草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法

2023-07-29 13:16:06

專利名稱：草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法
技術領域：
本發明涉及病毒學領域，特別是一種草魚呼腸孤病毒(Grass carp reovirus ，縮寫GCRV, 又稱草魚出血病病毒Grass carp hemorrhagic virus,縮寫GCHV)逆轉錄聚合酶鏈式反應(簡 稱RT-PCR)的核酸檢測方法。本發明是基於草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株GCRV873 (又稱草 魚出血病病毒湖南邵陽株GCHV873)的研究成果，該毒株已由中國典型培養物保藏中心保藏， 保藏閂期是2004年7月23日，保藏編號是CCTCC NO: V200414 。
背景技術：
水生動物病毒病是嚴重危害水產養殖及疾病傳播的主要病原。隨著水產集約化養殖業的 迅速發展，病毒性流行病頻頻發生，這些疾病在世界範圍內對水產養殖造成了極大的危害。 GCRV隸屬於呼腸孤病毒科水生動物呼腸孤病毒屬，該病原曾一度引起我國長江中下遊地區 淡水養殖區大規模暴發草魚流行性出血病，造成嚴重的經濟損失。GCRV形態結構為二十面 體對稱的無包膜球形顆粒，基因組由ll條(Sl-Sll)分段的雙鏈RNA組成。
研究病原及其診斷手段，是預防病毒病發生與蔓延的重要環節。此外，隨著國際間魚苗、 魚卵以及魚製品進出口的日益增多，由於檢疫制度的不完善，水生動物呼腸孤病毒病也隨之 在世界各地傳播開來。為規範與杜絕外來帶毒水生生物苗種進入我國及我國帶毒苗種的出境， 制定有效的診斷與預防措施十分必要。
目前在GCRV病原檢測方面雖有ELISA等血清學檢測方法，也有RT-PCR相關檢測方法 的報導，但是現有的檢測手段都存在耗時較長(通常需要12小時以上)，且靈敏度與特異性欠 佳等弊端，適應不了臨床檢測準確、快速、靈敏的要求。基於GCRVslO基因片段編碼病毒 外衣殼蛋白及宿主特異性強等特性，為此，我們建立了快速檢測GCRV感染細胞或患病草魚 組織的RT-PCR核酸檢測方法。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種用於快速靈敏檢測編碼GCRV外衣殼蛋白VP7 的slO基因的RT-PCR核酸檢測方法。GCRV VP7蛋白為組成病毒的外衣殼組分，在病毒進 入細胞過程中具有十分重要的作用，其編碼基因slO是病毒基因組核酸的重要組成部分。在 草魚育種期、魚苗的出入境檢疫及草魚出血病流行期間對slO基因進行快速檢測，將為防治 出血病的發生與蔓延、杜絕外來病毒的侵害以及防止帶毒魚苗的傳播提供標準的檢測方法。
本發明解決其技術問題採用以下的技術方案
本發明提供的草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是採用
RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測 編碼GCRV外衣殼結構蛋白VP7的slO基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的 細胞，及正常魚組織和病魚組織。上述的檢測方法包括以下步驟
(1) 取少許細胞或魚體組織作為待測樣品，將所述待測樣品研磨凍融後進行離心沉澱， 採用蛋白酶K和SDS對待測樣品進行處理，然後用RNA吸附離心柱對蛋白酶K和SDS處 理的待測樣品RNA進行抽提。由此獲得待測的RNA樣品。
(2) 根據GCRVslO基因片段序列，分別設計用於RT-PCR擴增的特異性正反向引物， 採用Superscript II逆轉錄酶系統與高保真T叫酶，及slO基因片段特異引物序列進行slO基因 片段的RT-PCR核酸擴增。
(3) 採用所建立的RT-PCR方法，進行擴增產物的靈敏度測定與特異性分析。 本發明可以由以下方法得到上述的待測樣品
(1) 取0.5 lml GCRV待測樣品進行研磨，製成待測勻漿液；
(2) 對於待測魚體組織樣品，按l:3重量體積比加入lxPBS，進行待測樣品研磨，研磨 的待測樣品重複凍融3次，即在-2(TC低溫冰箱中快速結凍，然後取出於37'C快速解凍，得到 待測勻漿液；
(3) 將上述待測勻漿液通過離心得到沉澱物，該沉澱物為所述待測材料。 所述待測勻漿液可由離心機以12500 g離心5分鐘得到沉澱物，在該沉澱物中加入150
200 )il的pH值為8.0的TE, TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然後依次加入 蛋白酶K和SDS，使其終濃度分別為lOOpg/ml和0.5%;經充分混勻後，於60 68。C水浴孵 育lh，以進行細胞裂解；再用RNA吸附柱離心法獲得RNA提取物，用於後續RT-PCR擴增。 本發明可以釆用以下方法進行後續RT-PCR擴增，其步驟包括
(1) 根據GCRVslO基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396;
(2) RT反應或cDNA合成採用slO基因反向特異引物與待測RNA樣品混合，65'C反 應5分鐘後立即放置冰上，然後在20pl反應體積依次加入變性的RNA模板引物混合物，5 XRTBuffer， 10mMdNTP混合物，10U/yl的RNase Inhibitor, 20011/^1的逆轉錄酶lpl;於 42'C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，cDNA產物置-2(TC保存備用；取2^1 cDNA 產物為模板，用GCRVslO基因序列正反向特異引物進行PCR擴增。
所述GC RV s 10基因序列的正反向特異引物的序列如下 正向引物的序列5， -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3， 反向引物的序列5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
所述GCRV s10基因序列的正反向特異引物擴增RT-PCR的產物大小為515bp，該產物通 過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。RT-PCR擴增產物的陽性對照物為GCRV873， GCRV873是
草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株。
本發明提供的草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，其用於草魚出血病 的早期診斷或出入境水產品疫情的檢測。
本發明與現有技術相比，主要有以下優點
其一.採用RNA吸附柱離心法，可從微量待檢測魚體組織或病毒感染的細胞培養液直接
5提取RNA，進行後續s10基因片段的RT-PCR擴增。
其二.快速，簡便，從樣品處理到結果讀取只需要4-5h。
其三.以編碼GCRV外衣殼蛋白的slO基因為靶序列，設計特異性引物，進行sl0基因
片段檢測，可提高檢測的靈敏度，其檢測靈敏度可達到10—6ng。
其四.與ELISA方法相比，檢測的是病毒基因組特異的核酸片段，具有較高的特異性。
其五.實用性強可用於草魚出血病的早期診斷及出入境水產品疫情檢測。
總之，本發明不僅提供了一種草魚出血病的快速靈敏檢測手段，而且為我國進出口水生
動物檢疫試劑的標準化及商品化應用奠定基礎。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步說明。
一. 待測樣品製備與病毒細胞總RNA的抽提
1. 待測樣品的製備
取0.5 lml正常細胞、病毒感染的細胞、正常魚體組織或一定量的病魚體組織 (100-150mg)為待測樣品RNA提取材料。其中，患病或正常魚體組織按重量體積比，在魚 體組織樣品中加入3倍體積1XPBS (pho'sphate-buffered saline,縮寫PBS，其組成成分為 137mMNaCl' 2.7mMKCl， 8.1 mMNa2HP04， 1.5mMKH2P04, pH7.5)'進行反覆研 磨。研磨的待測組織樣品和待測細胞重複凍融3次，即於-20'C低溫冰箱快速結凍及37'C進行 快速解凍，以製成待測勻槳液。得到的勻槳液經攪拌均勻後，製成待測樣品。
2. 待測樣品總RNA的提取
(1) 將待測細胞或組織勻漿液以12500 g離心5分鐘，除去上清，保留沉澱物。
(2) 將離心得到的沉澱物，加入150-200|il的TE (10mmol/LTris.C1, lmmol/LEDTA， p朋.O)進行懸浮，TE用焦碳酸二乙脂(DEPC)處理的去離子水配置，高壓滅菌，然後加入蛋 白酶K和SDS,使其終濃度為100pg/ml禾3 0.5°/0 (W/V)。充分混勻後，65'C水浴孵育lh，對 細胞或組織勻漿液進行裂解。
(3) 採用RNA吸附柱離心法獲得上述待測樣品RNA提取物，用於後續RT-PCR擴增。
(4) 採用分光光度計對所提取的RNA進行定量測定。
二. RT-PCR擴增
1. 採用RT-PCR方法進行GCRV衣殼蛋白s10基因片段擴增。基於GenBank序列進行 slO基因片段引物設計。用於擴增GCRVslO的正反向引物序列如下
正向引物(GCRV-S 10-SF1)的序列5' -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3' 反向引物(GCRV-S10-ASF)的序列5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
2. 採用常規cDNA第一鏈合成試劑盒，進行cDNA合成。
cDNA合成的具體方法是將特異引物或隨機引物與待測RNA在65i:反應5min後，立 即放置冰上，然後在20pl反應體積依次加入上述變性的RNA模板引物混合物，5XRTBuffer, 10mM dNTP混合物，10U//il RNase Inhibitor lpl， 200U/ml的SuperScriptIl逆轉錄酶1^1; 42'C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，置-20。C保存cDNA產物。取2|_d cDNA合成產物， 加入slO正反向引物及常規PCR反應混合後進行PCR擴增。其PCR產物在1%瓊脂糖凝膠 進行電泳鑑定。
三. RT-PCR檢測的靈敏度測定
採用RNA吸附柱離心法獲得上述待測樣品RNA提取物後，可用隨機引物進行反轉錄用 於後續PCR擴增，也可以用上述特異反向引物序列進行cDNA合成，其反轉錄產物cDNA直 接用作PCR擴增的模板。以未感染病毒的正常CIK細胞及正常魚組織作為陰性對照， GCRV873為擴增產物的陽性對照。結果顯示，待測的感染GCRV細胞或病魚組織樣品均應有 約500bp陽性擴增產物，陰性對照無任何擴增產物出現，本方法能檢測出的GCRVdsRNA最 低含量為10—6ng。
四. 待測樣品RT-PCR檢測的特異性分析
用slO特異引物對不同養殖地區的正常草魚與感染GCRV的患病草魚進行了 RT-PCR檢 測，其待測RNA樣品及RT-PCR檢測均按上述方法進行，同時應設置未感染GCRV的健康 魚組織提取液為陰性對照，陰性對照樣品中應無特異性核酸擴增產物。本方法己對從我國南 方不同地方淡水養殖區收集到的患草魚出lfiL病魚組織和分離保存的GCRV分離株進行了檢 測，結果顯示該RT-PCR檢測方法具有很強的特異性。其陽性與陰性對照符合率為100%。
五. 草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法的用途 該檢測方法用於草魚出血病的早期診斷，或出入境水產品疫情的檢測。 中國科學院武漢病毒研究所
草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法
<141〉
1
<210〉 1
22
<212〉 DNA
人工序列 <220〉
(1)…(22)
正向引物GCRV-S10-SF1
<400〉 1
5， 一TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3，
2
21
DNA
人工序列 <220〉
(1)…(21)
反向引物GCRV-S10-ASF
2
5'-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3，
權利要求
1.一種草魚呼腸孤病毒核酸檢測方法，其特徵是一種草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是採用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結構蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。
2. 根據權利要求1所述的檢測方法，其特徵是該方法包括以下步驟 (1 )將所述待測樣品研磨凍融後進行離心沉澱，(2) 在上述離心沉澱的溶液中加入蛋白酶K及SDS進行細胞裂解，通過RNA吸附柱 進行待測樣品總RNA的分離，(3) 採用SuperscriptII逆轉錄酶系統與高保真Taq酶，及slO基因片段特異引物序列進 行s10基因片段的RT-PCR核酸擴增。
3. 根據權利要求2所述的檢測方法，其特徵是所述待測樣品由以下方法得到(1) 取0.5 lml待測樣品進行研磨，製成待測勻槳液；(2) 對於待測魚體組織樣品，按l:3重量體積比加入lxPBS，進行待測樣品研磨，研磨 的待測樣品重複凍融3次，即在-2(TC低溫冰箱中快速結凍，然後取出於37'C快速解凍，得到 待測勻漿液；(3) 將上述待測勻漿液通過離心得到沉澱物，該沉澱物為所述待測材料。
4. 根據權利要求3所述的檢測方法，其特徵是在步驟(3)中所述待測勻漿液由離心 機以12500 g離心5分鐘得到沉澱物，在該沉澱物中加入150 200 |al的pH值為8.0的TE， TE用DEPC處理的去離子水配置，高壓滅菌，然後依次加入蛋白酶K和SDS，使其終濃度 分別為100(jg/ml和0.5%;經充分混勻後，於60 68。C水浴孵育lh;再用RNA吸附柱離心 法獲得RNA提取物，用於後續RT-PCR擴增。
5. 根據權利要求4所述的檢測方法，其特徵是採用以下方法進行後續RT-PCR擴增，其 步驟包括(1) 根據GCRVslO基因序列設計引物，GenBank序列號為AF403396;(2) RT反應或cDNA合成採用slO基因反向特異引物與待測RNA樣品混合，65'C反 應5分鐘後立即放置冰上，然後在2(^1反應體積依次加入變性的RNA模板引物混合物，5 XRT Buffer, lOmMdNTP混合物，10U//xl的RNase Inhibitor, 200U/fxl的逆轉錄酶1^1;於 42。C保溫30min，進行cDNA第一鏈的合成，cDNA產物置-2(TC保存備用；取2|il cDNA產 物為模板，用GCRVslO基因序列正反向特異引物進行PCR擴增。
6. 根據權利要求5所述的檢測方法，其特徵是所述GCRVslO基因序列的正反向特異引 物的序列是7H向引物的序列5' -TCTAAGGATATCGTCGAACTTC-3， 反向引物的序列5，-GATGAAACGAGAGACCCCTAC -3'。
7. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵是用GCRVslO基因序列的正反向特異引物 擴增RT-PCR的產物大小為515bp，該產物通過1%瓊脂糖凝膠電泳進行鑑定。
8. 根據權利要求6所述的檢測方法，其特徵是RT-PCR擴增產物的陽性對照物為 GCRV873， GCRV873是草魚呼腸孤病毒湖南邵陽株。
9. 根據權利要求1至權利要求S中任一權利要求所述檢測方法的用途，其特徵是該檢測 方法用於草魚出血病的早期診斷或出入境水產品疫情的檢測。
全文摘要
本發明是一種草魚呼腸孤病毒逆轉錄聚合酶鏈式反應核酸檢測方法，該方法是採用RNA吸附柱離心法直接提取待測樣品中總RNA，通過逆轉錄酶鏈式反應從待測樣品中檢測編碼GCRV外衣殼結構蛋白VP7的s10基因片段；所述待測樣品包括正常細胞和病毒感染的細胞，及正常魚組織和病魚組織。本檢測方法的優點是僅需微量的待測組織樣品，即可通過柱離心法提取待測樣品總RNA及進行RT-PCR擴增，其最低檢測靈敏度為10-6ng，所需時間僅為4-5小時，其檢測方法簡便可靠，靈敏度高，特異性強。該結果將有望應用於GCRV臨床快速診斷及魚苗的出入境海關檢疫。
文檔編號C12Q1/70GK101629216SQ20091006304
公開日2010年1月20日 申請日期2009年7月7日 優先權日2009年7月7日
發明者丁清泉, 張嵐嵐, 勤 方 申請人:中國科學院武漢病毒研究所