裂殖壺菌及其高密度發酵生產dha的方法
2023-07-28 23:02:16
專利名稱：裂殖壺菌及其高密度發酵生產dha的方法
技術領域：
本發明涉及一種裂殖壺菌及其高密度發酵生產DHA的方法，屬於微生物應用技術領域。
背景技術：
二十二碳六烯酸(DHA，C22:6-4 , 1Z, 10Z, 13Z, 16Z, 19Z)是大腦、視網膜的重要結構物質，還能夠調節中樞神經系統功能、預防和治療心血管疾病、消除炎症、抑制癌症。長期以來，DHA的主要來源是從鯡魚、鯖魚、鮭魚和鰛魚等富含油脂的魚類中提取出來的魚油。魚油帶著濃烈的、難聞的、特徵性的海腥味，其品質因提取魚油所用的魚種及捕撈季節和地點的不同而差異很大，還因環境汙染而降低，在食品和醫藥中的應用因而受到嚴重限制。魚油所含的脂肪酸很複雜，其鏈長和飽和度各不相同，從中提取和純化DHA的成本很高。人 們因此需要尋找替代來源(Sijtsma L, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2004, 64:146 - 153)。裂殖壺菌無論在實驗中還是商業上都是DHA的卓越生產者(Bailey R B, et al. US Patent 6607900, 2003)。它不致病、不產毒，人類通過食物鏈中的貽貝和蛤直接攝食之，美國FDA將其列為公認安全級(GRAS,Generally Recognized asSafe)。自上個世紀90年代FAO和WHO等機構推薦在嬰、幼兒食品配方中添加DHA以來，裂殖壺菌發酵生產DHA受到更加廣泛的關注，技術水平不斷提高。S. Iimacinum SR21 培養 5 d，DHA 生產率 0. 8 g/ (L · d) (Yokochi T, et al.Appl Microbiol Biotechnol, 1998, 49: 72 - 76)。51. mangrovei Raghu Kumar 培養107 hr, DHA 生產率 0. 5 g/ (L · d) (Bowles R D, et al. J Biotechnol, 1999，70: 193-202)。一株5 mangrovei 培賽 hr，DHA 生產率 I. 27 g/(L *d) (Fan K ff, et al. JInd Microbiol Biotechnol, 2001, 70: 199 - 202)。S. aggregatum ATCC 28209 培養96 hr，DHA 生產率 3. 42 g/(L ·(!)(姜悅，等·中國專利 1218035C, 2005)。5 limacinum0UC88培養5 (1，0擬生產率1.65 g/(L*d)(張學成，等.中國專利1264967C, 2006)。S.limacinum G13/2S培養110 hr(葡萄糖初始濃度150 g/L，60 hr後再添加65 g/L)，DHA生產率 3 g/(L · d) (Ganuza E, et al. Biotechnol Lett, 2008, 30: 1559 - 1564)。S.WZU4771 培養 5 d，DHA 生產率 2. 76 g/(L .d)(趙肖為，等.中國專利 100503811C, 2009)。一株裂殖壺菌培養5 d (葡萄糖初始濃度125 g/L，降至10 g/L時流加葡萄糖以維持其濃度在10 20 g/L)，DHA生產率1.66 g/(L*d)(陳麗珠，等.廈門大學學報自然科學版，2009，48(1) : 84 - 88)。S. CCTCC M209059 在 5000 L 發酵罐中培養 5 d (葡萄糖初始濃度100 g/L，降至10 20 g/L時流加葡萄糖以維持其濃度在50 100 g/L)，DHA生產率2. 59 g/(L ·(!)(黃和，等.中國專利101575584B，2010);在1000 L發酵罐中培養132 hr (葡萄糖初始濃度40 g/L，降至15 g/L時流加葡萄糖以維持其濃度在15 40 g/L), DHA 生產率 2. 86 g/(L · d) (Ren L J, et al. Appl Microbiol Biotechnol, 2010)。S. limacinum ATCC 20888在500 L發酵罐中培養90 hr (葡萄糖初始濃度45 g/L，降至35 g/L時流加葡萄糖)，DHA生產率4.86 g/(L*d)(徐從英，等·中國專利101519676B，2011)。一株裂殖壺菌在8000 L發酵罐中培養5 d (葡萄糖初始濃度120 g/L，然後流加葡萄糖以維持其濃度在8 10 g/L)，DHA生產率6 g/(L · d)(鍾惠昌，等.中國專利101812484B, 2012)。上述現有技術的DHA生產率雖然不斷攀升，但還不夠高，因此，DHA由裂殖壺菌發酵生產替代從魚油中提取的關鍵在於進一步提高DHA生產率。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是現有技術中DHA生產率過低。為了解決上述技術問題，本發明提供一種裂殖壺菌及其高密度發酵生產DHA的方法，進一步提高DHA生產率，以利於裂殖壺菌發酵生產DHA的產業化。本發明提供一株裂殖壺菌,所述菌株為裂殖壺菌sp. )WZU6961,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6369。 上述裂殖壺菌高密度發酵生產DHA的方法，包括如下步驟
1)種子活化a、將所述裂殖壺菌WZU6961轉接入活化培養基的瓊脂平板，加人工海水封蓋，活化，得封蓋海水山、取步驟a得到的封蓋海水轉接入活化培養基，培養；c、取步驟b得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養；d、取步驟c得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養，得活化菌種；
2)種子培養將步驟I)得到的活化菌種轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養，得種子培養物；
3)發酵生產將步驟2)得到的種子培養物轉接入發酵培養基，通入無菌空氣，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L ;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。優選地，步驟1)&中活化條件201 30°C活化2 6 d，更優選為25°C活化4CL優選地，步驟l)b中取步驟a得到的封蓋海水以體積比5% 10%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。更優選地，步驟I) b中取步驟a得到的封蓋海水以體積比5%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm，培養時間48 hr。優選地，步驟l)c中取步驟b得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。更優選地，取步驟b得到的菌種液以體積比10%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm,培養時間 48 hrο優選地，步驟l)d中取步驟c得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。更優選地，取步驟c得到的菌種液以體積比10%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm,培養時間 48 hrο優選地，步驟2)中將步驟I)所得活化菌種以體積比5% 15%的接種量轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養溫度20°C 30°C，通氣量5 50 L/min，攪拌轉速250 450 rpm，培養時間24 60 hr，得種子培養物。更優選地，步驟2)中將步驟I)得到的活化菌種以體積比10%的接種量轉接入種子培養基，培養溫度25°C，通入無菌空氣，通氣量5 50 L/min，攪拌轉速250 450 rpm，培養時間48 hr，得種子培養物。優選地，步驟3)中將步驟2)得到的種子培養物以體積比5% 15%的接種量轉接入發酵培養基，初始攪拌轉速50 450 rpm，通入無菌空氣，初始通氣量5 450 L/min，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。更優選地，步驟3)中將步驟2)得到的種子培養物以體積比10%(v/v)的接種量轉接入發酵培養基，發酵溫度25°C，初始攪拌轉速50 450 rpm，初始通氣量5 450 L/min。流加葡萄糖以維持其濃度在5 10 g/L ;調節通氣量和攪拌轉速以控制DO值低於4% 10%。發酵60 64 hr放罐。優選地，步驟I)中所述活化培養基的配方10 30 g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白腖，用人工海水配製；更優選地，所述活化培養基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白腖，用人工海水配製。優選地，步驟2)中所述種子培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母 粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3 g/L玉米漿，用人工海水配製；更優選地，所述種子培養基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白腖、2 g/L玉米眾,用人工海水配製。優選地，步驟3)中所述發酵培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3 g/L玉米漿，營養液5 15 mL/L ;更優選地，所述發酵培養基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5g/L大豆蛋白腖、2 g/L玉米眾,營養液10mL/L。其中，所述營養液的配方1.5 3. 5 11^凡肌醇、0.05 O. 15 11^凡硫胺素、0.05 O. 15 11^/1鈷胺素、0.05 O. 15 11^/1泛酸鈣、0.05 O. 15 11^/1煙酸、0.05 O. 15 mg/L核黃素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配製。優選地，所述人工海水由如下濃度的成分構成Na2SO4 24g/L、MgSO4 · 7H20 4 g/UK2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 I. 3 g/L、KCl I g/L、CaCl2 · 2H20 0. 34 g/L、FeSO4 · 7H20 20 mg/L、MnCl2 · 4H20 6 mg/L、ZnSO4 · 7H20 6 mg/L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 08 mg/L。本發明能夠達到以下有益效果本發明以裂殖壺菌WZU6961高密度培養生產DHA，裂殖壺菌WZU6961經過多次充分活化後，轉接入種子培養基培養，然後轉接入發酵培養基發酵生產，得到的發酵液中生物量濃度92. 4 103.2 g/L，生物量中DHA含量20. 9% 21. 9%，DHA生產率達到7. 2 8. 5 g/ (L · d)，高於現有技術，有利於裂殖壺菌發酵生產DHA的產業化。
圖I是裂殖壺菌種子培養的生長曲線；
圖2是不同種齡的裂殖壺菌種子培養物的細胞形態(400 X )；
圖3是裂殖壺菌流加發酵的生物量和DHA變化曲線。菌株的保藏
本發明的裂殖壺菌sp. )WZU6961,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6369，保藏日期為2012年7月20日。
具體實施例方式下面結合附圖和具體實施例對本發明作進一步說明，以使本領域的技術人員可以更好地理解本發明並能予以實施，但所舉實施例不作為對本發明的限定。本發明的裂殖壺菌WZU6961高密度發酵生產DHA的方法，包括如下步驟
I)種子活化a、將裂殖壺菌WZU6961轉接入活化培養基的瓊脂平板，加人工海水封蓋，活化，得封蓋海水，活化條件20°C 30°C活化2 6 d。b、取步驟a得到的封蓋海水轉接入活化培養基，培養。具體步驟為，取步驟a得到的封蓋海水以體積比5% 10%的接種量轉接入新鮮的活化 培養基，培養溫度20°C 30°C,培養時間24 48 hr。C、取步驟b得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養。具體步驟為，取步驟b得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉接入新鮮的活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。d、取步驟c得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養，得活化菌種。具體步驟為，取步驟c得到的菌種液以體積比5% 15%的接種量轉接入新鮮的活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。活化培養基的配方10 30 g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白腖，用人工海水配製。2)種子培養將步驟I)得到的活化菌種轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養，得種子培養物。具體步驟為，步驟2)中將步驟I)所得活化菌種以體積比5% 15%的接種量轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養溫度20°C 30°C，通氣量5 50 L/min，攪拌轉速250 450 rpm，培養時間24 60 hr，得種子培養物。種子培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3 g/L玉米漿，用人工海水配製。3)發酵生產將步驟2)得到的種子培養物轉接入發酵培養基，通入無菌空氣，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。具體步驟為，步驟3)中將步驟2)得到的種子培養物以體積比5% 15%的接種量轉接入發酵培養基，初始攪拌轉速50 450 rpm，通入無菌空氣，初始通氣量5 450 L/min，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L ;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。發酵培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3 g/L玉米漿，營養液5 15 mL/L，用人工海水配製，其中，營養液的配方1.5 3. 5 mg/L 肌醇、O. 05 O. 15 mg/L 硫胺素、O. 05 O. 15 mg/L 鑽胺素、O. 05 O. 15 mg/L泛酸鈣、O. 05 O. 15 mg/L煙酸、O. 05 O. 15 mg/L核黃素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配製。以下列舉優選實施例以進一步對本發明進行說明。實施例I
a、將保藏於-70°C的裂殖壺菌WZU6961轉接入活化培養基的瓊脂平板，加適量人工海水封蓋，25°C活化4 d,得封蓋海水。b、取步驟a得到的封蓋海水以體積比5% (v/v)的接種量轉接入新鮮的活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm,培養時間48 hr ;c、取步驟b得到的菌種液以體積比10%的接種量轉接入新鮮的活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm,培養時間48 hr ;d、取步驟c得到的菌種液以體積比10%的接種量轉接入新鮮的活化培養基，培養溫度25°C，搖瓶轉速200 rpm,培養時間48 hr,得活化菌種。其中，活化培養基的配方20 g/L葡萄糖、5 g/L酵母粉和5 g/L大豆蛋白腖,用人工海水配製。人工海水由如下濃度的成分構成Na2SO424g/L、MgSO4 · 7H20 4 g/L,K2H2PO4 2 g/U(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 I. 3 g/L、KCl I g/L、CaCl2 · 2H20 0. 34 g/L、FeSO4 · 7H20 20 mg/L、MnCl2 · 4H20 6 m g/L、ZnSO4 · 7H20 6 mg/L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20 0. 08 mg/L。本實施例中，裂殖壺菌WZU6961分離自浙江省樂清市雁蕩山麓西門島紅樹林，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6369。將活化菌種以體積比10%的接種量轉接入5 L種子培養基，培養溫度25°C，通入無菌空氣，通氣量5 L/min，攪拌轉速450 rpm，培養，得種子培養物。其中，種子培養基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白腖、2 g/L玉米眾,用人工海水配製。裂殖壺菌的種子培養物的生長曲線見圖1，不同種齡的種子培養物的細胞形態見圖2。由圖I可以看出，種齡為24 32 hr的種子培養物進入對數期末期。但是，將種齡為24或32 hr的種子培養物轉接入發酵培養基，發酵過程容易出現不穩定狀態，生長情況經常異常。由圖2可以看出，種齡為48 hr的種子培養物與種齡為24或32 hr的種子培養物的細胞形態明顯不同，而種齡大於48 hr的種子培養物的細胞形態無明顯變化。將種齡為48 hr的種子培養物轉接入發酵培養基，其發酵過程非常穩定。因此，本實施例優選的種子培養物的種齡為48 hr。實施例2
將實施例I得到的種齡為48 hr的種子培養物以體積比10% (v/v)的接種量轉接入5L所述發酵培養基，發酵溫度25°C，通入無菌空氣，通氣量5 L/min，攪拌轉速450 rpm。其中，發酵培養基的配方10、20、30、40和50 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白腖、
2g/L玉米漿，營養液10 mL/L，用人工海水配製。其中，營養液的配方I. 5 3.5 mg/L肌醇、O. 05 O. 15 mg/L 硫胺素、O. 05 O. 15 mg/L 鈷胺素、O. 05 O. 15 mg/L 泛酸鈣、O. 05 O. 15 mg/L煙酸、O. 05 O. 15 mg/L核黃素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配製。裂殖壺菌在不同葡萄糖濃度下的比生長速率列於表I。由表I可以看出，葡萄糖濃度對菌體生長具有抑制作用，低濃度葡萄糖更有利於菌體生長。表I葡萄糖濃度對裂殖壺菌生長的影響
葡萄糖濃度/g/L 比生長速率/hr—1ToO. 153—
20O. 149—
30O. 140—
40O. 133—
50|θ· 126—
考慮到生產過程中葡萄糖檢測的實際問題，優選的葡萄糖維持濃度為5 10 g/L。實施例3
將實施例I得到的種齡為48 hr的種子培養物以體積比10% (v/v)的接種量轉接入5L發酵培養基(發酵培養基的配方30 g/L葡萄糖、10 g/L酵母粉、5 g/L大豆蛋白腖、2 g/L玉米漿，營養液10 mL/L，用人工海水配製)，發酵溫度25°C，通入無菌空氣，初始通氣量5L/min,初始攪拌轉速450 rpm。當葡萄糖濃度降至10 g/L以下時,流加葡萄糖以維持其濃度在5 10 g/L。調節通氣量和攪拌轉速以控制DO值分別維持在4% 10%、10% 20%和
30% 40%ο裂殖壺菌在不同溶氧水平下的發酵結果列於表2。由表2可以看出，在不同溶氧水平下，發酵終止時生物量比較接近；隨著DO值升高，發酵時間縮短，生物量中DHA含量下降，DHA生產率下降，說明高溶氧利於菌體生長而不利於DHA積累。表2溶氧水平對裂殖壺菌發酵生產DHA的影響
權利要求
1.一株裂殖壺菌，其特徵在於，該菌株為裂殖壺菌sp. )WZU6961,保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO. 6369。
2.權利要求I所述的裂殖壺菌高密度發酵生產DHA的方法，其特徵在於，包括如下步驟 O種子活化a、將所述裂殖壺菌WZU6961轉接入活化培養基的瓊脂平板，加人工海水封蓋，活化，得封蓋海水；b、取步驟a得到的封蓋海水轉接入活化培養基，培養；c、取步驟b得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養；d、取步驟c得到的菌種液，轉接入活化培養基，培養，得活化菌種； 2)種子培養將步驟I)得到的活化菌種轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養，得種子培養物； 3)發酵生產將步驟2)得到的種子培養物轉接入發酵培養基，通入無菌空氣，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L ;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。
3.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟I)a中活化條件20°C 30°C活化2 6 cL
4.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟l)b中取步驟a得到的封蓋海水以體積比5% 10%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48hr。
5.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟l)c中取步驟b得到的菌種液體積比5% 15%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。
6.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟l)d中取步驟c得到的菌種液體積比5% 15%的接種量轉接入活化培養基，培養溫度20°C 30°C，培養時間24 48 hr。
7.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟2)中將步驟I)所得活化菌種按體積比5% 15%的接種量轉接入種子培養基，通入無菌空氣，培養溫度20°C 30°C，通氣量5 50 L/min，攪拌轉速250 450 rpm，培養時間24 60 hr，得種子培養物。
8.根據權利要求2所述的方法，其特徵在於，步驟3)中將步驟2)得到的種子培養物按體積比5% 15%的接種量轉接入發酵培養基，初始攪拌轉速50 450 rpm，通入無菌空氣，初始通氣量5 450 L/min，流加葡萄糖以維持其濃度在5 30 g/L ;調節通氣量和攪拌轉速以維持DO值在4% 40%，發酵60 64 hr放罐，即得。
9.根據權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟I)中所述活化培養基的配方10 30g/L葡萄糖、2 8 g/L酵母粉和2 8 g/L大豆蛋白腖，用人工海水配製；步驟2)中所述種子培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3g/L玉米漿，用人工海水配製；步驟3)中所述發酵培養基的配方20 40 g/L葡萄糖、5 15 g/L酵母粉、2 8 g/L大豆蛋白腖、I 3 g/L玉米眾,營養液5 15 mL/L,其中,所述營養液的配方1.5 3. 5 11^凡肌醇、0.05 O. 15 11^凡硫胺素、0.05 O. 15 mg/L鈷胺素、O. 05 O. 15 mg/L泛酸鈣、O. 05 O. 15 mg/L煙酸、O. 05 O. 15 mg/L核黃素、O. 025 O. 075 mg/L生物素，用人工海水配製。
10.根據權利要求2 9任一項所述的方法，其特徵在於，所述人工海水由如下濃度的成分構成=Na2SO4 24g/L、MgS04 ·7Η20 4 g/L、K2H2PO4 2 g/L、(NH4)2SO4 2 g/L、K2SO4 1.3 g/L、KC1 I g/L、CaCl2 ·2Η20 0. 34 g/L,FeSO4 ·7Η20 20 mg/L,MnCl2 ·4Η20 6 mg/L、ZnSO4 ·7Η206mg/ L、CuSO4 · 5H20 4 mg/L、NiSO4 · 6H20 4 mg/L、CoCl2 · 6H20 0. 08 mg/L、Na2MoO4 · 2H20·0.08 mg/Lo
全文摘要
本發明公開了一株裂殖壺菌，該菌株為裂殖壺菌(Shizochytrium sp.)WZU6961，保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.6369。本發明還公開了上述裂殖壺菌高密度發酵生產DHA的方法。以裂殖壺菌WZU6961高密度發酵生產DHA，得到的發酵液中生物量濃度92.4~103.2g/L，生物量中DHA含量20.9%~21.9%，DHA生產率達到7.2~8.5g/(L·d)，高於現有技術，有利於裂殖壺菌發酵生產DHA的產業化。
文檔編號C12N1/14GK102899254SQ20121033801
公開日2013年1月30日 申請日期2012年9月13日 優先權日2012年9月13日
發明者趙肖為, 周茂洪 申請人:溫州大學