一種催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脫氫酶突變體的製作方法

2023-07-20 23:31:21

本發明涉及一種催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脫氫酶突變體，屬於基因工程技術領域。

背景技術：

葡萄糖脫氫酶能以NAD(P)+作為輔因子催化葡萄糖生成葡萄糖酸-1,5-內酯，它在工業上被廣泛用於血糖測定的檢測試劑盒和生物傳感器。此外，在氧化還原酶催化的不對稱還原反應中葡萄糖脫氫酶被廣泛用於輔酶循環，如(R)-羰基還原酶與葡萄糖脫氫酶偶聯後高效催化2-羥基苯乙酮製備(R)-苯基乙二醇。目前，葡萄糖製備的主要原料有玉米，甘薯。但是糧食作物生產成本高，為了節約糧食，也為了實現我國的可持續發展，利用可再生的木質纖維素資源進行生化藥劑的生產逐漸引起社會的關注。

纖維素類物質主要包括纖維素，半纖維素和木質素三種成分。將半纖維素酸解或酶解後可獲得90％的D-木糖，然而工業生產中的微生物不能有效地利用木糖。因此，高效利用木糖是利用植物纖維素類資源解決人類資源、環境之間的矛盾，實現可持續發展的關鍵之一。基於這些前提，篩選新的酶或者通過理性設計改造現有的氧化還原酶使其可以高效催化木糖就顯得十分必要。

葡萄糖脫氫酶是短鏈脫氫酶家族的一員。目前短鏈脫氫酶家族包括47000多條基因和蛋白序列，其中有超過300個蛋白質結構已經被解析並儲存在PDB資料庫中。雖然大多數短鏈脫氫酶的序列相似性只有20％-30％，但是它們共享相似的三維立體結構。短鏈脫氫酶家族的結構包括一個與輔酶NAD(P)+結合的羅斯曼摺疊和一個由Ser-Tyr-Lys組成的活性催化三角，這些結構信息都有助於對其進行理性改造以改變酶的催化功能。

發明人之前篩選到一種來自Bacillus sp.YX-1的具有良好有機溶劑耐受性的葡萄糖脫氫酶(BsGDH)，它在不對稱反應中常以葡萄糖作為底物進行輔酶的循環再生。但是其催化木糖的比酶活還有待提高。

技術實現要素：

為了解決上述問題，本發明基於同源序列比對和蛋白結構分析在BsGDH底物結合域附近設計定點突變，提高BsGDH對木糖的酶活力。本發明的突變酶A258F對木糖的酶活力相較於野生型提高了4倍，可利用木糖作為輔助底物進行不對稱轉化反應中的輔酶循環，從而實現了對木糖的有效利用。本發明方法解決了木糖資源不能有效利用的問題，有助於對豐富、廉價的植物纖維素類資源的合理利用，促進經濟的可持續發展。

本發明的目的是提供一種葡萄糖脫氫酶突變體，所述突變體的胺基酸序列是：

(1)在SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的基礎上將第258位的胺基酸進行突變；或者，

(2)在嚴格條件下與(1)限定的胺基酸序列雜交且編碼具有葡萄糖脫氫酶活性的胺基酸序列。

在本發明的一種實施方式中，所述編碼SEQ ID NO:1所示的胺基酸序列的核苷酸序列是SEQ ID NO:2所示的序列。

在本發明的一種實施方式中，所述將第258位的胺基酸進行突變，是突變成苯丙氨酸(A258F)、組氨酸(A258H)、色氨酸(A258W)或者酪氨酸(A258Y)。

本發明的第二個目的是提供編碼所述突變體的核苷酸片段。

本發明的第三個目的是提供含有編碼所述突變體的基因的載體。

在一種實施方式中，所述載體為pET載體或者PMD19-T載體。

本發明的第四個目的是提供一種能利用木糖的重組菌，所述重組菌表達本發明的葡萄糖脫氫酶突變體。

在一種實施方式中，所述重組菌可以是以大腸桿菌、芽孢桿菌、酵母為宿主構建得到的。

在一種實施方式中，所述重組菌是以大腸桿菌為宿主構建得到的。

在一種實施方式中，所述重組菌是以大腸桿菌為宿主、pET-28a為載體構建得到的。

本發明的第五個目的是提供所述突變體、編碼所述突變體的核苷酸片段、含有編碼所述突變體的基因的載體、表達所述突變體的基因工程菌(尤其是大腸桿菌、酵母或枯草芽孢桿菌)在食品、化工或紡織領域的應用。

在一種實施方式中，所述應用是用於催化木糖。

本發明的突變體命名方式：

採用「原始胺基酸位置替換的胺基酸」來表示突變體。如A258F，表示位置258的胺基酸由親本葡萄糖脫氫酶的丙氨酸Ala替換成苯丙氨酸Phe，位置的編號對應於親本葡萄糖脫氫酶的胺基酸序列的相應位點。

本發明的優點和效果：

本發明成功構建含有目的基因的重組菌株BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。重組菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)誘導表達出突變酶A258F，粗酶液經His-Trap親和層析柱純化後得到純酶A258F。通過優化酶活測定條件，A258F在pH7.0的磷酸鉀緩衝液中於55℃中有高達7.59U·mg-1的比酶活。這些工作為葡萄糖脫氫酶用於不對稱轉化反應的輔酶循環提供了新的底物，解決了木糖資源不能有效利用的問題，有助於降低生產成本，為工業中木糖利用提供了優良菌種，為基因工程法改造酶的底物特異性奠定了基礎。

具體實施方案

下面是對本發明進行具體描述。

實施例1：表達突變體A258F的重組菌的構建

一、質粒pET-GDH的獲得

重組E.coli BL21(DE3)/pET-GDH的培養基組成為：蛋白腖1％，酵母膏0.5％，NaCl 1％。

將重組菌接種於培養基裝液量為5mL試管中於37℃、200rpm振蕩培養8h。培養結束後，將菌體於12,000rpm下離心1min並收集細胞，利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒pET-GDH；其中質粒pET-GDH中的葡萄糖脫氫酶GDH的胺基酸序列如SEQ ID NO:1所示(核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示)。

二、重組大腸桿菌E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)的構建

(1)A258F全長基因的獲得：

合成兩端引物(序列分別如SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4所示)：

A258F-f：5』-CGGCTAGCATGTATCCGGATTTAAAAGGAAAAGTCG-3』(Nhe I)，

A258F-r：5』-CCTCGAGTTAACCGCGGCCAAACTGGAATGACG-3』(Xho I)。

採用PCR的方法，將突變引入，具體方法如下：

PCR反應體系：ddH2O 22μL，Premix PrimeSTAR 25μL，上遊引物(20μM)1μL，下遊引物(20μM)1μL，質粒DNA 1μL。

PCR反應：98℃預變性30s；98℃10s，60℃15s，72℃60s，進行30個循環；72℃延伸10min。以pET-GDH為模板，以引物A258F-f和A258F-r進行PCR反應，獲得突變的全長基因。利用3S Spin Agarose Gel DNA Purification Kit(上海申能博彩生物科技有限公司)純化DNA片斷。

純化後的基因PCR產物與pMD19-T載體通過TA互補連接，連接產物轉化大腸桿菌E.coli JM109感受態細胞，重組質粒T-GDH(A258F)用雙酶切、PCR及上海生工測序進行驗證。

(2)重組質粒pET-GDH(A258F)的獲得：

基因GDH(A258F)及pET-28a的酶切：

利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒T-GDH(A258F)和pET-28a。

按照水、緩衝液、質粒DNA、酶的順序加到Eppendorf管中，蓋好管蓋，振蕩使液體充分混勻，置於離心機內離心2s使液體集中於管底，37℃金屬浴1h，在管中加入1/10的Loading Buffer或將管置於65℃保溫10min，終止酶切反應。酶切產物進行瓊脂糖凝膠電泳分析，切膠回收並濃縮。

反應體系組成：10×Buffer H 4μL，DNA 10μL，Nhe I 2μL，XhoI 2μL，ddH2O將體系補足40μL。

基因GDH(A258F)與質粒pET-28a的連接

反應體系組成如下：質粒pET-28a 0.8μL，基因4.2μL，Ligation Solution 5μL，將混合連接液置於16℃培養箱中連接12-16h。

重組質粒轉化大腸桿菌E.coli JM109

在每管的100μL E.coli JM109感受態細胞懸液中加入10μL連接產物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉入42℃水浴中，熱擊90s。快速轉移至冰浴中冷卻3min。每管中加入700μL LB液體培養基，37℃100rpm搖床溫育培養1h。培養後菌液3,000rpm離心2min，棄上清700μL，剩餘菌液混勻後塗布到含有50μg·mL-1硫酸卡娜黴素的LB平板上，37℃倒置培養過夜。

陽性克隆的選擇：

挑取4個克隆，轉接入裝有5mL的含有50μg·mL-1氨苄青黴素的LB培養基中，37℃培養8h，利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒。用以下反應體系進行酶切驗證：10×Buffer H 2μL，DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，XhoI 0.5μL，ddH2O將體系補足20μL。獲得陽性質粒pET-GDH(A258F)。

(3)重組質粒轉化大腸桿菌E.coli BL21(DE3)：

在每管100μL E.coli RIL感受態細胞懸液中加入10μL連接產物，輕輕混勻，冰浴中靜置30min。轉入42℃水浴中，熱擊90s。快速轉移至冰浴中，冷卻3min。每管中加入700μL LB液體培養基，37℃100rpm搖床溫育培養1h。培養後菌液3,000rpm離心2min，棄上清700μL，剩餘菌液混勻後塗布到含有50μg·mL-1硫酸卡娜黴素的LB平板上，37℃倒置培養過夜。

陽性克隆的選擇：

挑取4個克隆，轉接入裝有5mL的含有50μg·mL-1硫酸卡娜黴素的LB培養基中，37℃培養8h，利用質粒提取試劑盒Mini-Plasmid Rapid Isolation Kit(北京博大泰克生物基因技術有限公司)提取質粒。用以下反應體系進行酶切驗證：10×Buffer H 2μL，質粒DNA 5μL，Nhe I 0.5μL，Xho I 0.5μL，ddH2O將體系補足20μL。獲得陽性克隆E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)。驗證正確的E.coli BL21(DE3)/pET-GDH(A258F)，表達的葡萄糖脫氫酶GDH的胺基酸序列，相對於SEQ ID NO:1所示的序列，第258位的丙氨酸A突變成了苯丙氨酸F。

實施例2：重組菌的誘導表達培養

LB培養基：蛋白腖1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要時使用前加入硫酸卡那黴素(50μg·mL-1)，固體培養基添加1.5％瓊脂粉。

挑取陽性克隆單菌落接種於10mL含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養過夜。取10mL培養液轉接於1L含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養至OD600約為1.0。向培養物中加入終濃度為0.1mM的異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下進行誘導培養12h。

實施例3：重組菌的誘導表達培養

誘導表達：LB培養基組成同實施例2，挑取陽性克隆單菌落接種於10mL含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養過夜。保藏甘油菌兩支(每支含有1mL菌液，15％的甘油)，同時取1mL培養液轉接於50mL含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養至OD600約為1.0。向培養物中加入終濃度為0.1mM的異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷，在37℃下進行誘導培養12h。收集菌體，溶解於20mM磷酸緩衝液(pH 7.0)中，超聲破碎20min，工作時間1s，間歇時間3s。將破碎後的菌體12,000rpm，40min。分別取上清和沉澱，SDS-PAGE檢測蛋白表達。

實施例4：重組蛋白A258F的純化

利用His-Trap HP affinity column純化重組蛋白A258F：

LB培養基：蛋白腖1％，酵母提取物0.5％，NaCl 1％，pH7.0。需要時使用前加入硫酸卡那黴素(50μg·mL-1)，固體培養基添加1.5％瓊脂粉。

挑取陽性克隆單菌落接種於10mL含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養過夜。取10mL培養液轉接於1L含50μg·mL-1硫酸卡那黴素的LB液體培養基中，於37℃，200rpm振蕩培養至OD600約為1.0。向培養物中加入誘導物異丙基-Β-D-硫代半乳糖苷0.1mM，在培養溫度37℃下進行誘導培養12h。培養後的重組大腸桿菌細胞6,000rpm離心10min並用生理鹽水洗滌三次後收集。

稱取2g溼菌體，加入適量0.1mM Tris-HCl(pH 8.0)緩衝液懸浮細胞，於冰浴中進行超聲破碎(工作1s，間隔3s，工作時間5min)。4℃條件下12,000rpm離心30min收集上清液作為粗酶液。利用GE公司生產的His-Trap親和層析對粗酶液進行純化，純酶液超濾脫鹽後用於酶活測定。

實施例5：突變前後比酶活測定

A258F酶活力的測定：

根據β-D-葡萄糖+NADP+→D-葡萄糖-δ-內酯+NADPH，NADPH的生成會引起340nm處吸光值的升高，因此可以通過測定反應過程中340nm處的吸光值的變化來衡量葡萄糖脫氫酶的活力。

酶活測定的標準條件：總反應體積100μL，分別加入0.1M醋酸緩衝液(pH4.5～6.5)或0.1M磷酸鉀緩衝液(pH 7.0～7.5)或0.1M Tris-HCl緩衝液(pH 8.0～9.0)，2.0mM NADP+，0.1M D-木糖，30℃保溫2min，加入適量純酶液後開始掃描340nm處吸光值的變化。蛋白質含量測定採用Bradford法，以牛血清白蛋白BSA為標準品。酶活力定義為：在上述條件下，每分鐘催化生成1μmol的NADPH的酶量定義為一個單位U。

酶活的計算公式為：酶活(U)＝EW×V×103/(6220×0.3)

比活的計算公式：比活(U·mg-1)＝酶活(U)/蛋白量(mg)

其中，EW：1min內340nm處吸光度的變化；V：反應液的體積(mL)；6220：摩爾消光係數(L mol-1cm-1)；0.3：光程距離(cm)。

結果顯示，不同pH的緩衝液下計算得到的A258F的比酶活如表1所示。

表1突變前後的葡萄糖脫氫酶在不同pH的緩衝液下的比酶活

註：本發明的野生酶BsGDH即為胺基酸序列如SEQ ID NO:1的葡萄糖脫氫酶。

實施例6：突變前後動力學參數測定

根據β-D-葡萄糖+NADP+→D-葡萄糖-δ-內酯+NADPH，NADPH的生成會引起340nm處吸光值的升高，因此可以通過測定反應過程中340nm處的吸光值的變化來衡量葡萄糖脫氫酶的活力。為了研究酶對底物木糖的親和力，在2.0mM NADP+條件下，分別測定不同木糖濃度(0.5mM-10mM)下的最初反應速率。

根據米氏方程v＝Vmax×[S]/Km+[S]，計算出酶對不同輔酶的Km值。

其中，v：反應速率(U/mg·60s)；Vmax：最大反應速率(U/mg·60s)；[S]：底物濃度(mmol/L)；Km：反應速度v達到一半1/2Vmax時的底物濃度(mmol/L)。

當底物濃度飽和時，Vmax＝Kcat/[E]，計算出Kcat值。

其中，Vmax：最大反應速率(U/mg·60s)；[E]：飽和底物濃度(mmol/L)。

動力學參數測定：總反應體積100μL，加入0.1M磷酸緩衝液(pH7.0)，2.0mM NADP+，溫度55℃保溫2min，加入適量純酶液測定不同木糖濃度(0.5mM-10mM)下的最初反應速率。計算出A258F的kcat為17.3s-1；Km為14.7mM；kcat/Km為1.17s-1·mM-1；而野生型的kcat為6.6s-1；Km為44.0mM；kcat/Km為0.15s-1·mM-1。

此外，發明人還構建了突變體A258H、A258W、A258Y、K207A、E220K、Q252K等，採用酶標儀檢測340nm處的吸光值變化的方法測定了比酶活，並測定了動力學參數，結果如表2、表3所示。表2是在最佳條件磷酸鉀pH7.0，55℃條件下測定得到的比酶活結果。

表2不同突變體的比酶活比較

表3野生型及突變酶的動力學參數

雖然本發明已以較佳實施例公開如上，但其並非用以限定本發明，任何熟悉此技術的人，在不脫離本發明的精神和範圍內，都可做各種的改動與修飾，因此本發明的保護範圍應該以權利要求書所界定的為準。

序列表

江南大學

一種催化木糖的比酶活提高的葡萄糖脫氫酶突變體

4

PatentIn version 3.3

1

261

PRT

人工序列

1

Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ser

1 5 10 15

Ser Gly Leu Gly Arg Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Gln Glu Gln Ala

20 25 30

Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Glu Lys Glu Ala Gln Thr Val

35 40 45

Lys Glu Glu Val Gln Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Ile Ile Gln Gly

50 55 60

Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Val

65 70 75 80

Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Met Glu

85 90 95

Asn Pro Val Glu Ser His Lys Met Pro Leu Lys Asp Trp Asn Lys Val

100 105 110

Ile Asn Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Cys Arg Glu Ala Ile

115 120 125

Lys Tyr Tyr Val Glu Asn Asp Ile Gln Gly Asn Val Ile Asn Met Ser

130 135 140

Ser Val His Glu Met Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala

145 150 155 160

Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Glu Thr Leu Ala Leu Glu Tyr

165 170 175

Ala Pro Lys Arg Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn

180 185 190

Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Val Gln Lys Lys Asp

195 200 205

Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile

210 215 220

Ala Ala Val Ala Val Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ser Ser Tyr Val Thr

225 230 235 240

Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Gln Tyr Pro Ser Phe

245 250 255

Gln Ala Gly Arg Gly

260

2

786

DNA

人工序列

2

atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gccattacag gagcatcatc aggattagga 60

agagcgatgg cgatccgctt cgggcaggag caggcgaaag tcgtgattaa ctactacagt 120

aatgaaaaag aggctcaaac cgtaaaagaa gaagttcaaa aagcgggcgg cgaagcggtc 180

attattcaag gtgacgttac aaaagaagag gatgtcaaaa acattgtgca gaccgcggtc 240

aaggaattcg gcacattaga tatcatgatc aacaacgccg gcatggaaaa tccggtcgag 300

tcgcataaaa tgccgctaaa agactggaac aaagtcatca acaccaacct gaccggcgct 360

tttctgggat gccgcgaagc cattaaatat tacgtagaga atgatattca aggaaacgtc 420

attaacatgt cgagcgtaca tgaaatgatt ccgtggccgc tgtttgtcca ctatgcggca 480

agtaaaggcg gcattaaatt aatgacggaa acattggcgc ttgagtacgc gccgaagcgc 540

atccgtgtta acaatatcgg gccgggcgcc atcaatacgc cgatcaatgc ggaaaagttt 600

gcggatcccg ttcagaaaaa agatgtggaa agcatgattc cgatggggta tatcggtgag 660

ccggaagaaa tcgcggctgt cgccgtctgg cttgcttcaa aggaatcaag ctacgtgacc 720

ggcattacgc tgtttgctga cggcggaatg acacaatatc cgtcattcca ggcaggccgc 780

ggttaa 786

3

36

DNA

人工序列

3

cggctagcat gtatccggat ttaaaaggaa aagtcg 36

4

33

DNA

人工序列

4

cctcgagtta accgcggcca aactggaatg acg 33