一種纖維堆囊菌生產埃坡黴素b的發酵方法及發酵培養基的製作方法

2023-07-14 07:43:31 2

專利名稱：一種纖維堆囊菌生產埃坡黴素b的發酵方法及發酵培養基的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種纖維堆囊菌生產埃坡黴素B的發酵方法及發酵培養基。
背景技術：
埃坡黴素B作為粘細菌纖維堆囊菌的次級代謝產物，是一種微管超穩定的新型抗 腫瘤活性物質。埃坡黴素B的作用機制與紫杉醇相同，但其在抗腫瘤譜、抗腫瘤活性、安全 性、水溶性及合成方法等方面均優於紫杉醇，是一類前景廣闊的新型抗腫瘤藥物。為了進行埃坡黴素的大規模生產，生物發酵是理想的途徑。埃坡黴素B —般由粘 細菌纖維堆囊菌Sorangium cellulosum 90發酵生產。專利W093/10121中報導，在含碳 源、氮源和無機鹽的介質中培養纖維堆囊菌的菌株，並在培養過程中加入吸附性樹脂，可生 產得到低產量的埃坡黴素B。文獻《纖維堆囊菌的代謝產物及其生物學活性分析》(李越 中，微生物學報，2001，41 (6))，文獻《粘細菌纖維堆囊菌降解纖維素多酶複合體的確證和性 質分析》(侯配斌，博士畢業論文，山東大學)，以及文獻《Mutation and ahigh-throughput screening method for improving the production of Epothilonesof Sorangium》 (Guo-li Gong, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2007,34 :615_623)均報導，使用 M26 培養基 發酵粘細菌纖維堆囊菌，也可獲得低產量的埃坡黴素B。儘管使用M26培養基發酵粘細菌纖維堆囊菌可以生產埃坡黴素B，但產量較低；若 採用誘變篩選，又由於粘細菌纖維堆囊菌難以培養，誘變篩選難度又很大。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供了一種纖維堆囊菌發酵培養基，其用於發酵培 養纖維堆囊菌製備埃坡黴素B時，菌株性能穩定，生長快速，產品埃坡黴素B的產量明顯提 高。本發明還提供了一種纖維堆囊菌生產埃坡黴素B的發酵方法。本發明提供了一種纖維堆囊菌發酵培養基，其包括碳源、氮源、無機鹽、大孔吸附 樹脂和水，還包括胺基酸。其中，所述的胺基酸較佳的選自賴氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。其中，所述的胺基酸的含量較佳的為0. l_500mg/L，更佳的為1-lOmg/L。其中，所述的纖維堆囊菌發酵培養基的pH值較佳的為3-9，更佳的為5-8。其中，所述的纖維堆囊菌較佳的為Sorangium cellulosum 90。其中，所述的碳源為本領域常規使用的碳源，較佳的為0. 2_2襯％的土豆澱粉或玉 米澱粉或麥芽糊精或土豆糊精，以及0.的葡萄糖。其中，所述的氮源為本領域常規使用的氮源，較佳的為0. 05-0. 5wt %的大豆蛋白 腖或胰腖，以及0.的酵母膏。其中，所述的無機鹽為本領域常規使用的無機鹽，較佳的為0. 05-0. 5wt %的 MgS04 '7H20,0. 05-0.CaCl2 *2H20,以及0. 5_5ml/L的微量元素液。所述的微量元素 液為本領域常規使用的微量元素液，較佳的參考Reichenbach H. , Dworkin M.等人的《TheMyxobacteria. The Prokaryote》(2nded. 1992. 3418-3487)中相關內容配製，標準微量元 素液(1L 體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl2 20mg, CuS04 lOmg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa_Fe3+8g0其中，所述的大孔吸附樹脂較佳的為非極性大孔吸附樹脂，鑑於其用於發酵，為使 之不易破碎，考慮其機械強度，更佳的選擇使用XAD-16大孔吸附樹脂。其中，所述的大孔吸附樹脂的用量較佳的為體積百分比2%。其中，所述的水較佳的為去離子水；所述水的用量較佳的為補足質量百分比 100%。其中，更佳地，碳源、氮源、無機鹽和大孔吸附樹脂的優選組合為M26培養基，即指 0. 8wt%土豆澱粉、0. 2wt%大豆蛋白腖、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt%MgS04 *7H20、 0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L微量元素液和2% (V V)的XAD-16大孔吸附樹脂。本發明的纖維堆囊菌發酵培養基由下述方法製得將上述成分簡單均勻混合，用 水補足含量至質量百分比100%，按照本領域常規方式殺菌消毒，即可。本發明的發酵培養基特別適合纖維堆囊菌的發酵培養，本發明還提供了一種纖維 堆囊菌生產埃坡黴素B的發酵方法，其步驟包括在本發明的纖維堆囊菌發酵培養基中接 種纖維堆囊菌，培養，生產埃坡黴素B。其中，所述的纖維堆囊菌較佳的為Sorangium cellulosum 90。其中，所述的纖維堆囊菌的接種量為本領域常規使用接種量，較佳的為 5% -50%，更佳的為10% -30%，百分比為質量百分比。其中，所述的培養的溫度較佳的為20_40°C，更佳的為25-30°C。其中，所述的培養的pH值較佳的為3-9，更佳的為5-8。其中，所述的接種使用的種子為經過二級培養的本領域常規使用的粘細菌纖維 堆囊菌種子。其中，所述的二級培養為本領域常規方法培養，包括斜面菌種培養和種子培 養。所述的斜面菌種培養為現有技術常規方法培養，即使用VY/2斜面培養基在30°C條件 下，培養箱培養3-7天。所述的種子培養為現有技術常規方法培養，即使用M7種子培養基， 30°C、200rpm 培養 2-5 天。所述的 VY/2 培養基含有鮮酵母 0. 5wt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ； VB120. 00005wt%;瓊脂1. 5wt%;ffi 3mol/L的K0H調pH至7. 2。所述的M7種子培養基含有 蛋白腖 0. 3wt% ；胰腖 0. 3wt% ；澱粉 0. 5wt% ；葡萄糖 0. 2wt% ；酵母膏 0. lwt% ;MgS04 7H20 0. lwt% ；CaCl2 2H20 0. lwt% ；VB120. 00001wt% ；用 3mol/L 的 K0H 調 pH 至 7. 2。本發明所用試劑和原料均市售可得。本發明中，上述的各技術特徵的優選條件可以任意組合，得到較佳的技術方案用
於生產高產量的發酵埃坡黴素B。本發明的積極進步效果在於本發明提供了一種纖維堆囊菌發酵培養基及其生產 埃坡黴素B的發酵方法。使用本發明纖維堆囊菌發酵培養基培養菌株時，菌株性能穩定，生 長快速，製備埃坡黴素B相較於使用常規發酵培養基M26，在製備埃坡黴素B時的產量明顯 提高50-100%，效果顯著。
具體實施例方式下面通過實施例的方式進一步說明本發明，但並不因此將本發明限制在所述的實施例範圍之中。實施例中的百分比，如無特殊說明，均為質量百分比。實施例1-4表1給出了本發明的發酵培養基實施例1 4的配方，按表1中所列組分及其含 量(百分比均為質量百分比)簡單混合均勻，用去離子水補足含量至質量百分比100%，殺 菌消毒，即製得各發酵培養基。其中，微量元素液配製(1L體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl220mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H205mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTA Na-Fe3+8g。
實施例5粘細菌纖維堆囊菌種子美國菌種保藏中心ATCC購買，保存號為ATCC15384，種子 的保存狀態為甘油管保存或凍幹管保存均可。微量元素液配製(1L體系):MnCl2 4H20 lOOmg, CoCl220mg, CuS0410mg, Na2Mo04 2H20 lOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 2H20 5mg, H3B03 lOmg, KBr 20mg, KI 20mg, EDTANa-Fe3+8g。
1、孢子培養將粘細菌纖維堆囊菌接到VY/2固體斜面培養基培養上培養5-7天， 待形成成片擴散狀菌落，作為種子使用。VY/2培養基組成成分為0. 5襯％鮮酵母、0. lwt% CaCl2 2H20、0. 5mg/L VB12、1. 5wt%瓊月旨，用 KOH 調 pH 至 7. 2，121°C滅菌 20min。2、種子培養i、用接種針在長好的粘細菌纖維堆囊菌VY/2斜面上刮取少許菌落接到M7液體 種子培養基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養5-7天。M7培養基組成成分 為0. 3襯％蛋白腖、0. 3wt%胰腖、0. 5wt%澱粉、0. 2 丨％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 調 pH 至 7. 2，121°C 滅菌 20min。ii、按20wt%的接種量取培養好的M7種子重新接到新的M7種子培養基中，裝瓶 量為80ml/500ml，3(TC、200rpm搖床培養2-4天。M7培養基組成成分為0. 3 丨％蛋白腖、 0. 腖、0. 5wt%澱粉、0. 2界卞％葡萄糖、0.母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaC12 .2H20、0. 00001wt% VB12，用 KOH 調 pH 至 7. 2，加入 10-15 顆玻璃珠，121°C滅菌 20min。3、發酵培養按20wt%的接種量取培養好的M7種子接到本發明的發酵培養基中， 裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養7天。發酵培養基的組成成分為0. 8wt%土豆 澱粉、0. 2wt%大豆蛋白腖、0. 2界卞％葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 d^OUml/L微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 樹脂、2-lOmg/L賴氨酸；pH值為 7. 0。結果分析培養7天後，收集發酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時，取浸泡液進行 HPLC分析埃坡黴素B的產量，如下表所示。其中HPLC條件為柱型Hypersil BDS C18 5um 4. 6mmXI50mm、流動相為乙腈水=50 50、流速為lml/min、檢測波長250nm、柱溫30°C。 實施例6除使用的發酵培養基以外，孢子培養、種子培養、以及結果分析的操作步驟和條件 同實施例5。其中，發酵培養基的組成成分為0. 8wt%土豆澱粉、0. 2wt%大豆蛋白腖、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16樹脂和2-10mg/L蘇氨酸；pH值為7. 0。結果分析埃坡黴素B的產量如下表所示 實施例7除使用的發酵培養基以外，孢子培養、種子培養、以及結果分析的操作步驟和條件 同實施例5。其中，發酵培養基的組成成分為0. 8wt%土豆澱粉、0. 2wt%大豆蛋白腖、0. 2wt% 葡萄糖、0. 2界1%酵母膏、0. lwt% MgS04 7H20、0. lwt% CaCl2 2H20、lml/L 微量元素液、2% (V V)的XAD-16樹脂、2-10mg/L甲硫氨酸；pH值為7. 0。結果分析埃坡黴素B的產量如下表所示 實施例8除使用的埃坡黴素B發酵培養的溫度條件為25-30°C以外，孢子培養、種子培養、 以及結果分析的操作步驟和條件同實施例5，其中發酵培養基中的胺基酸含量為賴氨酸 8mg/L。結果分析埃坡黴素B的產量如下表所示 實施例9除使用的埃坡黴素B發酵培養的pH條件為3-9以外，孢子培養、種子培養、以及結 果分析的操作步驟和條件同實施例5，其中發酵培養基中的胺基酸含量為賴氨酸8mg/L。結果分析埃坡黴素B的產量如下表所示 實施例10 孢子培養和種子培養的操作步驟和條件同實施例1。按20%的接種量取培養好 的M7種子接到本發明的發酵培養基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養7天。 發酵培養基的組成成分為0. 2wt%玉米澱粉、0. 05wt%胰腖、1襯％葡萄糖、1襯％酵母膏、0. 05wt% MgS04 7H20、0. 05wt% CaCl2 2H20、5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16 樹 脂、10mg/L賴氨酸。培養7天後，收集發酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時，提取埃坡黴素 B，即可。實施例11孢子培養和種子培養的操作步驟和條件同實施例1。按20%的接種量取培養好 的M7種子接到本發明的發酵培養基中，裝瓶量為20ml/250ml，30°C、200rpm搖床培養7天。 發酵培養基的組成成分為2wt%麥芽糊精、0. 5wt%大豆蛋白腖、0. 1襯％葡萄糖、0. lwt% 酵母膏、0. 5wt% MgS04 7H20、0. 5wt% CaCl2 2H20、0. 5ml/L 微量元素液、2% (V V)的 XAD-16樹脂、10mg/L賴氨酸。培養7天後，收集發酵液中的樹脂，用甲醇浸泡2小時，提取 埃坡黴素B，即可。由上述實施例的分析結果表明當發酵培養基中含有胺基酸時，發酵所得的菌體 量和埃坡黴素B顯著增多，其產量至少比不含有胺基酸時提高50 %，效果顯著。
權利要求
一種纖維堆囊菌發酵培養基，其包括碳源、氮源、無機鹽、大孔吸附樹脂和水，其特徵在於其還包括胺基酸。
2.如權利要求1所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的胺基酸選自賴氨 酸、蘇氨酸和甲硫氨酸。
3.如權利要求1所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的胺基酸的含量為 0. l-500mg/L。
4.如權利要求3所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的胺基酸的含量 l-10mg/L。
5.如權利要求1所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的纖維堆囊菌為 Sorangium cellulosum 90。
6.如權利要求1所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的纖維堆囊菌發酵 培養基的PH值為3-9。
7.如權利要求1-6任一項所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的碳 源為0. 2-2襯％的選自土豆澱粉、玉米澱粉、麥芽糊精和土豆糊精中的一種或多種，以及 0. I-Iwt%的葡萄糖；所述的氮源為0. 05-0. 5wt%的大豆蛋白腖或胰腖，以及0. I-Iwt %的 酵母膏；所述的無機鹽為 0. 05-0. 5wt%^ MgSO4 · 7Η20，0· 05-0. 5wt%^ CaCl2 · 2H20,以及 0. 5-5ml/L的微量元素液；所述的大孔吸附樹脂為體積百分比為2%的XAD-16大孔吸附樹 脂；所述的水的含量為補足質量百分比100%。
8.如權利要求7所述的纖維堆囊菌發酵培養基，其特徵在於所述的標準微量元素液， 其 IL 體系含有:MnCl2 · 4H20 IOOmg, CoCl2 20mg, CuSO4IOmg, Na2MoO4 · 2H20 IOmg, ZnCl2 20mg, LiCl 5mg, SnCl2 · 2H20 5mg, H3BO3 IOmg, KBr 20mg, KI 20mg,以及 EDTA Na_Fe3+8g0
9.一種纖維堆囊菌發酵生產埃坡黴素B的發酵方法，其步驟包括在如權利要求1所 述的纖維堆囊菌發酵培養基中接種纖維堆囊菌，培養，生產埃坡黴素B。
10.如權利要求9所述的發酵方法，其特徵在於所述的纖維堆囊菌的接種量為 5-50%，百分比為質量百分比；所述的培養的溫度為20-40°C ；所述的培養的pH值為3_9。
全文摘要
本發明公開了一種纖維堆囊菌發酵培養基，其包括碳源、氮源、無機鹽、大孔吸附樹脂和水，其還含有胺基酸。其用於發酵培養纖維堆囊菌製備埃坡黴素B時，菌株性能穩定，生長快速，產品埃坡黴素B的產量明顯提高。本發明還提供了使用本發明的纖維堆囊菌發酵培養基發酵培養纖維堆囊菌生產埃坡黴素B的發酵方法。
文檔編號C12R1/01GK101851591SQ200910048789
公開日2010年10月6日 申請日期2009年4月3日 優先權日2009年4月3日
發明者田剛, 陳少欣 申請人:上海醫藥工業研究院