銅綠假單胞菌的一種特異性檢測方法
2023-07-21 02:19:01 1
銅綠假單胞菌的一種特異性檢測方法
【專利摘要】本發明描述了一種利用聚合酶鏈式反應（PCR)技術檢測銅綠假單胞菌的方法，和用於PCR的新的核酸引物。本發明所述檢測方法可以顯著縮短銅綠假單胞菌的鑑定時間，而且重複性好、可信度高，對銅綠假單胞菌來源及相關鑑定提供依據。
【專利說明】銅綠假單胞菌的一種特異性檢測方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於微生物學檢測【技術領域】，具體涉及銅綠假單胞菌的一種特異性檢測方法。
【背景技術】
[0002]細菌汙染是威脅雞胚培養病毒生產方式的主要難題之一。由於種蛋從生產、運輸到進入孵化間，細菌伴隨著種蛋進入到病毒生產的相關環節，這是因為細菌可能附在種蛋表面的糞便上、或與消毒劑接觸的時間短或耐藥性等等原因，導致細菌不可能在消毒環節中予以全部消滅，同時因為細菌生存條件要求較為寬鬆，在普通環境都能存活，並且繁殖能力特別強，如果在雞胚接種、尿囊液收穫等等因為其中的接種針和收穫頭受到細菌汙染就會導致細菌在不同雞胚中傳播，容易引起細菌汙染生產事故，導致生產失敗，造成經濟損失。為了更好的預防細菌導致雞胚生產病毒失敗，篩選有效的消毒劑或抗生素成為一種必要的手段，但前提是鑑定汙染的細菌是哪種細菌，才可以有針對性進行篩選。因此細菌準確鑑定成為關鍵的環節。
[0003]目前細菌鑑定包括有生化鑑定和PCR鑑定，生化鑑定在實際操作中常因結果不確實而無法準確判斷，因此不能成為完全決定細菌種類的手段，而基因擴增鑑定(PCR鑑定)可以有針對性的擴增細菌的基因16SrDNA，再通過測序和序列對比，從而確定細菌的種類，是公認的鑑定一種微生物類別的主要手段。
[0004]經過研究和鑑定，對於經常引起生產失敗的細菌主要是銅綠假單胞菌，銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)又稱綠膿桿菌,是一種單生鞭毛,運動活潑,無芽胞,專性需氧的革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在於水、土壤、空氣、以及人和動物機體皮膚及腸道中，為飲用水中的主要汙染源之一。銅綠假單胞菌可產生多種內外毒素，導致急性腸道疾病和皮膚炎症，此外，因其具有多重耐藥能力，在特定條件下，該菌還可引起繼發感染或混合感染，弓丨發肺炎、腦膜炎、敗血症等，嚴重時可導致死亡。目前，在銅綠假單胞菌的檢測技術方面，國內外標準中仍沿用傳統的理化檢測方法，包括塗布法、多試管MPN法、濾膜法等，需要純培養和生化鑑定等多個步驟，整個檢測周期3-5天，靈敏度低，且不能滿足現場快速檢測的需要。
[0005]而上述的PCR鑑定需要測序和比對，時間一般要5天左右，而針對這種細菌建立特異性的檢測方法，通過特異性引物和擴增片段大小就可以直接判斷結果，I天就可以得到結果，這可以為篩選有效的消毒劑或抗生素贏得時間，可以減少或避免細菌汙染事故。
[0006]因此提供一種及時、快速、重複性好、可信度高的銅綠假單胞菌的特異性檢測方法，就成為了急需解決的問題。
【發明內容】
[0007]鑑於現有技術的不足，本發明的目的是提供銅綠假單胞菌的一種特異性檢測方法，不僅能夠快速診斷出銅綠假單胞菌而且重複性好、可信度高。
[0008]本發明具體技術方案如下:
一種銅綠假單胞菌的特異性檢測引物，包括上下遊引物5』 -GACGGGTGAGTAATGCCTA-3』和 5』-CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3』 。
[0009]一種銅綠假單胞菌的檢測方法，採用上述檢測引物。
[0010]所述檢測方法所得特異性片段大小為616kb。
[0011]所述銅綠假單胞菌的檢測方法，包括如下步驟:a.抽提細菌基因組DNA ;b.16SrDNA分子特異性PCR引物擴增；c.鑑定特異性擴增產物。
[0012]步驟b所述PCR引物擴增的反應體系由25PL PCR Mixture、2PL上下遊引物溶液、2μ? DNA模板、2lPLddH20組成共50μ?反應體系。
[0013]步驟b所述PCR引物擴增的反應條件為:94°C預變性5 min ;94°C變性Imin，53 °C退火30s, 72°C延伸1.5min, 30個循環；最後72°C再延伸1min0
[0014]步驟c所述鑑定特異性擴增產物的方法為取PCR擴增產物5μ?，於1%瓊脂糖凝膠中120V電泳15min，利用凝膠成像系統拍攝。
[0015]所述銅綠假單胞菌的檢測方法，具體步驟為:
(O將沒有雜菌的銅綠假單胞菌用營養液培養後抽取部分菌液，抽提細菌基因組DNA用於16S rDNA分子特異性PCR鑑定；
(2)由25PL PCR Mixture、2PL 上下遊引物溶液、2μ? DNA 模板、2lPLddH20 組成 50μ? 反應體系，反應條件為:94°C預變性5 min ;94°C變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸1.5min, 30個循環；最後72°C再延伸1min ；
(3)取PCR擴增產物5μ?，於1%瓊脂糖凝膠中120V電泳15min，利用凝膠成像系統拍攝。
[0016]本發明針對銅綠假單胞菌的16S rDNA的保守基因序列設計出了一對特異性上下遊引物，分別為 5』 -GACGGGTGAGTAATGCCTA-3』 和 5』 -CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3』，特異性片段大小為616kb。用惡臭假單胞菌、大腸桿菌、檸檬酸桿菌、蠟樣芽胞桿菌以及不同來源確定的銅綠假單胞菌作為試驗樣品，利用上述引物進行擴增檢測，只有銅綠假單胞菌可以檢出特異性片段，結果見圖1。證明了本發明所述方法特異性高。
[0017]本發明所述檢測方法可以顯著縮短銅綠假單胞菌的鑑定時間，而且重複性好、可信度高，對銅綠假單胞菌來源及相關鑑定提供依據。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0018]圖1為特異性引物擴增結果，其中M:DL2000 Mark er，a:惡臭假單胞；b:大腸桿菌；c:檸檬酸桿菌；d:蠟樣芽胞桿菌；S1至S4為不同來源經確診的銅綠假單胞菌。
【具體實施方式】
[0019]以下是進一步描述本發明的實施例。這些實施例不應被認為是對本發明的限制。本領域技術人員應理解在形式上和詳細內容上的各種改變並不違背在所附權利要求中詳細標明的本發明的實質和範圍。
實施例1
PCR 擴增引物，包括序列 5』-GACGGGTGAGTAATGCCTA-3』 和5』 -CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3』，特異性片段大小為616kb。操作步驟:
(O將沒有雜菌的銅綠假單胞菌用營養液培養後抽取部分菌液，抽提細菌基因組DNA用於16S rDNA分子特異性PCR鑑定；
(2)由25PL PCR Mixture、2PL 上下遊引物溶液、2μ? DNA 模板、2lPLddH20 組成 50μ? 反應體系，反應條件為:94°C預變性5 min ;94°C變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸1.5min, 30個循環；最後72°C再延伸1min ；
(3)取PCR擴增產物5μ?，於1%瓊脂糖凝膠中120V電泳15min，利用凝膠成像系統拍攝。
[0020]用惡臭假單胞菌、大腸桿菌、檸檬酸桿菌、蠟樣芽胞桿菌以及不同來源確定的銅綠假單胞菌作為試驗樣品，利用上述引物進行擴增。結果見附圖1。
【權利要求】
1.一種銅綠假單胞菌的特異性檢測引物，包括上下遊引物5』-GACGGGTGAGTAATGCCTA-3』 和 5』-CACTGGTGTTCCTTCCTATA-3』 。
2.—種銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，採用權利要求1所述檢測引物。
3.根據權利要求2所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，所述檢測方法所得特異性片段大小為616kb。
4.根據權利要求2所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，該方法包括:a.抽提細菌基因組DNA ；b.16S rDNA分子特異性PCR引物擴增；c.鑑定特異性擴增產物。
5.根據權利要求4所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，步驟b所述PCR引物擴增的反應體系由25PL PCR Mixture、2PL上下遊引物溶液、2PL DNA模板、2lPLddH20組成共50μ?反應體系。
6.根據權利要求4所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，步驟b所述PCR引物擴增的反應條件為:94°C預變性5 min ;94°C變性lmin，53°C退火30s，72。。延伸1.5min，30個循環；最後72°C再延伸lOmin。
7.根據權利要求4所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，步驟c鑑定特異性擴增產物的方法為取PCR擴增產物5μ?，於1%瓊脂糖凝膠中120V電泳15min，利用凝膠成像系統拍攝。
8.根據權利要求2所述銅綠假單胞菌的檢測方法，其特徵在於，該方法具體步驟為: 將沒有雜菌的銅綠假單胞菌用營養液培養後抽取部分菌液，抽提細菌基因組DNA用於16S rDNA分子特異性PCR鑑定； 由25PL PCR Mixture、2PL上下遊引物溶液、2PL DNA模板、2lPLddH20組成50μ?反應體系，反應條件為:94°C預變性5 min;94°C變性lmin，53°C退火30s，72°C延伸1.5min,30個循環；最後72°C再延伸1min ； 取PCR擴增產物5μ?，於1%瓊脂糖凝膠中120V電泳15min，利用凝膠成像系統拍攝。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293964SQ201410564729
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月22日 優先權日:2014年10月22日
【發明者】張文炎, 劉錦容, 詹烜子, 梁雄權 申請人:肇慶大華農生物藥品有限公司