自浣熊分離犬細小病毒-2相關病毒的製作方法

2023-07-14 08:18:06 2

專利名稱：自浣熊分離犬細小病毒-2相關病毒的製作方法
自浣熊分離犬細小病毒-2相關病毒序列表
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發明背景 發明領域。本發明總體上涉及針對犬細小病毒類似病毒(canine parvovirus-like virus)的改良疫苗。具體而言，本發明提供適於幼犬的疫苗，所述疫苗基於分離自浣熊的新型細小 病毒。
背景技術：
犬細小病毒(CPV)主要是感染狗、尤其是幼年狗的腸道病原體。細小病毒在狗和大於4-5周齡的幼犬中的感染特徵為急性腹瀉、發熱和白細胞減少症；在更小的幼犬中的感染特徵為心肌病。在未接種疫苗的狗中，該病的死亡率極高。儘管可得到針對CPV的疫苗，但因為CPV是單鏈DNA病毒並具有極強的變異能力，所以該病毒顯示出改變其抗原性的顯著的能力(Parrish和Kawaoka 2005),從而逃避由疫苗所提供的免疫保護。因此,持續監測流行病毒的抗原型和基因型並相應地調整疫苗組分很有必要。新生幼犬通過其母親哺乳來獲得抵抗疾病例如CPV感染的免疫力，尤其是在生下來後的頭兩天。哺乳的幼犬攝入最早產生的乳汁即初乳，初乳中的抗體傳給幼犬。對於狗以及很多其它哺乳動物，初乳所給予的免疫力在大約第五周齡時失去其影響。給幼犬接種疫苗時的一個特殊挑戰是根據提供保護的時間範圍給予疫苗，此時間範圍要與母體抗體提供保護的時間重疊並要始於母體抗體衰弱。當前，幼犬的疫苗方案通常從約6周齡開始,此後約每3周加強免疫(booster) —次,例如在9、12和15周。然而，為使本方案提供充分保護，首次疫苗劑量必須能立刻引起保護性免疫應答。由於幼犬免疫系統的不成熟和產生免疫應答必需的時間周期，這完全是不切實際的。充分保護通常要直到給予整個疫苗接種過程後才能發揮。CPV導致的基於年齡的死亡率示於

圖1，其顯示CPV導致的最大死亡率發生在疫苗方案完成之前。簡單的答案可能是在甚至更早例如在2-3周時開始疫苗接種程序。然而，這將是無效的，因為對於幼犬，其母親已經接種過疫苗或以其它方式暴露於具有相同抗原決定簇的病毒株，傳給幼犬的母體抗體將會中和疫苗中的病毒，從而阻止幼犬自身免疫系統對病毒的應答。獸醫學中另一個挑戰是癌症的治療,例如狗的癌症治療。用於癌症治療現有工具有很多局限，尤其是對老年狗。給予溶瘤細小病毒來殺死癌細胞，作為有效的癌症治療顯不巨大前景(Rommelaere 等，<9 & Growth Factor Reviews 21:185-195，2010 ;和Rommelaere等的美國專利號7，179，456，其全部內容通過引用併入本文)，並可能應用於犬類。然而，針對細小病毒的已有抗體的存在(例如由於接種疫苗)將致使這種方法失效，因為細小病毒會被既有抗體中和。另外，目前很少進行狗的基因治療，但如果確定了合適的核酸載體，這將是用於治療數種病症的有前景的方法。迄今為止，現有技術無法提供對這些問題的解決方法。發明概述
本發明基於新型細小病毒(分離自美國的浣熊)的發現。核苷酸和胺基酸序列分析表明，所述病毒代表犬細小病毒2型(CPV-2)的一個獨特變異株。這種命名為「AR08071304」 (本文也稱為浣熊細小病毒、「RPV」、「08071304」和「細小病毒-2 (浣熊)」等)的新型CPV-2可用作針對犬細小病毒的疫苗的組分。具體而言，所述變異株可用作針對非常幼小的狗(例如仍處於哺乳期或正在斷奶過程中的幼犬)的疫苗組分，因此解決了如何提供適當的幼犬疫苗方案的問題。該浣熊細小病毒不會被狗中既有犬細小病毒-2抗體完全中和。另外，由於受體或宿主生物例如狗中已有抗體中和作用的缺失，該浣熊細小病 毒可用作基因治療的溶瘤劑和載體(vector)(載體(carrier)、溶媒)。所述病毒變異株與目前流行的主要CPV-2病毒有相近的同源性。因此，給予含有所述新變異株的疫苗可能導致也提供針對已知流行CPV-2病毒的保護的免疫應答。然而，新分離株(isolate)與可能已暴露於母親狗的(例如通過疫苗製劑或先前CPV暴露)已知的CPV-2病毒之間有一些抗原性差異。具體而言，變異株衣殼蛋白VP-2的第232位胺基酸殘基是Thr (由ACA編碼)，第300位胺基酸殘基是Asp (由GAT編碼)。這些序列上的差異足以導致變異株獨有的免疫反應概況(profile)。因此，當將新型病毒作為疫苗給予幼犬時，傳給幼犬的母體抗體(例如來自先前接種過/已被暴露的母親)不大可能完全使其失活。因此，幼犬自身免疫系統的免疫應答將會經由免疫接種在暴露於本發明RPV時而被引發，且免疫應答可能對目前流行的CPV普遍有廣泛的保護性。此外，該浣熊細小病毒似乎是食肉動物細小病毒的天然嵌合體。雖然編碼RPV VP-2蛋白的核苷酸序列與犬細小病毒-2a (CPV-15)具有最高的總同源性得分(3309)，但它與貓泛白細胞減少症(felinepanleukopaenia)病毒、早先分離的綜熊細小病毒和水紹腸炎病毒(mink enteritisvirus)也有很高的同源性。這類嵌合序列先前並未在犬或貓細小病毒序列中觀測到，但現在相似的細小病毒似乎在美國的浣熊種群中流行(參見以下實施例部分)。這種RPV將為數種食肉動物物種提供廣泛的免疫保護，因此適於用作廣譜細小病毒疫苗。在罕見的不同尋常的情況下，狗或貓可能死於感染異源非減毒食肉動物的活細小病毒；然而，本文所述使用本發明RPV的好處遠遠超過這個最小風險。雖然本發明不以任何進化模型或理論為前提，但對本文公開的遺傳數據的一個有趣解釋是，本發明的RPV可能代表當今犬和貓細小病毒的祖先。病毒學界關於狗細小病毒-2的起源一直有爭論，在該理論範圍內，本發明的RPV應是犬細小病毒-2的「活化石」。不管怎樣，本文所述RPV編碼一種獨特的VP-2蛋白，該蛋白包含貓和犬細小病毒胺基酸序列的嵌合體。因此，本發明的RPV是貓和犬細小病毒二者「祖先」的候選者，即這些後面出現的食肉動物細小病毒起源於這種RPV。或者，本發明的RPV可能代表細小病毒進化「交叉點」的嵌合中間體。不管怎樣，這種RPV提供針對異源細小病毒的交叉免疫的途徑，否則用更多物種中的任一種-特化的犬和貓細小病毒，目前不能獲得所述交叉免疫途徑。此外，本發明的RPV微弱地凝集豬紅細胞(轉鐵蛋白)；不共享一些關鍵性表位(例如VP-2蛋白序列的第300位胺基酸殘基)；和在貓腎臟細胞系中生長不好(參見以下實施例)。總之，這些標誌與在時間上居先的病毒相一致，或是犬和貓細小病毒進化級聯的早期中間體。
本發明提供包含ATCC編號PTA-11400的細小病毒_2 (浣熊)特徵的細小病毒。另夕卜，本發明提供包含細小病毒的疫苗，所述細小病毒包含具ATCC編號PTA-11400的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。在一個實施方案中，所述疫苗進一步包含選自以下的一種或多種抗原組分犬瘟熱病毒(CDV)、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬輪狀病毒、鉤端螺旋體H印tospira)的一種或多種血清變型和其中VP-2蛋白的第232位胺基酸不是Thr及VP-2蛋白的第300位胺基酸不是Asp的犬細小病毒_2。在一些實施方案中，所述鉤端螺旋體的一種或多種血清變型選自以下問號鉤端螺旋體犬型血清型interrogans serovar、問號鉤端螺旋體黃痕出血型 {Leptospira interrogans serovar icteroAaefflorrAagiae)、問號鉤端螺方定體波莫那型血清型^Leptospira interrogans serovar pomona)和基氏鉤端螺旋體感冒傷寒型血清型{Leptospira kirschneri serovar grippotyphosa)。本發明亦提供包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的部分的分離核酸；其中SEQ ID NO: I的部分編碼包含以下胺基酸殘基的VP-2蛋白的抗原區SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基兩者。在其它實施方案中，本發明提供包含該核酸的免疫原性組合物，其中所述核酸存在於殺死的或減毒的細小病毒顆粒或低代數浣熊細小病毒(RPV)中。在一些實施方案中，所述殺死的細小病毒顆粒包含具ATCC編號PTA-11400的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。在其它實施方案中，所述減毒的細小病毒顆粒存在於適於舌上溶解的固態載體中。在又其它實施方案中，免疫原性組合物適於皮下給予。本發明亦提供引發動物抵抗細小病毒感染的免疫應答的方法。所述方法包括將包含核酸的免疫原性組合物給予動物的步驟，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的部分；其中所述SEQ ID NO: I的部分編碼包含以下胺基酸殘基的VP-2蛋白的抗原區SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基二者。在一些實施方案中，所述核酸存在於殺死的或減毒的細小病毒顆粒中或者存在於被殺死的或減毒的細小病毒顆粒中的低代數RPV中。在一些實施方案中，所述被殺死的細小病毒顆粒包含具ATCC編號PTA-11400的細小病毒_2(浣熊)的特徵。在一些實施方案中，所述減毒的細小病毒顆粒存在於適於舌上溶解的固態載體中，並且在一些實施方案中，所述動物是幼犬。在其它實施方案中，所述免疫原性組合物適於皮下給予。本發明進一步提供基本上純化的細小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，所述蛋白第232位胺基酸為蘇氨酸殘基，第300位胺基酸為天冬氨酸殘基；其中所述抗原性片段至少包含所述VP-2蛋白的部分，所述部分具有在第232位胺基酸的蘇氨酸殘基；或在第300位胺基酸的天冬氨酸殘基；或在第232位胺基酸的蘇氨酸殘基和第300位胺基酸的天冬氨酸殘基二者。在一些實施方案中，所述基本上純化的細小病毒VP-2蛋白包含胺基酸序列SEQID NO: 3。本發明亦提供包含編碼SEQ ID NO: 3或SEQ ID NO: 3的部分的胺基酸序列的核苷酸序列的表達載體；其中所述SEQ ID NO: 3的部分是包含以下胺基酸殘基的VP-2蛋白的抗原性區域SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基兩者。在一些實施方案中，所述表達載體是重組病毒表達載體。在其它實施方案中，所述重組病毒表達載體是金絲雀痘病毒表達載體。本發明亦提供殺死哺乳動物中腫瘤細胞的方法。該方法包括將包含足以感染和殺死哺乳動物中所述腫瘤細胞的量的細小病毒的組合物給予哺乳動物的步驟，其中細小病毒包含ATCC編號PTA-11400的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。在一些實施方案中，所述哺乳動物是對於犬細小病毒-2血清反應陽性的狗。在其它實施方案中，所述方法通過選自靜脈內和瘤內的給藥途徑來實施。在又其它實施方案中，所述細小病毒是低代數的細小病毒。圖I. CPV-2基因型分布和就狗年齡而言的CPV感染致死案例數量。圖2A和B.編碼新型AR08071304 CPV-2變異株的VP-2蛋白的核酸序列。A，核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的較長形式，其編碼含599個胺基酸的蛋白質。位於第1753-1755 位核苷酸的內部終止密碼子以粗體和下劃線表示。B，核苷酸序列(SEQ ID NO: I)的較短形式，其編碼含584個胺基酸的蛋白質。在A和B兩者中，編碼第232位(核苷酸第694-696位)Thr的核苷酸和編碼第300位(核苷酸第898-900位)Asp的核苷酸都帶下劃線。圖3A和B.新型AR08071304 CPV-2變異株的VP-2蛋白的胺基酸序列。A. (SEQID NO: 3)為全部599個編碼胺基酸均被翻譯的較長形式的蛋白質；B，(SEQ ID NO: 4)為在終止密碼子處發生終止的較短形式的蛋白質。兩種蛋白質中分別為Thr和Asp的第232和300位胺基酸均加框。圖4A-C.以下的示意圖A，浣熊細小病毒(RPV) DNA ；B, RPV開放閱讀框排列；C，RPV與真核細胞的結合。圖5A和B. A，浣熊細小病毒與細胞表面轉鐵蛋白受體(TFR)結合的示意圖；B，製備自主性細小病毒載體的一般策略的不意圖。圖6.新近分尚的澱熊細小病毒與其它類似病毒的關聯性。圖7.新近分離的浣熊細小病毒的VP-2蛋白中處於關鍵表位的胺基酸。圖8.比較新近分離的浣熊細小病毒的VP-2蛋白與其它食肉動物細小病毒的VP-2蛋白的系統發育樹。CPV =犬細小病毒；RPV =浣熊細小病毒；FPV =貓細小病毒；PV=細小病毒；MEV =水貂腸炎病毒；FPL =貓泛白細胞減少症病毒；Aleu =阿留申水貂病細小病毒(Aleutian mink disease parvovirus) ；MVC =犬微小病毒(minute virus ofcanine)。詳述
本發明提供包含分離自受感染浣熊的新型細小病毒變異株的減毒形式的疫苗和病毒治療製劑。雖然所述疫苗製劑適於給予各種各樣的食肉動物(例如狗、貓、水貂、浣熊及犬科(canidae)、綜熊科(procyonidea)、融科(mustelidae)和靈貓科(viveridae)成員等)，但其特別可用於給予很年幼的狗(幼犬)。這是因為新型變異株與現有疫苗中所用的CPV變異株迥異，以致使母體抗體(對給予疫苗的應答而產生並在哺乳期傳給幼犬)不大可能識別和滅活病毒。同樣地，對包括成年狗在內的狗中的其它應用(例如作為癌症治療和作為基因治療載體)，RPV將避開來自早先疫苗接種的先前存在的抗體，因此逃避即時的免疫清除。要注意的是，在浣熊分離株的VP-2蛋白中，第232位胺基酸殘基是Thr (由ACA編碼)，而第300位殘基是Asp (由GAT編碼)。因此，RPV中這兩個胺基酸殘基與其它所有已知CPV分離株的VP-2蛋白的所述胺基酸殘基完全不同，這可能是造成該RPV的獨特特性(例如抗體反應性，參見以下實施例)的原因。由於減毒，病毒不會導致疫苗受體患病。另一方面，新型分離株與當前流行的病毒足夠相似(例如VP-2蛋白的胺基酸序列一致性為約99%)，換言之，將所述病毒給予年幼動物很可能會導致抗體的產生，至少其中一些抗體會與已知流行病毒交叉反應，從而為接種疫苗的年幼動物提供抵抗那些病毒的保護作用。本文所述核酸序列(SEQ ID NO: I)包含在1753-1755位核苷酸的內部終止密碼子(見圖2A)。因此，由此翻譯的VP-2蛋白有兩種不同形式。一種形式如圖3A (SEQ ID NO3)所示，由終止密碼子的通讀(「讀漏(leakiness)」)造成，因此比圖3B所示的終止於終止密碼子的第二種形式更長(599個胺基酸)。所述蛋白的第二種形式只包含584個胺基酸(SEQ ID NO: 4)。第一種形式，即VP-2的較長形式，終止密碼子未被翻譯而被「跳過」，導致產生599個胺基酸的蛋白質。本文所用術語「VP-2」蛋白既包括VP-2的第一種較長形式，也包括VP-2的第二種較短形式，在本發明實踐中，兩種形式的蛋白質都可能被使用。這兩種形式的蛋白質可用蛋白質印跡檢測。另外，在本發明實踐中，可使用兩種核酸序列(SEQID N0S: I和2)，例如，序列之一或兩者都可用於疫苗製劑、用於載體等。在一些實施方案中，胺基酸序列SEQ ID NO: 3由核苷酸序列SEQ ID NO: I編碼。在其它實施方案中，胺基酸序列SEQ ID NO: 4由SEQ ID NO: 2編碼。在本發明又其它實施方案中，可通過終止密碼子的消除(缺失)(例如通過基因工程)來修飾SEQ ID NO: 1，以便由此翻譯胺基酸序列SEQ ID NO: 3。這種新型RPV也可充當其它動物和人感染的適當加強免疫的模型。例如，基於可利用的信息，在人流感(HlNl)中，疫苗應答視已有抗體的存在而變化。如果人具有已有抗體，效價不會上升但抗體親和性會增加。如果人不具有已有效價，那麼這個人會形成中和保護性免疫的應答。所述新型分離株於2010年10月7日以俄克拉荷馬州立大學的名義作為細小病毒-2 (浣熊)保藏在維吉尼亞州馬納薩斯的美國典型培養物保藏中心(2010年10月12日收到ATCC的收到確認)，指定ATCC保藏號PTA-11400。本發明亦提供包含ATCC保藏號PTA-11400特徵的分離的細小病毒及其後代。本發明進一步包括包含於2010年10月7日保藏的ATCC保藏號PTA-11400特徵的殺死的或減毒的細小病毒及減毒的細小病毒的後代， 以及包含上述病毒的疫苗和免疫原性組合物。本發明亦提供在伊利諾州分離並在CRFK中繁殖的其它RPV。(10071199-A和10071199-C)，其部分序列在實施例部分給出。因此，本發明亦包括在美國(例如在阿肯色州和伊利諾州)流行的浣熊細小病毒，其共同特徵在於它們不與犬細小病毒單克隆抗體(MoAb) 3B10反應，MoAb最常用於診斷。3B10特異針對VP-2的第300位胺基酸，其通常為甘氨酸。因此，這些RPV的VP-2在第300位胺基酸具有突變，所述突變包括在該MoAb足跡之內並阻止MoAb識別所述蛋白。另外，這些病毒與其它食肉動物細小病毒-2的VP-2具有約98%的同源性。然而，可以完全確認，即使只是關鍵位點的少量突變也可對病毒特性產生巨大影響(例如參見Qu等2005，其中闡述了冠狀病毒刺突蛋白兩個關鍵胺基酸殘基的突變改變了其向性)。該病毒(例如參見實施例I和5)的系統發育研究表明該RPV [細小病毒-2 (浣熊)]與犬CPV-2親緣很近，事實上可能是犬CPV-2的變異株。照此而論，家養的成年狗也可能對所述病毒敏感，並可能受益於接受包括該變異株的疫苗。由於浣熊的行為特徵，將新近分離自浣熊的細小病毒傳播到家養寵物例如狗和其它野生動物有可能發生。例如，浣熊智力高，很快適應新的食物來源。它們是雜食性的，視季節和可獲得性而定，以各種各樣的植物和動物為食。由於它們對城市地區的迅速融入和適應，浣熊通常與家養狗和貓相互交流並親密接觸。浣熊有出色的領悟能力，能容易地學習，例如打開容器，找出和打開儲存的動物性食品等。由於這種行為，它們可能能夠將細小病毒傳播給家養食肉動物。浣熊也與其它野生動物例如臭鼬相互交流，因此也有種間相互交流和傳播細小病毒的可能性。因此，成年狗和其它家養寵物將受益於接受包括本文所述浣熊病毒的疫苗，即使它們以前接種過另一細小病毒疫苗；而其它物種無論家養與否，也將受益於接受所述疫苗。益處是雙重的1)接種疫苗將提供對感染這種特定CPV的免疫力；和2)這種CPV與其它細小病毒足夠相似(例如與其它食肉動物細小病毒約99%的同源性)，接種疫苗也將可能引發和加強至少一些針對其它細小病毒的免疫力。在一些實施方案中，本發明的疫苗和免疫原性組合物本質上是單價的，即包含單一藥劑，其為本文所述細小病毒分離株(例如帶有細小病毒-2 (浣熊)的特徵，其為於 2010年10月7日保藏的ATCC保藏號PTA-11400)，或本文所述分離株的減毒或殺死的形式，或這些中任一種的後代。在其它實施方案中，所述疫苗和免疫原性組合物是多價的，即它們包含多種抗原劑，其中一種是本發明的分離株。多價組合物的示例性另外成分包括但不限於以下的一種或多種犬瘟熱病毒(CDV);犬腺病毒2型；犬副流感病毒；犬冠狀病毒；犬皰疹病毒；犬輪狀病毒；一種或多種鉤端螺旋體血清變型；和其VP-2基因序列不同的犬細小病毒-2，即其VP-2蛋白第232位胺基酸不是ThrJP /或VP-2蛋白第300位胺基酸不是Asp,或其中編碼VP-2蛋白第232位胺基酸Thr的密碼子不是ACA，和/或編碼VP-2蛋白第300位胺基酸Asp的密碼子不是GAT。示例性的CDV包括但不限於作為US2010/0196420發布的美國專利申請12/696,983 (Kapil)所述的⑶V，其全部內容通過引用併入本文。示例性的鉤端螺旋體血清變型包括但不限於問號鉤端螺旋體犬型血清型、問號鉤端螺旋體黃疸出血型血清型、問號鉤端螺旋體波莫那型血清型和基氏鉤端螺旋體感冒傷寒型血清型。此夕卜，本發明分離株可能與多種不同抗原聯合，例如那些已知多價疫苗，例如Galaxy DA2PPV或 Nobivac DA2PPv + L4 等。在特定實施方案中，本發明疫苗的受體是幼年動物(例如幼犬)，給予的方式是經由「幼犬棒棒糖」。用於將疫苗組合物給予年幼狗(或其它物種的幼體)的幼犬棒棒糖，在Kapil等於2010年7月15日提交的同時待審PCT申請號PCT/US2010/042142中有詳細描述，其全部內容通過引用併入本文。簡言之，幼犬棒棒糖或類似裝置用於將疫苗遞送到舌頭的背側，即舌上。具體而言，疫苗製劑以將疫苗遞送到舌基底細胞或鄰近舌基底細胞的方式來給予。基底細胞受疫苗中的減毒細小病毒感染，建立抗原庫(例如病毒貯庫)，抗原庫在幼犬中逐漸地、隨時間推移從非常年幼時開始釋放減毒細小病毒。這種方法利用了舌頭是相對免疫免除的(缺乏免疫應答)的事實。例如，疫苗可能包括在手握「幼犬棒棒糖」中，其由照料者舌上給予，例如通過手持已放入幼犬口內的附著有固體疫苗製劑的棍、線或其它遞送溶媒來給予。固體製劑包括固體惰性載體；且細小病毒分散或遍布於固體載體中，通過幼犬先天性吸吮反應逐漸溶解載體，並將細小病毒釋放到舌。在一個實施方案中，本發明包含具以下核苷酸序列的核酸和包含所述核酸的疫苗編碼RPV的VP-2蛋白的核苷酸序列，所述核苷酸序列例如在SEQ ID NO: I或者SEQ IDNO: 2 (參見圖2A和B)中所展示；或編碼足以引發疫苗受體產生對RPV的免疫應答的抗原區或表位的核苷酸序列的部分。具體而言，所述核酸序列將包括編碼VP-2蛋白的第232位和第300位的密碼子中的一個或兩個。這些密碼子分別為ACA和GAT，分別編碼Thr和Asp。在另一個實施方案中，本發明包含具以下核苷酸序列的核酸和包含所述核酸的疫苗編碼VP-2蛋白的核苷酸序列，所述VP-2蛋白包含如SEQ ID NO: 3 (或者，包含在SEQ IDNO: 3之內的SEQ ID NO: 4，參見圖3A和B)所展示的胺基酸序列，或如SEQ ID NO: 3所展示的胺基酸序列的部分，其包括足以引發疫苗受體對抗原區或表位產生免疫應答的抗原域或表位。具體而言，所述蛋白或其部分將包括RPV VP-2蛋白的分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個。本發明亦包括如本文所述的所述序列的變體和/或衍生物，和包括變體和/或衍生物的疫苗製劑。例如，本領域技術人員可認識到，由於遺傳密碼的冗餘，可利用非SEQ ID NO: I的序列來編碼SEQ ID NO: 3所展示的胺基酸序列。另外，儘管SEQ ID NO: I所展示的核苷酸序列代表單鏈(ss)DNA，但本發明亦包括基於、來源於或互補於這些序列的相應的雙鏈(ds) DNA、互補DNA和任何形式的RNA (例如mRNA、·RNA/DNA雜交鏈等)。所述序列既可能是有義序列也可能是反義序列。另外，只要序列編碼分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個，以下序列亦預期用於所述疫苗中顯示出與SEQ ID NO: I至少約50%的同源性的序列，優選約60%，更優選約70、80或90%的同源性，甚至約95、96、97、98、99%或更高的同源性的序列。所述序列可能因例如在一個或多個位置含有編碼同一胺基酸的替代密碼子而不同。另外，亦預期編碼AR08071304 VP_2蛋白抗原區或表位的這些序列的部分。具體而言，預期包括編碼分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個的密碼子的核苷酸序列。在一個實施方案中，編碼第232位Thr胺基酸殘基的密碼子是ACA，編碼第300位Asp殘基的密碼子是GAT。另外，亦包括編碼表現出與SEQ ID NO: 3有70%或更優選約80、90或95%或甚至更高的同一性(例如96、97、98或99%的同一性)的胺基酸序列的序列，只要所述序列編碼分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個或其變體和/或衍生物(包括更短的抗原區或表位)即可。所述SEQ ID NO:3的變體和/或衍生物和/或其抗原區或表位可不同，例如因含有保守或非保守胺基酸的取代或缺失(特別是氨基端或羧基端缺失)或各種插入等，只要得到的蛋白質/肽是抗原性的並引發疫苗受體的免疫應答即可。所述抗原區或表位優選長度至少約10個胺基酸，包含分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸的一個或多個，參考如圖3所示的VP-2蛋白的胺基酸殘基編號。然而，抗原區可能包含整個AR08071304 VP-2基因/蛋白質。另外，亦預期與本文公開的序列(或這些序列的部分)在嚴格條件下(特別是高度嚴格條件下)雜交的核酸序列，只要所述序列編碼分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個即可。嚴格條件指的是允許核酸序列與特定序列雜交的雜交條件。一般而言，高嚴格條件指的是允許含至少50個核苷酸並優選含約200個或更多個核苷酸的核酸序列與特定序列在約65°C下於包含約I M鹽的溶液中雜交的雜交條件，所述溶液優選6 X SSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液，並在65°C下於包含約O. I M鹽或更低濃度的鹽的溶液中洗滌，優選O. 2 X SSC或具有相當的離子強度的任何其它溶液。這些條件允許檢測具有約90%或更高的序列同一性的序列。一般而言，較低嚴格條件指的是允許含至少50個核苷酸並優選含約200個或更多個核苷酸的核酸序列與特定序列在約45°C下於包含約I M鹽的溶液中雜交的雜交條件，所述溶液優選6 X SSC或具有相當離子強度的任何其它溶液，並在室溫下於包含約I M鹽的溶液中洗滌，優選6 X SSC或具有相當離子強度的任何其它溶液。這些條件允許檢測具有高達50%的序列同一性的序列。為了鑑定同一性在50%-90%之間變化的序列，本領域技術人員能夠改良這些雜交條件。因此，本發明亦提供含有並表達本文所公開的核酸序列(或其編碼抗原肽和/或多肽的部分)的各式重組和/或表達載體。所述載體可用於疫苗製劑，或可用於其它目的，例如在實驗室環境下操作所公開的序列。所述載體和表達系統實例包括但不限於各種細菌(例如大腸桿菌iBscherichia coif)、或基於益生菌(probiotic)的(例如乳桿菌ilactobaciIIusY)表達載體；各種重組病毒載體，例如腺病毒、杆狀病毒、金絲雀痘載體等；畢赤酵母(Pichia)和酵母表達系統等。所述重組載體和表達系統可能用於例如疫苗制齊U，或用於其它目的，例如用於實驗室中操作序列，或用於研究或診斷目的。本發明亦預期嵌合蛋白和編碼所述嵌合蛋白的基因，所述蛋白包含本發明RPV的VP-2蛋白或其抗原區或表位。在某些實施方案中，所述表位大小在至少約5-約20或更多個胺基酸的範圍內。所述嵌合蛋白(或編碼它們的核酸序列)可能包括其它有用的胺基酸序列，例如佐劑、作為疫苗靶標的其它蛋白，例如來自其它生物體，其導致食肉動物特別是犬科動物等的疾病。編碼所述蛋白的核酸可能包括接頭或間隔子序列，例如在抗原區或表位之間。亦包括編碼和/或表達所述嵌合(或融合)蛋白的重組和/或表達載體。製備適於接種以抵抗細小病毒的疫苗的若干方法為本領域已知。例如，參見Appel等的美國專利4，193，990和4，193，99KCarmichaeI等的美國專利4，303，645,Wood等的美國專利4，971，793,Valdes等的美國專利5，882，652和Parrish等的美國專利5，885，585，其中每一個都提供了多種合適的配製疫苗的策略。這些專利中每一個的全部內容通過引用併入本文。要製備疫苗，通常會用到含有所述核酸序列(例如病毒中天然存在的ssDNA，或通過基因工程移入非天然病毒載體的ssDNA或其它等同物形式(例如dSDNA、SS或dsRNA、RNA-DNA雜交鏈等))的病毒載體。實例包括RPV (或其它)病毒連同合適的生理學載體，所述病毒「被殺死」、滅活或以另外方式減毒以使其不會導致被給予的動物嚴重疾病症狀。優選不會因給予而出現疾病症狀。然而，本領域技術人員應認識到，許多有效的疫苗組合物在給予時或給予後會導致某些不適或相對較小的痛楚。然而，保護完全發作的疾病的好處遠遠超過這個可能性。作為備選，可以利用不會自然感染或一般不會導致被接種動物疾病 的異型病毒。滅活本發明抗原(例如本發明RPV)的方式的實例包括但不限於加熱、甲醛、福馬林、二亞乙基胺、輻射和丙內酯處理。其它適合的疫苗組分例如藥理學可接受的載體為本領域技術人員所熟知，用作疫苗的所述組合物的製備也一樣。通常所述組合物被製備成液體溶液劑或混懸劑，但亦預期固態形式，例如片劑、丸劑、粉劑等等。亦可製備適於給予前在液體中成為溶液劑或混懸劑的固態形式，或適於在口中溶解的固態形式。也可乳化製劑。活性成分可與藥學上可接受並與所述活性成分相容的賦形劑混合。合適的賦形劑為例如水、鹽水、葡萄糖、甘油、乙醇等等，或其組合。另外，所述組合物可含有少量的輔助物質，例如潤溼劑或乳化劑、PH緩衝劑等等。如果期需給予口服形式的組合物，則可添加各種增稠劑、調味劑、稀釋劑、乳化劑、分散劑或粘合劑等等。本發明組合物可含有任何所述另外成分，以使提供的組合物處於適於給予的形式。製劑中可翻譯的核酸的最終量可能變化。然而，一般而言，該量將為約I-99%O所述組合物可進一步包含佐劑，所述佐劑的合適的實例包括但不限於Seppic、QuilA、Alhydrogel 等。為了作為疫苗給予，通常將核酸包括在病毒或病毒顆粒之內，整個顆粒將是疫苗組分。如本領域技術人員所理解，當疫苗含有毒粒(例如本發明RPV)時，這些病毒將被滅活(被殺死的)或減毒，即病毒在細胞中培養數代之後獲得，以使顆粒不會導致疾病症狀，或僅僅導致輕微的、無生命威脅的症狀。本領域技術人員亦可認識到，存在使病毒減毒的其它方法，這些方法中的任何一種均可用於本發明實踐以開發本文所公開的變異株病毒的合適形式。例如，可能引進幹擾病毒毒性、繁殖能力等的各種突變。或者，可在異源載體中遞送SEQ ID NO: I所展示的核苷酸序列(或本文所述的其編碼抗原區和表位的片段，例如SEQ ID NO: 2)，所述異源載體例如不同病毒(例如不會導致疫苗受體物種疾病的病毒)，或另一類型的構建體，將所述構建體設計為導致疫苗受體表達所編碼蛋白而不導致疾病症狀。所述病毒的實例包括但不限於貓泛白細胞減少症病毒(FPV)、各種皰疫病毒、非病原性「孤兒病毒(orphan viruse) 」、腸道病毒例如腸道病毒屬 等。亦預期其它形式的疫苗。例如，亦預期「空」病毒顆粒疫苗(無核酸)，同樣預期包含不被裝配為衣殼的蛋白質的疫苗。亦可通過用柱、盤等中包被轉鐵蛋白的珠子淘選而基本上或部分純化和/或濃縮的本發明RPV。本發明RPV可在極高效價下安全地給予。例如，疫苗中CPV-2的通常劑量為每次注射約10，000個病毒顆粒。當使用RPV時，其給予量的範圍為每次注射約10，000個顆粒-每次注射約100，000個顆粒，或甚至更高，例如每次注射約100，000個直至1，000, 000個顆粒。或者，疫苗製劑可包括如在SEQ ID NO: 3或SEQ ID MO: 4中展示的VP-2蛋白(多肽、肽等)序列或其抗原區或表位。另外，亦預期以下序列用於疫苗中表現出與上述SEQ ID NO: 3或SEQ ID MO: 4至少約50%的同一性、優選約60%、更優選約70、80或90%的同一性或相似性，或甚至約95、96、97、98或99%或更高的同一性或相似性的序列，或其抗原區或表位，只要序列包括分別為Thr和Asp的第232位和第300位胺基酸殘基中的一個或兩個即可。術語「同一性」和「相似性」為本領域所知，當使用術語「同一性」時，通常指的是基於待比較的序列中相應的相同位置間的相同匹配的序列比較。術語「相似性」指的是胺基酸序列之間的比較，其不但考慮相應位置相同的胺基酸，而且也考慮相應位置功能相似的胺基酸(例如Asp和Glu，兩個都擁有在中性pH下通常帶負電的側鏈，因此可能功能相似)。因此，多肽序列之間的相似性表明除序列上的相似性外還有功能上的相似性。本發明所包含的序列可能與明確公開的那些序列不同，例如，如本領域技術人員所知悉的那樣，具有保守胺基酸取代(例如帶正電荷的胺基酸可相互取代，脂肪族胺基酸可相互取代等)，只要胺基酸序列保持在給予疫苗受體時引發有效、合適的免疫應答的能力即可。另外，本發明亦包含作為SEQ ID NO: 3中短連續序列(即代表SEQ IDNO: 3部分的截短或局部序列)的抗原區或表位，但是其仍保持引發疫苗受體抵抗犬細小病毒感染症狀發展的有效、合適的免疫應答的能力。所述抗原區通常長度範圍為約5-10個胺基酸，但是也可為約15、20、25、30、35、40、45或甚至50個胺基酸或長度更長，通常應包含第232位和第300位胺基酸中的一個或兩個。
在本發明的一個實施方案中，所述疫苗受體是幼犬。所述「幼犬」，我們意指小於約8周齡的年幼狗。通常在例如2-3周齡時將疫苗給予幼犬，接著在4和6周時給予加強劑量。在一些實施方案中，8周後不再使用該疫苗，因為從那以後，接著可使用無母體抗體幹擾的針對其它已知流行病毒的疫苗。儘管在一些實施方案中，所述疫苗受體是幼犬，但本領域技術人員應認識到，情況不一定需要總是這樣。可將疫苗給予任何年齡的狗及對細小病毒感染敏感的其它動物物種(特別是食肉動物)，包括成年和幼年動物二者。實例包括但不限於犬科動物(canid)(例如野生犬科動物，例如狼、野狗物種、郊狼、狐狸例如灰狐、敏狐和紅狐等)、臭鼬、貓(包括家養貓和小貓及貓類的較大物種，而不管是家養的還是野生的，例如山貓(bobcat)、美洲獅、獅、虎等)、水貂、紅熊貓(red panda)等；各種浣熊科動物，包括浣熊、長鼻浣熊(coatis)、蜜熊(kinkajous)、犬綜熊(olingos)、圈尾貓(ringtails)和蓬尾綜熊(cacomistles)等。所述動物可能是家養的(例如寵物)、「工作」動物(例如服務性動物)、牲畜、野外的動物、 圈養的或保護區、動物園、收容所的動物等，只要它們能得益於疫苗給予即可。可通過本領域技術人員所熟知的很多合適手段中的任意一種給予本發明免疫原性/疫苗製劑，包括但不限於通過注射；胃腸外給予，例如肌內、皮下、腹腔內、皮內給予等等；通過如上所述口服「幼犬棒棒糖」；鼻內；通過攝取含有抗原的食物製品等。然而，在優選實施方案中，成年受體的給予方式是通過注射，和如上所述，幼體的注射方式是經由吮吸時溶解於口中的固體製劑。可單獨給予或與其它藥劑或免疫原性組合物聯合給予本發明組合物，例如作為多組分疫苗的一部分。另外，給予可能是單個事件，或可在不同時間間隔給予多次加強劑量以加強免疫應答。在給予幼犬的情況下，典型給予方案是(如上所述)在例如2-3周齡時初次免疫，接著是在4和6周齡時加強劑量。優選地，給予是預防性的，即在暴露於病毒發生之前；或疑似已暴露於病毒，但也可能在此事實後給予，即在已知或疑似暴露之後；或給予是治療性的，例如在與病毒感染有關的疾病症狀已經發生之後。本發明亦提供在有需要的患者或個體中引發免疫應答的方法，以及給患者或個體(特別是食肉動物例如幼年犬科動物，例如幼犬)接種以抵抗細小病毒感染的方法。所述方法包括將一個或多個劑量的免疫弓I發製劑或疫苗製劑給予受體。所給予的劑量足以引發免疫應答，優選對由所給予的核酸編碼的抗原的保護性免疫應答。或者，在給予本文所述的一種或多種胺基酸序列的情況下，免疫應答是針對胺基酸序列中存在的抗原。優選免疫應答是保護性的，不會有因給予而發生的疾病症狀。然而，本領域技術人員應認識到，很多有效的疫苗組合物在給予時會導致一些相對較小的症狀，或一旦受體被致病生物體感染，減弱但不消除疾病的所有症狀。然而，針對完全發作的疾病而受保護的好處遠遠超過這些可能性。在其它實施方案中，用本發明浣熊細小病毒作為基因遞送系統。本文所述浣熊細小病毒(RPV)是自主複製細小病毒(ARP)。業已闡述用ARP作為基因遞送工具和表達載體(參見Maxwell等的美國專利5，585，254)。因為本發明RPV和接種過CPV或已天然暴露於CPV的狗的血清無抗原性反應，所以該RPV非常適於用作犬亦用於其它物種(參見以下)的基因載體和/或表達載體。將基因工程改造的RPV用於將「外源」或「異源」核酸序列攜帶進入目的細胞內，所述「外源」或「異源」核酸序列即不是源於RPV但在目的細胞中編碼和表達的序列，或以另外方式提高或促進表達目的多肽或肽的序列。例如，可編碼一種或多種免疫原，並可將RPV給予受試者以引發對所述一種或多種免疫原(例如對受試者接種疫苗)的免疫應答。RPV是含有無包膜單鏈DNA的小病毒。和脊椎動物其它自主細小病毒一樣，RPV基因組有兩個開放閱讀框ORFl和0RF2，兩側是DNA複製所需的末端反向重複(ITR)(圖4A)。ORFl和0EF2的表達分別由啟動子P4和P38驅動(圖4B)。ORFl編碼非結構(NS)蛋白NSl和NS2，0RF2編碼衣殼蛋白VP-1、VP-2和VP-3 (圖4C)。NSl是病毒DNA複製和啟動子反式激活所必需的例如驅動VP-I和VP-2轉錄的多功能蛋白質。NS2為複製、病毒產生和子代毒粒從核釋出(nuclear egress)所必需。細小病毒顆粒具有二十面體對稱,直徑約20 nm。所述顆粒包含約50%的蛋白質和約50%的DNA，且中和表位存在於顆粒的暴露表面。有可能將異源序列插入犬細小病毒衣殼蛋白例如VP-2蛋白中，並且使用相同或相似的策略對本發明RPV進行基因工程改造。(Austin等，Tropic determinant for canineparvovirus and feline panleukopenia virus functions through the capsid proteinVP-2 (通過衣殼蛋白VP-2發揮功能的犬細小病毒和貓泛白細胞減少症病毒的向性決定子)，Journal of General Virology (1997)，78，925-928)。表 I 列出了位於編碼 VP-2·的基因內的限制位點。這些限制位點中的一個或多個可能被用於外源DNA的插入。表I浣熊細小病毒VP-2的限制性圖譜
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ApoI9154 160 43 747 784 179 926 1409 142權利要求
1.一種細小病毒，其包含ATCC編號_的細小病毒-2 (綜熊)的特徵。
2.一種疫苗，其包含細小病毒，所述細小病毒包含具有ATCC編號_的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。
3.權利要求2的疫苗，其進一步包含選自以下的一種或多種抗原組分犬瘟熱病毒(CDV)、犬腺病毒2型、犬副流感病毒、犬冠狀病毒、犬皰疹病毒、犬輪狀病毒、鉤端螺旋體的一種或多種血清變型和犬細小病毒_2，在所述犬細小病毒-2中，VP-2蛋白的第232位胺基酸不是Thr且VP-2蛋白的第300位胺基酸不是Asp。
4.權利要求3的疫苗，其中所述鉤端螺旋體的一種或多種血清變型選自以下問號鉤端螺旋體犬型血清型、問號鉤端螺旋體黃疸出血型血清型、問號鉤端螺旋體波莫那型血清型和基氏鉤端螺旋體感冒傷寒型血清型。
5.分離的核酸，其包含核苷酸序列SEQID NO: I或SEQ ID NO: I的一部分；其中所述SEQ ID NO: I的一部分編碼包含SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或包含SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基兩者的VP-2蛋白的抗原區。
6.包含權利要求5的核酸的免疫原性組合物，其中所述核酸存在於被殺死的或減毒的細小病毒顆粒或低代數RPV中。
7.權利要求6的免疫原性組合物，其中所述被殺死的細小病毒顆粒包含具有ATCC編號_的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。
8.權利要求6的免疫原性組合物，其中所述減毒的細小病毒顆粒存在於適於舌上溶解的固體載體中。
9.權利要求6的免疫原性組合物，其中所述免疫原性組合物適於皮下給予。
10.引發動物抵抗細小病毒感染的免疫應答的方法，所述方法包括將包含核酸的免疫原性組合物給予所述動物的步驟，所述核酸包含核苷酸序列SEQ ID NO: I或SEQ ID NO: I的一部分；其中所述SEQ ID NO: I的一部分編碼包含SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或包含SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基兩者的VP-2蛋白的抗原區。
11.權利要求10的方法，其中所述核酸存在於被殺死的或減毒的細小病毒顆粒或者被殺死或減毒的細小病毒顆粒中的低代數RPV。
12.權利要求11的方法，其中所述被殺死的細小病毒顆粒包含具有ATCC編號_的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。
13.權利要求11的方法，其中所述減毒的細小病毒顆粒存在於適於舌上溶解的固體載體中。
14.權利要求10的方法，其中所述免疫原性組合物適於皮下給予。
15.權利要求13的方法，其中所述動物是幼犬。
16.基本上純化的細小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，所述VP-2蛋白在第232位胺基酸具有蘇氨酸殘基，在第300位胺基酸具有天冬氨酸殘基，其中所述抗原性片段至少包含所述VP-2蛋白的一部分，其具有第232位胺基酸的蘇氨酸殘基；或第300位胺基酸的天冬氨酸殘基；或第232位胺基酸的蘇氨酸殘基和第300位胺基酸的天冬氨酸殘基二者。
17.權利要求16的基本上純化的細小病毒VP-2蛋白或其抗原性片段，其中所述基本上純化的細小病毒VP-2蛋白包含胺基酸序列SEQ ID NO: 3。
18.表達載體，其包含編碼SEQID NO: 3或SEQ ID NO: 3的一部分的胺基酸序列的核苷酸序列；其中所述SEQ ID NO: 3的一部分是VP-2蛋白的抗原性區域，其包含SEQ IDNO: 3的第232位胺基酸殘基、SEQ ID NO: 3的第300位胺基酸殘基或包含SEQ ID NO: 3的第232位胺基酸殘基和第300位胺基酸殘基兩者。
19.權利要求18的表達載體,其為重組病毒表達載體。
20.權利要求19的表達載體,其為金絲雀痘病毒表達載體。
21.殺死哺乳動物中腫瘤細胞的方法，所述方法包括將包含足以感染並殺死所述哺乳動物中所述腫瘤細胞的量的細小病毒的組合物給予所述哺乳動物的步驟，所述細小病毒包含ATCC編號的細小病毒-2 (浣熊)的特徵。
22.權利要求21的方法，其中所述哺乳動物是對犬細小病毒-2血清反應陽性的狗。
23.權利要求21的方法，其中所述方法通過選自靜脈內給予和瘤內給予的給藥途徑來實施。
24.權利要求23的方法，其中所述細小病毒是低代數細小病毒。
全文摘要
提供了針對犬細小病毒的疫苗製劑。所述疫苗包括分離自浣熊的新型犬細小病毒-2和相關核酸及蛋白質。
文檔編號C12N7/04GK102971417SQ201080056571
公開日2013年3月13日 申請日期2010年10月14日 優先權日2009年10月14日
發明者S.卡皮爾 申請人:俄克拉荷馬州大學評議會