 轉運過程中SecA在水解ATP的同時還經歷著插入和脫離細胞內膜 SecYEG通道的循環，這樣每一次循環可推動20多個胺基酸的連續跨膜 運動[IO]。 SecA在細菌中不可缺少，而且是細菌中所特有的，因此它 將為我們篩選抗細菌的藥物提供了一個嶄新、低毒的靶點。
本發明篩選模型的建立基於如下機理，即抑制SecA的ATP酶活性 的化合物，必然會在一定程度上抑制蛋白質的轉運和分泌，這其中也 包括抑制革蘭氏陰性細菌的外膜蛋白，這樣可有利於提高其外膜的通
透性或破壞綠膿桿菌等革蘭氏陰性細菌外排泵。
因此，如果將SecA的ATP酶抑制劑與其它抗生素聯合使用，很可能 會降低綠膿桿菌等革蘭氏陰性細菌固有的多重耐藥性，從而擴大了臨 床上的用藥範圍。另外， 一旦蛋白質轉運受阻，也一定會影響到綠膿 桿菌等革蘭氏陰性細菌生物膜的形成，這也可以緩解由此產生的綠膿 桿菌等革蘭氏陰性細菌的耐藥問題。
為了從大量的微生物代謝產物和其它來源的樣品中篩選SecA的
ATP酶活性抑制劑，需要首先建立簡便易行並且低成本的初篩方法。
本發明的一個方面，涉及高效表達綠膿桿菌基因的secA缺失的溫 度敏感型大腸桿菌。具體的，本發明人利用綠膿桿菌基因組計劃中提 供的信息，設計引物擴增綠膿桿菌的secA基因，在secA缺失的溫度敏
6感型大腸桿菌B121. 19中，克隆並高效表達綠膿桿菌secA基因。
在本發明的一個實施方案中，所述高效表達綠膿桿菌secA基因的 secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌B121. 19中，綠膿桿菌secA基因的表達 可以在非允許的溫度下，互補溫度敏感型大腸桿菌B121. 19中發生琥珀 突變的SecA的功能，使得該重組菌林B121. 19/pET20b/pasecA能夠在 42"C下生長。
在本發明的又一方面，涉及一種以SecA動力泵為靶點的新型抗綠 膿桿菌藥物微生物細胞水平篩選模型，其中利用本發明所述高效表達 綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌作為檢定菌林， 以及野生型大腸桿菌和綠膿桿菌為對照菌株，針對SecA動力泵耙點對 候選微生物的次級代謝產物進行微生物細胞水平的抗綠膿桿菌藥物篩 選。
在本發明的一個實施方案中，採用本發明所構建的細胞水平抗綠 膿桿菌藥物篩選模型，以所述重組菌抹B121. 19/pET20b/pasecA作為檢 定菌，依據在42。C下是否抑制大腸桿菌和綠膿桿菌SecA蛋白的互補作 用，並聯合使用野生型的大腸桿菌、綠膿桿菌作為對照菌林，成功建 立簡便廉價而且有效的初篩模型。
本發明所述細胞水平抗綠膿桿菌藥物篩選模型，可用於針對微生 物的次級代謝產物進行微生物細胞水平的抗綠膿桿菌藥物篩選。還可 用於針對候選化合物的進行微生物細胞水平的抗綠膿桿菌藥物篩選。
本發明所述篩選模型中，針對候選微生物的刺激代謝產物的微生 物細胞水平的篩選通過包括如下步驟的方法進行
1)候選次級代謝產物的產生以及候選化合物的製備
選擇合適的發酵培養基，在適於微生物次級代謝產物產生和/或累 積的條件下培養微生物。
本領域普通技術人員，能夠根據待培養的微生物類型，以及期望 的候選微生物所產生的次級代謝產物，選擇合適的發酵培養基和培養 條件。為實現微生物的生長和次級代謝產物的累積，通常採用液體培 養基進行發酵培養。對於以產生大量次級代謝產物而著稱的放線菌目中的微生物，包 括但不限於，例如鏈黴菌、小單孢菌、諾卡菌等為實現微生物的發酵
和次級代謝產物的累積，通常在26 - 30°C,例如為28r下，採用液體 培養基，振蕩搖瓶培養例如約36 - 120小時，例如為約48 - 96小時，或 者例如約為72 - 96小時。
為便於進行篩選，通常將經過上述發酵獲得的發酵液採用例如離 心沉澱等本領域公知的方法除去微生物菌體，以上清液作為樣品經過 適當的梯度稀釋用於進行篩選。
對於候選次級代謝產物累積在微生物體內的情形，可以通過將例 如離心沉澱等方式獲得的微生物菌體，經過例如細胞破碎機等本領域 z〉知的方式細胞石皮損後，再次採用高速離心沉澱的方式去除細胞碎片， 以上清液作為樣品經過適當的梯度稀釋用於進行篩選。
對於候選產物為化合物的情形，可以將待測化合物以適當的溶劑 溶解後經過適當的梯度稀釋，製成待測樣品。本領域普通技術人員知 曉如何根據待選擇的化合物性質選擇適當的無機和或有機溶劑，包括 但不限於，水、生理鹽水、磷酸緩沖鹽液、二甲基亞碸，
2)篩選模型的製備
按照本領域普通技術人員知曉的方法，將固體培養基，例如TAG瓊 脂培養基(10 g/L胰蛋白腖，5 g/L NaCl， A salts [IO]和O. 5%葡 萄糖，1.5%球脂)熔化，冷卻到合適的溫度，例如("。C左右)， 加入100jig/ml氨千青黴素和培養基體積0. 5-1. 5%的對數生長期的所 述高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌作為 檢定菌以及同樣處於對數生長期的野生型大腸桿菌和綠膿桿菌作為對 照菌株，倒入單獨的PETRI， s培養皿中，製成檢定平板，待用。
3 )加樣
將如上述步驟l )所得經過適當稀釋的含有待測次級代謝產物的微 生物發酵產品，以適當的加樣量加樣於含有本發明所述篩選模型的培
8養基上。本領域普通技術人員知曉如何對含有待測次級產物的微生物 發酵產品進行適當稀釋，例如濃度梯度稀釋，或是進行適當地濃縮， 以便於用於本發明所述篩選模型。
為方便樣品加樣，通常採用按一定的順序和/或及一定的間隔，在
如上述步驟2 )中所獲得的塗布有檢定菌抹和/或對照菌林的培養亞中 排列篩選用的例如無菌牛津杯或濾紙紙片等。事實上，只要能夠便於 操作和方便觀察實驗結果，可以釆用本領域技術人員周知的任何方法 加樣，所述樣品的順序和間隔完全能夠由本領域普通技術人員依據常 規操作加以確定。
本發明所述篩選模型也可採用不同於上述具體加樣方法的本領域 公知的其它方式進行加樣，例如對於高通量藥物篩選，也可以釆用機 械手或機器人按照相應的程序進行自動化點樣。
4)檢測及陽性樣品判定
在預定的溫度，如37。C (對於大腸桿菌和綠膿桿菌，對照菌)或 42°C (高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌
檢定菌)下，過夜培養後測定抑菌圏的大小。
作為初篩模型，抑菌圏直徑大於9mm，優選大於10mm，更優選大於 llmm，特別優選大於12mm，甚至更優選大於13mm，最優選大於14mm的， 判定為具有針對SecA動力泵靶點的陽性樣品。
以下結合具體實施例用於說明本發明所述的篩選模型以及相應的 篩選方法。
實施例 材料和方法
菌抹、質粒、培養基和試劑
綠膿桿菌PAOl菌林及其基因組DNA由美國喬治亞州立大學Dr. C. D. Lu惠贈;大腸桿菌DH5oc， BL21. 19 (secA13ts) [9〗，質粒pET20b，質粒pET5a/ecsecA均為美國喬治亞州立大學Dr. Tai實驗室保存，溫度 敏感性突變體大腸桿菌BL21. 19 (secA13ts)被用來表達大腸桿菌和綠 膿桿菌的secA基因。培養微生物細胞所用的是TAG液體培養基(IO g/L 胰蛋白腖，5 g/L NaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖)和TAG液體培養 基(10g/L胰蛋白腖，5g/LNaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖，1.5% 瓊脂)，並加入100 ixg/ml氨苄青黴素。限制性內切酶NdeI和Hind III 購自Roche公司，TripleMaster PCR System購自eppendorf公司。 pGEM-T vector是美國p濯ega公司產品。Perfectprep Gel Cleanup Kit購自Qiagen公司。IPTG和X-gal是Sigma公司的產品。
本發明採用的分子生物學方法均按照產品供應商提供的方案或者 本領域公知的方法進行，參見例如分子克隆實驗室指南(第二版)， 冷泉港出版社出版。
實施例l綠膿桿菌PAOl SecA基因的擴增和表達 PA01 secA基因擴增的引物設計
根據銅綠色假單胞菌(P. aeruginosa)基因組資料庫(www. pseudomonas.com)中公開的序列數據，i殳計寡核苷酸引物
pasecAFl:5， -TCCCCACGTGTGGATGACCAAGTCCATATG-3，(SEQ ID
NO: 1 );
pasecARl: 5, - GGTGAACCAGGCGGGAAGCTTAGTC~3， (SEQ ID NO: 2)， 引物中下劃線部分分別為NdeI和Hind III限制酶切位點。 PA01 SecA基因的PCR擴增
PCR反應體系包括10X反應緩衝液，dNTP混合物，pasecA Fl引 物，pasecA Rl引物，Triplemaster DNA聚合酶，PAOl基因組DNA以及 不含有核酸酶的雙蒸水。反應的中體積為50pl。 PCR反應的條件為 94°C 5分鐘，94。C l分鐘，50°C l分鐘，72°C 3. 5分鐘，29個循環， 最後一步72。C IO分鐘。
pGEM-T載體克隆的構建
10Triplemaster DNA聚合酶具有高保真3， -5，外切酶的活性，同時 它還保留著Taq酶的特性，其PCR產物的末端有一個單個的dA，因此可 以直接用pGEM-T載體克隆。連接反應體系如下5jul2X連接緩沖液，
pGEM-T栽體，2jal pcr產物，1 jli 1 T4連接酶，1jj1 ddH20。 PCR產物與pGEM-T載體的摩爾比應該約為3/1。 4'C反應過夜。
在冰水中解凍大約200 ja 1 DH5ot感受態細胞，加入10iul連接混 合物。通過輕輕的轉動吸管頭使其混勻。置於冰浴中40min。 42。C熱擊 45-60秒。再放入冰浴中冷卻2min。加入LB液體培養基(室溫)至lml， 37°C， 200rpm培養l小時。準備LB/氨千青黴素/IPTG/X-Gal (100mg/ml 氨苄青黴素，20jul 50mg/ml X-Gal， 20jj1 1M IPTG)平板。接種前 使其溫度達到37。C。取200 u 1轉化的細胞塗布在平板上，37'C培養過 夜。
挑取10個白色單菌落，接種至2ml含有100yg/ml氨千青黴素的 LB液體培養基中。37。C劇烈震搖培養12- 16小時。提取質粒DM，用Nde I和Hind III鑑定陽性質粒，命名為pGEM-T/ pasecA。
實施例2重組表達質並立pET20b/pasecA的構建
PA01 SecA蛋白表達質粒pET20b/pa secA的構建步驟具體如下
提取如實施例l所述製備的pGEM-T/pa secA質粒和pET20b載體。
37°C,分別用NdeI和Hind III消化兩種質粒。
通過瓊脂糖凝膠電泳進行分析。利用Perfectprep⑧Gel Cleanup
Kit純化待插入的片段和載體。用瓊脂糖凝膠電泳估測插入片段和載
體的量。
將待插入片段與NdeI和Hind III消化後的pET20b, 14。C連接過 夜。片段和載體的摩爾比應該約為5: 1。使用10ja 1連接混合物轉化DH5 oc感受態細胞。200jli 1轉化細胞塗布含有氨苄青黴素的LB平板。37°C 培養過夜。選擇10個單菌落，接種到2ml含有100jag/ml氨苄青黴素 的LB液體培養基中。37。C劇烈震搖12-16小時。提取質粒DNA，用NdeI 和Hind III鑑定陽性質粒。獲得含有重組表達質粒pET20b/pasecA。用如上述獲得的重組表達質粒pET20b/pasecA轉化B121. 19感受態 細胞，獲得用於本發明所述篩選模型的檢定菌，並命名為 BL21. 19/pET20b/pasecA。所述檢定菌是大腸埃希氏菌(^c力er/c力/a co7/)，該菌已經於2006年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏委員 會普通微生物中心(CGMCC,北京，中關村北一條，郵政編碼100080 )， 保藏號為CGMCC No. 1838。
在本發明所述篩選模型中，還任選的採用了檢定菌 BL21. 19/pET5a/ecsecA。所述檢定菌是大腸埃希氏菌(^c力er/c力" co//)，該菌已經於2006年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏委員 會普通微生物中心(CGMCC，北京，中關村北一條，郵政編碼100080 )， 保藏號為CGMCC No. 1839。
實施例3檢定菌林pET20b/pasecA在BL21. 19中誘導表達綠膿桿菌 SecA蛋白
將如實施例2所述獲得到所有轉化細胞塗布於含有氨苄青黴素的 LB平板。30t:培養過夜。選擇10個單菌落進行劃線純化，挑取單菌落 接種到2ml TAG液體培養基中30X:培養過夜。取80 n l培養物接種到2ml 新鮮的TAG液體培養基中待OD600達到0. 8，加入lmM IPTG， "X2培養2 小時，釆用SDS-PAGE比較SecA蛋白的表達量。
綠膿桿菌SecA蛋白與大腸桿菌SecA蛋白的互補作用的驗證 準備兩個含有lmM IPTG和100pg/ml氨苄青黴素以及兩個只含有 100 n g/ml氨節青黴素的TAG平板並分別平分成U份。將只含有空白質 粒的空白對照林BL21. 19/pET20b以及ll株如實施例2中構建的檢定菌 BL21. 19/pET20b/ pasecA劃線接種於對應的四個平板上，分別放於30 和42C培養過夜。
因為出發菌林大腸桿菌BL21. 19(secA13ts) [9]是一林secA基因發 生琥珀突變的溫敏型菌抹，在30X:時能夠正常生長，而在421C時，其 生長受到抑制。因此，空白對照株BL21. 19/pEn0b在^t:的條件下， 能夠正常生長，而在42C時則不生長，在培養基平板上沒有菌落出現。 而BL21. 19/pET20b/pasecA在30和42t:時均能很好地生長，初步說明在非允許的溫度下(42°C )綠膿桿菌SecA蛋白能夠互補大腸桿菌BL21. 19 中突變的SecA蛋白的功能。
為了進一步確定綠膿桿菌SecA蛋白與大腸桿菌SecA蛋白的互補作 用，分別糸匕取檢定菌林BL21. 19/pET20b/pasecA和 BL21. 19/pET5a/ecsecA和空白對照林BL21. 19/pET20b單菌落，在含有 100Mg/ml氨千青黴素的TAG平板劃線，直至出現單菌落。分別放於30 和42。C培養過夜。其中，菌林BL21. 19/pET5a/ecsecA用作陽性對照林， 該工程菌抹中所含的質粒包括大腸桿菌自身的secA基因，所以在非允 許的溫度下(42。C)大腸桿菌野生型的SecA蛋白可以完全互補大腸杆 菌BL21. 19中突變的SecA蛋白的功能，能夠正常生長。
空白對照林BL21. 19/pET20b在30。C的條件下，在培養基平板上可 出現單菌落，在42。C時則不生長，在培養基平板上沒有菌落出現。陽 性對照BL21. 19/pET20b/ecsecA在30。C時可正常生長，而在WC時可得 到單菌落。而BL21. 19/pET20b/pasecA在30和WC時均能很好地生長， 都可得到單菌落。進一步說明在非允許的溫度下("。C )綠膿桿菌SecA 蛋白能夠互補大腸桿菌BL21. 19中突變的SecA蛋白的功能。
實施例4
利用本發明所述篩選模型進行微生物細胞水平上以SecA蛋白為靶 點的陽性樣品-SecA蛋白抑制劑的篩選
選用實施例2中所得的能夠高效表達綠膿桿菌SecA的大腸桿菌重 組工程菌B121. 19/pET20b/pasecA作為檢定菌，野生型的大腸桿菌和綠 膿桿菌作為對照，進行微生物細胞水平上以S e c A蛋白為靶點的陽性樣 品-SecA蛋白抑制劑的篩選
1)篩選模型的製備 -
檢定菌的培養方法如下將分別保存於斜面培養基上待用的實施 例2中所得檢定菌抹B121. 19/pET20b/pasecA、野生型大腸桿菌和綠膿 桿菌，接種至2ml LB/TAG液體培養基培養，3丌C,振蕩培養過夜。 按照本領域普通技術人員知曉的方法，將固體培養基TAG瓊脂培養基
13(10g/L胰蛋白腖，5 g/L NaCl， A salts [10]和O. 5%葡萄糖，1.5% 瓊脂)熔化，冷卻到合適的溫度，例如45。C左右，加入10(^g/nil氨 苄青黴素和O. 5-1. 5。/。的對數生長期的所述高效表達綠膿桿菌secA基因 的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌、作為檢定菌以及同樣處於對數生 長期的野生型大腸桿菌和綠膿桿菌作為對照菌林，倒入單獨的PETRI， s培養皿中，製成檢定平板，待用。待平板凝固後。將蘸有待測樣品(從 自然環境分離得到的微生物的發酵樣品或者候選化合物)的紙片按一 定的順序及一定的間隔貼到含有檢定菌的培養基上，在預定的溫度[37 °C (使用大腸桿菌，綠膿桿菌作為檢定菌時)或42'C (使用 B121. 19/pET20b/ pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作為檢定菌時)] 下，過夜培養後測定抑菌圏的大小。
實施例5利用篩選模型對微生物發酵樣品進行篩選的方法和結果 利用實施例4所述篩選模型，對於含有次級代謝產物的候選微生物 發酵樣品，通過如下方法進行篩選
將微生物菌林I06A-00985接種到放線菌發酵培養基A2 ( 0. 5%葡萄 糖，0. 5%酵母浸膏，0. 5%蛋白腖，0. 5%牛肉青，0. 4%玉米漿，1. 0%黃 豆餅粉，2. 0%澱粉，0.4% CaC03)中，28 。C搖瓶培養96小時，取7ml 發酵液在5， OOOrpm條件下離心，得到上清，用9mm紙片沾取發酵液上 清，放於含有本發明所述篩選模型的含有IOO ^g/inl氨苄青黴素的固 體TAG ( 10 g/L胰蛋白腖，5 g/L NaCl， A salts [IO]和O. 5%葡萄 糖)培養基上，其中所述篩選模型包括O. 5%檢定菌，即實施例4中所列 舉的B121. 19/pET20b/pasecA和陽性對照林B121. 19/pET20b/ecsecA， 以及野生型的大腸桿菌和綠膿桿菌；在預定的溫度37。C (使用大腸杆 菌，綠膿桿菌作為檢定菌時)或42。C (使用重組菌抹 B121. 19/pET20b/pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作為檢定菌時)下，
過夜培養後測定抑菌圏直徑的大小。
結果表明，微生物菌林I06A-00985的發酵液在WC條件下抑制 B121. 19/pET20b/pasecA的生長，抑菌圈直徑為17mm，但在同樣條件下不抑制B121. 19/pET5a/ecsecA的生長，說明所述微生物發酵液特異性 抑制綠膿桿菌的SecA蛋白的活性。所述微生物發酵液還在37'C條件下 抑制綠膿桿菌PA01的生長，抑菌圏直徑為ll. 5mm，但在同樣條件下不 抑制大腸桿菌的生長。以上得到的兩個抑菌圏直徑值都大於9mm,因此， 微生物菌林106A-00985判定為本發明篩選模型所篩選得到的陽性菌 林。
實施例6利用篩選模型對待測化合物樣品進行篩選的方法和結果 將待測化合物2004B69的10mg/ml的母液稀釋500倍，將9mm紙片沾 取待測化合物稀釋液，放於含有本發明所述篩選模型的含有IOO jag/ml 氨苄青黴素的固體TAG ( 10 g/L胰蛋白腖，5 g/LNaCl， A salts [10] 和O. 5%葡萄糖)培養基上，其中所述篩選模型包括O. 5%檢定菌，即實 施例4中所列舉的B121. 19/pET20b/pasecA和陽性對照林 B121. 19/pET20b/ecsecA，以及野生型的大腸桿菌和綠膿桿菌；在預定 的溫度37'C (使用大腸桿菌，綠膿桿菌作為檢定菌時)或42。C (使用 重組菌4朱B121. 19/pET20b/pasecA和B121. 19/pET5a/ecsecA作為檢定
菌時)下，過夜培養後測定抑菌圈直徑的大小。
結果表明，20ng/ml的化合物2004B69在42 。C條件下抑制 B121. 19/pET20b/pasecA的生長，抑菌圏直徑為14mm，將化合物 2004B69稀釋到15jug/ml和10ng/ml，抑菌圈直徑仍可達到12mm和10mm。 但在同種條件下不抑制B121. 19/pET5a/ecsecA的生長。
上述實驗結果說明，所述化合物2004B69可特異性抑制綠膿桿菌的 SecA蛋白的活性。但同樣濃度的化合物2004B69在37'C條件下不抑制綠 膿桿菌PA01的生長，可能是該化合物不容易透過綠膿桿菌的外膜所造 成的。在以上得到的抑菌圏直徑值大於9mm，所述化合物2004B69為本
發明篩選模型篩選得到的陽性化合物。
利用本發明所述篩選模型，本發明人從4507個放線菌、真菌，放 線細菌以及我們所分離得到的 一些難分離培養微生物的發酵樣品以及 360個化合物樣品中，初篩得到在細胞水平上作用於大腸桿菌SecA的陽性菌林320林，陽性化合物28個；作用於綠膿桿菌SecA的陽性菌林446
林，陽性化合物32個；抗綠膿桿菌的陽性菌林250抹，陽性化合物8個；
既作用於大腸桿菌SecA又作用於綠膿桿菌SecA並且抗綠膿桿菌的陽性
菌抹66林；這些陽性發酵樣品將成為以綠膿桿菌SecA為靶點的酶水平
模型篩選的候選樣品，其中作用於綠膿桿菌SecA的446林陽性菌林和65
個陽性化合物和只作用於綠膿桿菌SecA和綠膿桿菌的17林陽性菌株是
優選的研究對象。
參考文獻
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1權利要求
1、一種高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型重組大腸桿菌，其中含有重組質粒pET20b/pasecA。
2、 權利要求l的重組大腸桿菌，該重組大腸桿菌是大腸埃希氏菌 (&c/ er2'c力/a co//),其保藏號為CGMCC No. 1838。
3、 一種以SecA動力泵為乾點的新型抗綠膿桿菌藥物微生物細胞 水平篩選模型，其特徵在於使用權利要求l所迷的重組大腸桿菌作為檢 定菌。
4、 權利要求3的篩選模型，其中所述權利要求l的重組大腸桿菌處 於對數生長期，佔培養基體積的O. 5-1.5%。
5、 權利要求3的篩選模型，其還採用野生型大腸桿菌和綠膿桿菌 作為對照。
6、 權利要求3的篩選模型用於針對SecA動力泵靶點對候選微生物 的次級代謝產物和/或候選化合物進行微生物細胞水平的抗綠膿桿菌 藥物篩選的用途。
7、 一種以SecA動力泵為乾點的新型抗綠膿桿菌藥物之微生物細胞 水平篩選方法，包括採用佔培養基體積0， 5-1. 5%的對數生長期的權利 要求l所述的重組大腸桿菌作為檢定菌，其中，分別在37C培養作為對 照菌林的野生型大腸桿菌和綠膿桿菌，在42t:下培養權利要求l所述的 重組大腸桿菌，測定抑菌圏的大小，確定陽性樣品。
8、 權利要求7所述的篩選方法，其中培養時間為約12-24小時，優選為16 — 18小時。
9、權利要求7所述的篩選方法，其中所得抑菌團直徑大於9mm，優 選大於10mm，更優選大於llmm，特別優選大於12mm，甚至更優選大於 13mm，最優選大於14mm的樣品判定為具有針對SecA動力泵靶點的陽性樣品o
全文摘要
本發明涉及一種高效表達革蘭氏陰性細菌例如綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型重組大腸桿菌，一種以SecA動力泵為靶點的新型抗革蘭氏陰性細菌藥物微生物細胞水平篩選模型，其利用高效表達綠膿桿菌secA基因的secA缺失的溫度敏感型大腸桿菌，以及野生型大腸桿菌和綠膿桿菌，用於針對SecA動力泵靶點對候選微生物的次級代謝產物進行微生物細胞水平的抗革蘭氏陰性細菌藥物篩選。所述模型還可用於針對候選化合物的篩選。
文檔編號C12R1/19GK101580814SQ20081009781
公開日2009年11月18日 申請日期2008年5月15日 優先權日2008年5月15日
發明者餘利巖, 劉紅宇, 司書毅, 孫承航, 張玉琴, 李秋萍, 趙莉莉, 魏玉珍 申請人:中國醫學科學院醫藥生物技術研究所