一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法
2023-07-21 00:56:21
專利名稱：一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法
技術領域：
本發明ー種β -葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法， 具體涉及ー種磁性固定化β -葡萄糖苷酶的製備方法，以及該固定化酶在秸稈纖維素水解中的應用，屬於生物催化技術領域。
背景技術：
β -葡萄糖苷酶(EC3. 2. 1. 21)又稱纖維ニ糖酶，是一種能夠水解結合於末端非還原性的β-D-葡萄糖苷鍵的水解酶。它能夠作用於纖維ニ糖或纖維寡糖，使其水解為葡萄糖分子，也是纖維素酶的成分之一，可以協同纖維素酶提高木質纖維素水解的速度和程度。 在纖維素降解、食品風味的改善等領域具有廣泛的應用。一般認為纖維素類物質經酶促作用生成葡萄糖至少需要三種酶內切葡聚糖酶，外切纖維ニ糖水解酶和纖維ニ糖酶(β -葡萄糖苷酶)。內切葡聚糖酶和外切纖維ニ糖酶把纖維素降解成纖維ニ糖，它再被纖維ニ糖酶分解成葡萄糖，纖維素酶的重要作用是通過這三種酶協同進行，最後將纖維素轉化為葡萄糖，因此在這個過程中纖維ニ糖酶起到關鍵作用。而在多數的纖維素酶組成中纖維ニ糖酶組分較少，活力低，影響ニ糖類物質分解，成為纖維素酶整個水解的瓶頸。纖維素是葡萄糖以1，4-糖苷鍵結合的聚合物，為植物細胞壁的構成成分，佔植物乾重的1/2到1/3。全球一年間由光合作用生產的的纖維素達1000億噸，是最豐富的可再生資源。將植物纖維應用於發酵食品エ業原料，具有緩減資源短缺的優勢，將對人類是ー個重大貢獻。因此，開發優化纖維素水解的方法具有良好的應用價值。由於多數商品纖維素酶液中，葡萄糖苷酶活力低，在纖維素酶中額外添加適量的葡萄糖苷酶，可以一定程度上提高秸稈纖維素的酶解率。但商品葡萄糖苷酶價格昂貴，通過固定化酶能實現其回收利用，因此降低酶的使用成本。雖然國內外對固定化葡萄糖苷酶研究較多，如來用海藻酸鈉通過吸附法固定葡萄糖苷酶(催化學報，2008，四(10) :1021-20 )；採用ACA微膠囊固定β -葡萄糖苷酶(現代化工，2009， 29(10):51-54).但是這些固定化酶是應用在均相體系的反應中。纖維素酶水解秸杆的產物除了水解得到的糖類外，還有其它固體殘渣，這給固定化酶的回收造成困難。雖然中國專利CN101270352A公布了ー種用磁性納米顆粒固定β -葡萄糖苷酶的方法，該法製備納米固定化酶過程較複雜，酶活回收率不高，且無在秸杆纖維素非均相反應體系中的應用報導。
發明內容
本發明的目的是提供ー種葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法，本發明針對纖維素酶水解秸杆反應體系，通過製備磁性固定化酶，實現
葡萄糖苷酶的反覆利用。本發明的技術方案
本發明提供了ー種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法。包括
(1)用殼聚糖、丙酸、PEG400和!^e3O4顆粒製備磁性殼聚糖微球，並用戊ニ醛活化，得到固定化載體；
(2)β -葡萄糖苷酶吸附於磁性殼聚糖微球固定化載體上，得磁性固定化β -葡萄糖苷
酶；
(3)磁性固定化β-葡萄糖苷酶協同纖維素酶水解秸稈纖維素。該方法製得的磁性固定化β -葡萄糖苷酶在溫度、PH及使用次數上面表現出良好的穩定性。將此固定化酶應用於水解秸稈，表現出一定的促進作用。以下是本發明方法的詳細描述 固定化載體的製備
在45飛0 mL去離子水體系中，殼聚糖質量為0. 5^1. 0 g，丙酸質量分數為1. 59Γ2. 5%， PEG400為40 60 μ L，Fe3O4顆粒質量為0. 5 1. 0 g，將上述組份攪拌均勻，形成透明均一的膠體後，除去氣泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，靜置8 12 h，得到殼聚糖磁性微球， 過濾後Ig殼聚糖磁性微球用20mL 1. 59Γ3. 0%的戊ニ醛溶液在25°C處理2、h，過濾後得到固定化載體；
磁性殼聚糖微球固定化載體吸附β-葡萄糖苷酶
將0. 5 0. 8 g固定化載體加入到8 12 mL、pH4. 5 5. 0的β -葡萄糖苷酶溶液中，酶活為0.6-10 CBIU/mL，於150 200 r/min、2(T25°C下震蕩5 15 h，得到磁性固定化β-葡萄糖苷酶。磁性固定化β -葡萄糖苷酶協同纖維素酶水解秸稈纖維素
以用常規的鹼預處理的玉米秸稈纖維素為底物，用ΡΗ4. 5、. 0的檸檬酸緩衝液配成 50^100 g/L玉米秸杆纖維素的漿液，加入固定化β -葡萄糖苷酶和纖維素酶，固定化β -葡萄糖苷酶用量為8(T150 g/L漿液(溼重)，纖維素酶的用量為1(T30 FPIU/g秸稈，在4(Γ65 °C下水解10 48 h。固定化β -葡萄糖苷酶的保存
將0. 2 0. 5 g固定化β -葡萄糖苷酶加入到0. 05 N、ρΗ4. (Γ7. 0的檸檬酸緩衝液中保存。磁性固定化β -葡萄糖苷酶酶活測定
將固定化酶0.1 g加入2 mL的纖維ニ糖底物在50°C下恆溫反應30 min，再於100°C 水浴滅活10 min，用生物傳感儀測定葡萄糖含量。酶活單位CBIU/g。其中一個纖維ニ糖酶活力國際單位(CBIU)定義為標準酶促反應條件下(50°C下恆溫反應30 min)每分鐘生成 2.0 μ mol葡萄糖的酶量。相關計算公式
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權利要求
1. 一種葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法，其特徵在於步驟為(1)用殼聚糖、丙酸、PEG400和!^e3O4顆粒製備磁性殼聚糖微球，並用戊二醛活化，得到固定化載體在45飛0 mL去離子水體系中，殼聚糖質量為0.5 1.0 g，丙酸質量分數為 1. 5% 2. 5%，PEG400為40 60 μ L，Fe3O4顆粒質量為0. 5 1. 0 g，將上述組份攪拌均勻，形成透明均一的膠體後，除去氣泡，滴入50-300 mL 2 M的NaOH溶液中，靜置8 12 h，得到殼聚糖磁性微球，過濾後Ig殼聚糖磁性微球用20 mL 1. 59Γ3. 0%的戊二醛溶液在25°C處理2、 h，過濾後得到固定化載體；(2)β -葡萄糖苷酶吸附於磁性殼聚糖微球固定化載體上，得磁性固定化β -葡萄糖苷酶將0.5 0.8 g固定化載體加入到纊12 mL、pH4.5 5.0& β -葡萄糖苷酶溶液中，酶活為 0.6-10 CBIU/mL，於150 200 r/min、2(T25°C下震蕩5 15 h，得到磁性固定化β -葡萄糖苷酶；(3)磁性固定化葡萄糖苷酶協同纖維素酶水解秸稈纖維素以用鹼預處理的玉米秸稈纖維素為底物，用ΡΗ4. 5^5. 0的檸檬酸緩衝液配成5(T100 g/L玉米秸杆纖維素的漿液，加入固定化葡萄糖苷酶和纖維素酶，固定化葡萄糖苷酶用量為8(T150 g/L漿液，纖維素酶的用量為10 30 FPIU/g秸稈，在40 65 °C下水解10 48 h。
全文摘要
一種β-葡萄糖苷酶的固定化及其協同纖維素酶水解秸稈纖維素的方法，屬生物催化技術領域。本發明方法包括(1)將殼聚糖溶解在丙酸溶液中形成透明均一的膠體，再與Fe3O4顆粒混合攪拌，滴入NaOH溶液，得到磁性微球。將磁性微球於戊二醛溶液中交聯得到固定化載體。(2)將固定化載體加入到β-葡萄糖苷酶液中進行吸附得到磁性固定化酶。用磁性固定化酶水解纖維二糖底物測其酶活性。(3)將此磁性固定化酶協同纖維素酶降解玉米秸稈。用該方法製得的固定化酶形狀均一，比表面積大，機械強度高，酶活高，易回收。並能夠協同纖維素酶水解秸稈纖維素，提高水解糖的得率，重複使用穩定性好，可降低酶法水解秸稈纖維素的成本。
文檔編號C12N11/02GK102533717SQ201210052838
公開日2012年7月4日 申請日期2012年3月2日 優先權日2012年3月2日
發明者盧嬋, 楊緒娥, 王傑, 鄭璞 申請人:江南大學