京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑的應用的製作方法

2023-07-16 20:31:21 3

京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑的應用的製作方法
【專利摘要】本發明提出了京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，在治療和預防乙醯膽鹼酯酶活性異常的疾病的藥物中的應用。本發明涉及京尼平苷對包括乙醯膽鹼酯酶活性的直接抑制、對培養的神經細胞中乙醯膽鹼酯酶活性的抑制、和對阿爾茨海默病轉基因動物腦內乙醯膽鹼酯酶活性的抑制。京尼平苷可通過上述途徑，但不局限於上述途徑發揮對乙醯膽鹼酯酶活性的抑制作用，京尼平苷可能通過抑制乙醯膽鹼酯酶對阿爾茨海默病有潛在的治療價值。
【專利說明】京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑的應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及京尼平苷的新用途，尤其涉及京尼平苷作為一乙醯膽鹼酯酶抑制劑的應用。
【背景技術】
[0002]阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease, AD)是一種常見、高發的神經退行性疾病。隨著生活條件的改善，AD發病率正逐年增加，已經成為繼腫瘤、心臟病和腦血管病之後引起老年人死亡的第四大病因。臨床特徵表現為持續性認知功能和學習障礙。因為AD的病理特徵包括β樣澱粉蛋白(β-amyloid, Αβ )聚合、沉積形成老年斑和tau蛋白過渡磷酸化形成神經纖維纏結，另外一個典型病理特徵是乙醯膽鹼(Acetylcholine, Ach)水平降低，因此AD的治療策略之一是用乙醯膽鹼酯酶(Acetylcholinesterase, AChE)抑制劑來減少乙醯膽鹼的消耗。
[0003]通常AChE活性在AD病人腦內的大部分區域都是降低的，而實驗發現，老年斑附近的AChE活性反而明顯升高。有人認為AChE的活性異常可能與這種A β的毒性有關。而且AChE還可能加速Αβ沉積，並且與Αβ結合形成複合物，二複合物的毒性比Αβ自身的毒性更大，加速了神經細胞的凋亡。人們用翻譯核酸的方法來抑制AChE活性，發現可明顯減少Αβ誘導的神經細胞凋亡。這對於發展新的AD治療要去提供了新的思路。
[0004]由於乙醯膽鹼 酯酶抑制劑可通過減少突觸間隙乙醯膽鹼降解，增加突觸間乙醯膽鹼的利用，因此人們致力於發現乙醯膽鹼酯酶抑制劑，並開發成為治療AD的藥物。目前人們已從中草藥、微生物代謝產物和化學合成的化合物庫中發現了一些具有較強活性的乙醯膽鹼酯酶抑制劑。其中包括他克林(Tacrine)、多奈哌齊9donepezil)、利斯的明(Rivastigmine)、加蘭他敏(Galantamine)、石杉鹼甲(Huperzine)等,儘管這些化合物對改善早期和中度AD患者的認知功能有一定的作用，然而由於存在各種不良反應，如肝臟毒性、胃腸功能紊亂和口服生物利用度低等，因此其臨床應用受到極大的限制。
[0005]人們目前正致力於從天然產物中篩選、發現並獲得毒副作用小的新型乙醯膽鹼酯酶抑制劑。
[0006]桅子:別名黃桅子、山桅、白蟾，是茜草科植物桅子的果實。目前，桅子的果實是傳統中藥，屬衛生部頒布的第I批藥食兩用資源，具有護肝、利膽、降壓、鎮靜、止血、消腫等作用。在中醫臨床常用於治療黃疸型肝炎、扭挫傷、高血壓、糖尿病等症。
[0007]京尼平苷(結構如附圖1所示)是一種環烯醚萜葡萄糖苷，易溶於水，是桅子的主要藥效成分，其提取方法和產品應用已有大量文獻報導。京尼平苷對消化系統、心血管系統和中樞神經系統疾病均有顯著療效，此外，京尼平苷還有一定的抗炎和治療軟組織損傷的作用。但是有關京尼平苷對乙醯膽鹼酯酶的抑制作用還未見報導。
[0008]在前期研究中，我們應用以Luciferase為報告基因的GLP-1受體激動劑高通量篩選(High throughput screen)模型，發現傳統中藥桅子提取物中存在胰高血糖素I (Glucago-like peptide I, GLP-1)受體激動劑,經過分離純化和與標準品對照證實,京尼平苷(Geniposide)是一種新的GLP-1受體激動劑。京尼平苷可通過激活GLP-1受體,釋放cAMP，並通過MAPK激酶途徑誘導PC12細胞神經樣分化，顯示出神經營養作用；我們還進一步研究發現，京尼平苷能夠通過PI3K、MAPK和PKA信號通路調節抗凋亡蛋白Bcl_2的表達，抑制氧化應激誘導的PC12細胞凋亡，提高細胞活力，表明京尼平苷具有一定的神經保護作用。

【發明內容】

[0009]本發明發現了京尼平苷在醫藥方面的新用途，京尼平苷可在體內外抑制乙醯膽鹼酯酶活性，是一種新的乙醯膽鹼酯酶抑制劑。
[0010]本發明提出了京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，在治療和預防乙醯膽鹼酯酶活性異常的疾病的藥物中的應用。
[0011]本發明進一步提出京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，在治療和預防阿爾茨海默病、唐氏綜合症的藥物中的應用。
[0012]本發明還提出一種治療和預防乙醯膽鹼酯酶活性異常疾病的乙醯膽鹼酯酶抑制劑，所述抑制劑包括治療有效劑量的活性成分京尼平苷以及藥學可接受的載體，所述活性成分京尼平苷的重量百分比為0.0P/0-99.99% ;所述製劑包括片劑、膠囊、注射劑等。
[0013]本發明的「藥學接受的載體」是指製藥上使用的賦形劑或者輔助劑。
[0014]本發明使用的術語「治療有效劑量」是指為要實現其治療作用的活性成分的有效劑量，該劑量通常是以及患者的症狀、年齡、體重、性別、給藥方法、給藥時間與間隔、以及藥物製劑的特性等等而變化。本領域所屬技術人員應理解在劑量方面沒有特性的限制，通常情況下活性成分的給藥劑量約為每天每例患者16-128 mg/天，優選為32-96 mg/天，更優選為40-80 mg/天,通常為I次`給藥。或者,大多數情況下,每日的有效劑量範圍為0.4-1.6mg/Kg體重,優選為0.8-1.2 mg/Kg體重。但是,在某些情況下,有必要使用以上限制之外的劑量，由醫生的處方決定。
[0015]本發明涉及京尼平苷對包括乙醯膽鹼酯酶活性的直接抑制、對培養的神經細胞中乙醯膽鹼酯酶活性的抑制、和對AD轉基因動物腦內乙醯膽鹼酯酶活性的抑制。京尼平苷可通過上述途徑，但不局限於上述途徑發揮對乙醯膽鹼酯酶活性的抑制作用。
[0016]由於AD患者老年斑周圍存在明顯的乙醯膽鹼酯酶活性異常升高現象，而且已有一些乙醯膽鹼酯酶抑制劑對改善AD的認知功能和提高AD患者的學習能力有明顯的作用，因此，京尼平苷可能通過抑制乙醯膽鹼酯酶對AD有潛在的治療價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0017]圖1.京尼平苷的化學結構式；
圖2.京尼平苷抑制乙醯膽鹼酯酶活性的量效關係；
圖3.不同劑量的京尼平苷對培養的神經細胞中AChE活性的影響；
圖4.京尼平苷處理不同時間後神經細胞中乙醯膽鹼酯酶活性的差異；
圖5.京尼平苷對阿爾茨海默病小鼠模型動物腦內乙醯膽鹼酯酶活性的影響。
【具體實施方式】[0018]為了更好的理解本發明的實質，我們在體外、細胞水平和整體動物水平等三個不同層次上分析了京尼平苷對乙醯膽鹼酯酶活性的抑制作用，
實驗材料
APP/PSN轉基因AD小鼠:南京大學模式動物研究所 PC12細胞:購自中科院上海生化所細胞庫 血清、培養基:RPMI1640，Gibco公司 京尼平苷:中國藥品生物製品檢定所 乙醯膽鹼酯酶、碘化乙醯膽鹼和DTNB: Sigma公司 其他化學試劑:Sigma公司 儀器設備
二氧化碳孵育箱=Heraeus公司
倒置顯微鏡:日本Nikon
酶標儀:美國熱電Varioskan
高溫高壓滅菌鍋:T0MYAU0CLAVESS325，Gene公司
離心機:Superfuge, Heraeus 公司
純水儀:美國Millipore公司
低速離心機:Ependof公司
實驗方法
1、PC12細胞培養`
大鼠PC12神經細胞在37° C、5%C02的孵箱中培養，培養基為DMEM補加5%胎牛血清和10%馬血清，100 U/mL青黴素，100 μ g/mL鏈黴素，2-3天換一次培養液，當細胞密度達到80左右時進行傳代。細胞傳代時，先倒盡瓶中的培養基，加入適量的0.25%胰蛋白酶/0.02%EDTA消化，輕輕吹打，以吹散細胞團，取對數生長期的細胞進行實驗。
[0019]2、AChE活性分析
為了考察京尼平苷對AChE活性的直接作用，我們選用經典的Ellman分光光度法體外考察京尼平苷對人乙醯膽鹼酶的抑制作用，並且使用空白組，利斯的明為陽性對照組進行實驗。配置Tris緩衝液pH為7.2，底物碘化乙醯膽鹼(Acetylcholineiodide，ACTI)濃度0.02 mol/L,顯色劑二硫硝基苯甲酸(5，5- dithiobis- (2-nitrobenzoic acid, DTNB)濃度
0.03 mol/L, AChE 總量0.035 Units，京尼平苷濃度0、0.01、0.1、1.0、10 和 100 μ mol/L。
[0020]取Tris緩衝液30 μ L，AChE 20 μ L，各種濃度的抑制劑10 μ L於96孔板中，在37°C下保溫10分鐘後，加入15 4 1^底物4(^1，15 μ L顯色劑DTNB，10分鐘之內用酶標儀在412 nm處讀取每孔吸光度。空白組用15 μ Ls緩衝液分別代替底物和抑制劑，標準組用15 UL Tris緩衝液代替抑制劑。
[0021]抑制率計算公式I =100 X (As 一 A空)/(A標一A空)％
每個實驗至少重複三次，每次設3個復孔求平均值代表蓋茨實驗結果。
[0022]3、京尼平苷對培養細胞中AChE活性的影響
為了考察京尼平苷對培養的神經細胞中AChE活性的影響，我們分別用10 μ M京尼平苷處理細胞0、12、24、48小時，或者用0、0.1、1.0、10和100 μ M京尼平苷處理細胞24小時，隨後收集並裂解細胞，待蛋白定量之後，測定各組細胞中AChE的活性。具體的步驟是:取40 μ L細胞裂解液、40 μ L碘化乙醯膽鹼(6.7 mM，用蒸餾水配置)、20 μ L Ellman溶液(0.15 mM DTNB,用0.1 M的PBS，pH 7.4配置)，混合均勻之後，在10分鐘之內用酶標儀在412 nm處測定吸光值，計算京尼平苷對AChE活性的抑制作用。
[0023]4、京尼平苷對AD轉基因大鼠腦內AChE活性的影響 實驗分組:對照組(7隻)一標「對照(C) 」
低劑量組(7隻)10 mg/Kg京尼平苷——標「低」
中劑量組(7隻)20 mg/Kg京尼平苷一標「中」
高劑量組(7隻)40 mg/Kg京尼平苷一標「高」
給藥方式:受試藥物(灌胃)
給藥量: 受試藥物:每次200微升灌胃 給藥時間:4周，每天I次，
給藥結束之後，麻醉動物斷頭處死，取全腦，勻漿之後，測定其中的蛋白濃度，將蛋白濃度調至相同濃度。測定各組勻漿液中AChE的活性。具體的步驟是:取40 UL腦組織勻漿液、40 μ L乙醯膽鹼(6.7 mM，用蒸餾水配置)、20 μ L Ellman溶液(0.15 mM DTNB,用
0.1 M的PBS，pH 7.4配置)，混合均勻之後，在10分鐘之內用酶標儀在412 nm處測定吸光值，計算京尼平苷對AChE活性的抑制作用。
[0024]實驗結果
1、京尼平苷對AChE活性的直接抑制作用
我們用經典的Ellman法分析了京尼平苷對AChE的直接抑制作用，結果發現，京尼平苷可劑量依賴的抑制AChE活性，經曲線擬合，其IC5tl大約是120 nmol/L.實驗結果如附圖2所示。
[0025]2、京尼平苷對神經細胞中AChE活性的影響
為了考察京尼平苷對培養的PC12神經細胞中AChE活性的影響，我們測定了用不同濃度京尼平苷處理神經細胞24小時和用京尼平苷處理神經細胞不同時間之後神經細胞中AChE的活性，實驗結果表明，京尼平苷可劑量和時間依賴的抑制神經細胞中的AChE活性，實驗結果如附圖3和附圖4所示。
[0026]3、京尼平苷對AD轉基因大鼠腦組織中AChE活性的抑制
為了考察京尼平苷在整體動物水平上對AChE活性的影響，我們在APP/PSN轉基因AD小鼠上考察了京尼平苷對AChE活性的影響，在用京尼平苷連續灌胃給藥4周之後，在麻醉狀態下處死動物，取全腦勻漿，測定蛋白濃度之後，測定不同劑量的京尼平苷對AD模型小鼠腦內AChE活性的差異，結果表明，高劑量組京尼平苷可明顯抑制AD模型小鼠腦內的AChE活性，表明京尼平苷對整體動物模型上的AChE也有一定的抑制作用。實驗結果如見附圖5所示。
[0027]本發明下述實施方案中，下述量的藥物和其它組分是用標準製藥技術合併在一起的。採用標準製藥技術將所得製劑降入膠囊殼體或者壓製成片。
[0028]實施例1:
膠囊製備方法:將京尼平苷和澱粉甘醇酸鈉混合，然後加入十二烷基硫酸鈉水溶液後進行溼法制粒。然後將該溼材料在流化床、乾燥盤或其它適當乾燥器中乾燥。然後可將乾燥的顆粒碾磨，以達到合適的粒徑分布，之後與其它組分混合。然後將該混合物裝入兩片硬明膠膠囊殼體中。
[0029]鉬分毎粒中含量 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸鈉5 mg
含水乳糖71 mg
硬脂酸鎂4 mg
澱粉甘醇酸鈉80 mg
膠囊總重量200 mg。
[0030]實施例2:
膠囊製備方法:用十二烷基硫酸鈉水溶液將京尼平苷和澱粉甘醇鈉制粒，隨後將該溼料在流化床、乾燥盤或其它適當乾燥器中乾燥，然後將乾燥顆粒碾磨，以達到合適的粒徑分布，之後與其它組分混合，最後按重量裝入膠囊殼中。
[0031]鉬分毎粒中含量 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸鈉5 mg
含水乳糖63 mg
滑石4 mg`
膠態二氧化矽4 mg
硬脂酸鎂4 mg
澱粉甘醇酸鈉80 mg
膠囊總重量200 mg。
[0032]實施例3:
片劑製備方法:用十二烷基硫酸鈉水溶液將京尼平苷、澱粉甘醇鈉和微晶纖維素制粒，隨後將該溼料在流化床、乾燥盤或其它適當乾燥器中乾燥，然後將乾燥顆粒碾磨，以達到合適的粒徑分布，將該混合物壓製成片，如果需要，而將這些片劑包衣。
[0033]組^_每片中含暈 京尼平苷40 mg 十二烷基硫酸鈉6 mg 微晶纖維素40 mg 澱粉甘醇鈉60 mg 含水乳糖49 mg 硬脂酸鎂5 mg 片劑總重量200 mg。
【權利要求】
1.京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑的應用。
2.京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，在治療和預防乙醯膽鹼酯酶活性異常的疾病的藥物中的應用。
3.京尼平苷作為乙醯膽鹼酯酶抑制劑，在治療和預防阿爾茨海默病、唐氏綜合症的藥物中的應用。
4.治療和預防乙醯膽鹼酯酶活性異常疾病的乙醯膽鹼酯酶抑制劑，所述抑制劑包括治療有效劑量的活性成分京尼平苷以及藥學接受的載體，所述活性成分京尼平苷的重量百分比為 0.01%-99.99%ο
5.根據權利要求4所述的乙醯膽鹼酯酶抑制劑，其特徵在於，所述製劑包括片劑、膠囊或注射劑。
【文檔編號】A61P25/28GK103860575SQ201410132806
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年4月3日 優先權日:2014年4月3日
【發明者】張永蘭, 劉建輝, 殷菲 申請人:重慶理工大學