豬源糞腸球菌及其在防治母畜各種繁殖障礙疾病方面的應用的製作方法與工藝

2023-07-16 21:34:01

本發明屬於微生物技術領域，更具體地說，本發明涉及一種豬源糞腸球菌、包含該豬源糞腸球菌的微生態製劑及其在防治母畜各種繁殖障礙疾病方面應用。

背景技術：
母畜繁殖障礙疾病，例如不發情、不受孕、流產、死胎、木乃伊胎、產仔數少以及產弱仔死仔等，無論在國內或國外都普遍存在和廣泛流行，造成養殖業嚴重的經濟損失。儘管應用傳統的防治方法，如大量使用抗菌藥物，例如抗生素，收到了良好效果；但是由於長期使用，有時甚至濫用這類藥物，因而造成療效不升反降，且生殖道出現水腫病變現象等明顯的惡果；此外，不為人們注意的耐藥菌株的產生，更是帶來嚴重的後果。近年全球出現的NDM-1超級耐藥細菌正引起全人類的極大關注，因此，歐盟和美國等許多國家都已經從立法上限制了抗生素的使用。在我國，由於近幾年來，不斷出現食品安全的嚴重事件，促使人們時刻警覺，更引起政府的高度重視，採取了一系列重大措施。應用益生菌是很有前途的抗生素代替品，能很好從源頭上保證食品安全，提高人類和動物的免疫力和健康水平。微生態療法正是以一種嶄新的手段解決了傳統療法中存在的多種問題。糞腸球菌是人及動物腸道中正常菌群之一，能抑制一些致病菌的生長繁殖，又能減少氨氣的產生，提高機體抗病能力，是益生菌之一，國內外均有研究報導，但應用於生殖系統的未見提及。

技術實現要素：
基於此，為了克服上述現有技術的缺陷，本發明提供了一種糞腸球菌及其在防治母畜繁殖障礙疾病方面的應用。為了實現上述發明目的，本發明採取了以下技術方案：一種豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，所述豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的16SrDNA序列如SEQIDNO:1所示，所述豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的保藏編號為CGMCCNo.6977。本發明所述的豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)是從深圳市農牧實業有限公司坪山種豬場健康高產的母豬生殖道黏膜和分泌物中經分離培養獲得。該菌培養條件為：1)分離培養基的具體配方為：蛋白腖10±1g/L、牛肉浸膏10±1g/L、酵母浸膏1±0.1g/L、酵母提取粉1±0.1g/L、吐溫801±0.1mL/L、磷酸氫二鉀2±0.2g/L、三水合乙酸鈉5±0.5g/L、檸檬酸三銨2±0.2g/L、七水硫酸鎂0.2±0.02g/L、硫酸錳0.05±0.01g/L。2)培養溫度：37℃。本發明豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)的分子分類地位的確定。該菌株的16SrDNA序列如SEQIDNO：1所示。測序結果與GenBank資料庫中的已知序列進行BLAST比較，從資料庫獲得相關種屬的16SrDNA序列，構建系統發育樹。經過菌種的細胞形態、生理生化特徵、16SrRNA基因序列、pheS基因序列等實驗數據綜合分析得出該菌株屬於腸球菌屬，糞腸球菌Enterococcusfaecalis。本發明還提供了由上述豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)配製而成的微生態製劑。本發明還提供了上述微生態製劑的製備方法，包括以下步驟：將所述的豬源糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)按10-15%的接種量接種於分離培養基中，發酵培養18-22h後，再加入發酵培養物的1‰-5‰的寡糖，混合均勻，即得；所述分離培養基的配方為：蛋白腖10±1g/L、牛肉浸膏10±1g/L、酵母浸膏1±0.1g/L、酵母提取粉1±0.1g/L、吐溫801±0.1mL/L、磷酸氫二鉀2±0.2g/L、三水合乙酸鈉5±0.5g/L、檸檬酸三銨2±0.2g/L、七水硫酸鎂0.2±0.02g/L、硫酸錳0.05±0.01g/L。本發明還提供了上述微生態製劑在防治母畜各種繁殖障礙疾病方面的應用。與現有技術相比，本發明具有以下多種特點：1、本發明所述的豬源糞腸球菌耐熱、耐酸、耐鹼、耐乾燥、抵抗力甚強、遺傳性較穩定，更無任何毒性，又能抑制常見的豬牛8種致病菌。2、將本發明所述的豬源糞腸球菌接種於特製分離培養基中而製成的一種微生態製劑應用於20萬頭次母豬及300多頭奶牛，發現該微生態製劑能促進豬牛精子的活力並延長其壽命，因而淨化了母畜生殖道環境，改善並維持了微生態平衡，保證了正常的生理功能，從而按期發情排卵，提高受精率和產仔數，對防治母畜各種繁殖障礙疾病的應用具有重大的科學意義和很好的經濟效益。本發明菌株糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)已於2012年12月10日保藏於國家知識產權局指定的位於中國科學院微生物研究所的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為No.6977。具體實施方式以下是對本發明的進一步說明，而不是對本發明的限制實施例1豬源糞腸球菌的分離從深圳市農牧實業有限公司坪山種豬場健康高產的母豬生殖道黏膜和分泌物中進行細菌分離，具體分離步驟如下：在無菌條件下，取少量母豬子宮分泌物或黏膜，加入到特製培養基中，充分震蕩後置37℃恆溫箱靜置培養24h後再接種於瓊脂平甲上，挑取單菌落，劃線純化多代，並進行革蘭氏染色，鏡檢。獲得一大批各種細菌，經過毒力測定，篩選純化，最後優選1株無任何毒性的菌株S，命名為糞腸球菌(Enterococcusfaecalis)，已於2012年12月10日保藏於國家知識產權局指定的保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為No.6977。所述分離培養基的配方為：蛋白腖10g、牛肉浸膏10g、酵母浸膏1g、酵母提取粉1g、吐溫801mL、磷酸氫二鉀2g、三水合乙酸鈉5g、檸檬酸三銨2g、七水硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g，配製成1000mL。實施例2實施例1分離得到的豬源糞腸球菌的特性研究1、生理生化特性將菌種的初代次和高代次（96-100代）設置四個重複，經過試驗，多項試驗結果完全一致，也就是說，為革蘭氏陽性，不形成芽孢，不產生接觸酶和氧化酶，能產乳酸，O/F試驗發酵，能利用葡萄糖、甘露糖、松三糖、果糖、核糖、苦杏仁素、海藻糖、纖維二糖、木糖、麥芽糖、乳糖、棉子糖、山梨糖、山梨醇、蜜二糖、半乳糖、甘露糖、甘露醇、阿拉伯糖、水楊素、葡萄糖酸鈉及蔗糖等20種碳水化合物產酸，而對葡萄糖酸鈉還能產氣，但對葡萄糖則不產氣；此外不能利用七葉靈和鼠李糖，全部陰性，由此初步顯示菌種其低代次和高代次未明顯差異，因而其遺傳特性是相對穩定的。具體見表1所示。表1菌種的生理生化特徵以及形態特徵2、耐酸耐鹼性能將糞腸球菌的菌種接種於液體分離培養基(同實施例1，下同)中，經過22小時培養（菌種濃度達到242億個/毫升），再分別接種於pH3.0、pH3.5、pH4.0、pH6.5、pH7.5、pH8.5及pH9.5等7種不同pH的液體培養基中，連續22小時，然後應用倍比稀釋培養法檢測，結果顯示菌株在pH3.0（約4.5萬個/毫升）到pH9.5（約194億個/毫升）均能生長，只是不同程度受到抑制，由此可見其耐酸耐鹼性甚強，只是最適宜的是pH7.5，此時生長最旺盛，活菌數最多(約為326億/毫升)。3、耐高溫性能將菌種接到培養基試管中，另一支培養基作為對照管，同時放入80℃、85℃及90℃恆溫培養箱中，等對照試管達到要求溫度時，計時10分鐘，然後將含菌試管放入冷水中，冷卻至室溫時，分別吸取100uL菌液均勻分散於平皿上，然後置於37℃培養24小時，再觀察活菌數，結果菌株在80℃時尚有活菌4003個/毫升，85℃時無法計算，90℃時還活著413個/毫升。由此可見糞腸球菌在90℃作用10分鐘的高溫情況下尚有部分存活。4、抗乾燥、缺營養特性將糞腸球菌S接種於石臘油半固體瓊脂中，置普通冰箱（4℃）存放，菌株經過13年又61天後，此時培養基已十分乾燥，但重新培養時，發現菌株仍然存活，因此該菌株具有抗乾燥、缺營養特性很強。5、毒性性能將菌種分別通過皮下、肌肉、腹腔和子宮內等多種方法途徑，接種於豬兔及各種年齡的小白鼠（包括2天齡乳鼠及懷孕母鼠）總數在500頭（只）以上，結果所有試驗動物均未見不良反應，孕鼠未發現流產，所有試驗動物的注射部位不產生炎症變化，後來還將兔的子宮黏膜經組織切片鏡檢亦未見任何異常，更沒有引起試驗動物死亡的情況，甚至在小白鼠體內連續傳代6次，亦未發現任何毒性。6、產性激素類物質的性能將稀釋好的豬精液分裝於4支試管中，每管2mL，其中2管加入菌液0.2mL，另2管加入精子稀釋液以作對照，各取1管分別分別置於室溫及4℃冰箱中，每隔6-24小時檢查一次，觀察精子活力情況。檢查時將各管稀釋液滴於血球計數板上，看其活動強弱及死亡情況。詳見表2所示：（表中分母為每個視野精子總數、分子為活精子數）表27、抑致病菌性能將菌種分別與定量不同菌株的致病菌，包括大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、沙門氏桿菌、克雷伯氏菌、嗜水氣單胞菌、變形桿菌及綠膿桿菌等，同時混合培養於相應適宜的肉湯培養基中，或將菌種在分離培養基培養一定時間後，再將不同分量致病菌混合後同時培養於相應適宜的肉湯培養基中，採取兩種方法，該菌種能在24-72小時內抑制致病菌生長。當加大致病菌用量時，抑制時間隨著致病菌數量加大則有所推遲，直至48-72小時才能完全抑制。該菌種能抑制豬牛常見的8種致病菌，抑菌作用機理主要有兩點：一為產酸，所有培養液在接種細菌後，其pH發生很大改變，由最初的pH7.6迅速下降至pH3.5-pH4.0，故而受到抑制；其二為產生了細菌素，故而抑制致病菌。8、耐藥性性能將菌株應用常規的藥物敏感試驗方法對常見的12種抗生素進行了檢測，結果對頭孢吡肟、環丙沙星、阿莫西林、四環素、諾氟沙星、氨苄西林及氧氟沙星等7種均在中敏到高敏之間，而對氯黴素則屬低敏；但對苯唑西林、紅黴素、慶大黴素及阿米卡星等4種卻有很強的耐藥性。具體結果見表3所示。表3實施例3實施例1分離得到的豬源糞腸球菌的在防治母畜繁殖障礙疾病方面的應用將實施例1分離得到的豬源糞腸球菌接種於發酵培養基中(接種量是10-15%，發酵培養時間為18-22h)，經發酵的培養物混合均勻,再加入1‰-5‰的寡糖配製成一種微生態製劑，定名為宮康寶（素）、並進行了下列應用試驗：1、對東莞市食出公司某一豬場的300多頭產後母豬用宮康寶（素）(用量為10-20mL/頭)注入子宮作預防試驗，結果對產道炎症發病率從原來的35%下降到5%左右，母豬的各項繁殖性能有了較大的提高，平均產仔數達到10.37-10.95頭，產仔合格數達9.19-9.70頭，兩者均比原來提高0.5頭。2、對東莞市食出公司另一豬場的430頭母豬產後應用宮康寶（素）(用量為10-20mL/頭)，有96.74%能有效防止子宮炎，促進母豬及時發情並提早1-1.5天發情；第一情期發情率達97.7%，受胎率達92.6%。3、在廣州某一種豬場進行試驗，對流產的母豬31頭，在流產後第一天全部注射青黴素和鏈黴素，於第三天分成2組，1組21頭，每頭灌注宮康寶（素）20毫升，另1組10頭則灌注生理鹽水20毫升，以作對照。兩組母豬均於流產後第二個情期進行配種，結果治療組的分娩率為95.23%，產仔數平均每胎10.65頭，明顯高於對照組的70%和7.71頭仔豬。4、東莞市一出口豬場，在選擇胎齡相近，飼養管理基本相同的條件下，將620頭母豬分為二組，Ⅰ組320頭，在每次分娩後都使用宮康寶（素）(用量為10-20mL/頭)一次，Ⅱ組300頭留作對照。經過一年時間的觀察，Ⅰ組的受胎率（92.6%）比Ⅱ組（90.3%）高2.3個百分點，分娩率（分別為87.8%、83.2%）高4.6個百分點，胎產總仔數（分別為10.8頭/胎、10.28頭/胎）高0.52頭/窩；頭母豬年產仔數（分別為21.9頭/年、20.45頭/年）多1.45頭/年。5、根據深圳市某原種豬場一年時間的試驗觀察，對500頭純種母豬在產後24小時內使用宮康寶（素）(用量為10-20mL/頭)的統計結果，在離奶後第一個發情期，其發情率就達90%以上；而復發情只佔0.2%，因子宮炎和不發情而淘汰的亦僅為2%。6、廣州市某研究所使用宮康寶（素）(用量為50mL/頭)治療患子宮內膜炎的奶牛45頭，進行一個療程，治癒36頭，好轉9頭，治癒率80%，總有效率100%。愈後36頭均能按期發情配種受胎，而對照的5頭都能分離出致病菌，其中4頭還見濃性分泌物排出。因此，本發明的申請人在20萬多頭次母豬和300多頭奶牛的子宮中應用本發明的微生態製劑宮康寶（素），結果表明，本發明的微生態製劑對防治母畜繁殖障礙疾病，淨化生殖道環境、保持菌體生態平衡，改善生理功能，促進正常發情排卵、提高受精率和產仔數都起了很好的作用。以上所述實施例僅表達了本發明的幾種實施方式，其描述較為具體和詳細，但並不能因此而理解為對本發明專利範圍的限制。應當指出的是，對於本領域的普通技術人員來說，在不脫離本發明構思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬於本發明的保護範圍。因此，本發明專利的保護範圍應以所附權利要求為準。