miRNA-874及其反義核苷酸的用途的製作方法

2023-07-21 00:08:36 5

專利名稱：miRNA-874及其反義核苷酸的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種內源性的非編碼小RNAs的新藥用途，具體涉及miRNA-874及其反義核苷酸的用途，尤其涉及其miRNA-874及其反義核苷酸在製備用於診斷、防治心臟疾病的藥物中的用途，屬於心臟疾病的診斷、預防和治療領域。
背景技術：
心血管疾病主要包括高血壓、冠心病、充血性心力衰竭等。目前,心血管疾病仍然是人類健康的頭號殺手，全世界範圍內每年有一千七百萬人死於心血管疾病，其死亡率已接近所有癌症死亡率的總和。在我國，隨著人民生活水平日益提高和飲食結構的改變，心血管疾病死亡率呈明顯上升趨勢，已超過癌症成為第一大致死原因。毫無疑問，預防和治療心血管疾病仍然是醫學與生物學的重大任務。
心肌肥大是指組織水平上心肌組織的增厚和細胞水平上心肌細胞體積的增大的總稱。它是由於心肌細胞體積增大而導致心臟體積增大所發生的一種疾病。該病是由一些生理和病理因素的共同刺激而發生的，它是許多心血管疾病的綜合性表現。心肌肥大是心肌病的一種，是心肌細胞針對於血液動力學增加的一種應答反應。多種情況可以引起人體內血液動力的增加，比如高血壓，心臟瓣膜疾病。長期的超負荷血液動力刺激會引起以心肌細胞體積增大為特徵的心肌細胞重塑過程，也就是心肌肥大。現在一般認為存在兩種情況的心肌肥大，一種是正常的生理性肥大，比如出生後伴隨者發育發生的心肌肥大，還有體育鍛鍊引起的心肌肥大；另外一種是病理性心肌肥大，其早期特徵是室壁和室間隔增厚，心肌收縮功能增強，因此被視為代償性肥大，如果病情一直未得到緩解，心肌肥大後期會發生心室壁間質纖維化、心肌細胞收縮功能失調以及能量代謝，基因表達和電生理特徵的異常， 最終導致心臟功能衰竭。鑑於心肌肥大的發生是一個進行性不可逆過程，而且最終會引起心力衰竭，現代醫學已經把它作為心臟發生臨床病變的一個裡程碑式的心肌形態變化，認為它是導致心臟疾病和心臟猝死的一個危險因素。
隨著近來miRNA研究的熱潮，這種內源性非編碼小RNAs已經作為一個基因表達調節的中心因子顯露，參加許多重要的生理過程。對於miRNA來說，它調控方式的特點決定了它的靶基因不會只有一個，而是一對多的方式，這就是使得miRNA的功能研究內容非常豐富。許多研究表明miRNA對於維持心臟正常生理功能具有重要作用，心臟中的miRNA異常表達與許多心臟疾病的發生相關。因此，將miRNA作為心臟疾病治療的靶點，開發相關藥物具有潛在的臨床應用價值。
儘管越來越多的miRNA作為人類疾病的生物標誌物及治療靶點被發現，但在心臟肥厚和心肌纖維化心臟疾病中的關鍵miRNA仍沒有確定，其所發揮的功能是對該領域科研人員的挑戰。發明內容
本發明所要解決的技術問題是確定或發現調控心肌細胞肥大的在心臟中表達的miRNA，進一步確定其在心肌肥厚、冠心病、心肌纖維化等心臟疾病中的關鍵作用，將其應用到這些心臟疾病的診斷、防治中。
除非特別指明，本文中的「miR-874」均指「miRNA-874」，其序列為下述SEQ ID NO: I 所示的核苷酸序列
5，-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3，。
除非特別指明，本文中的「miR-874反義核苷酸」、「874反義核苷酸」和「anta_874」 均指「miRNA-874反義核苷酸」，其序列為下述SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列
5』-UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3』 。
除非特別指明，本文中的「anta-NC」均指「miRNA-874反義核苷酸的陰性對照」，其序列為下述SEQ ID N0:7所示的核苷酸序列
5，-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3，。
除非特別指明，本文中的「PE」均指「苯腎上腺素」。
除非特別指明，本文中的「ET-1 」均指「內皮素」。
針對上目的，本發明提供的技術方案如下。
一方面，本發明提供一種miRNA-874的反義核苷酸在製備用於預防或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中，所述miRNA-874反義核苷酸的序列為下述SEQ ID N0:2的核苷酸序列5』 -UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3』。
優選地，所述miRNA-874反義核苷酸的核苷酸序列在每個鹼基均進行了 2』 -甲氧基修飾。
優選地，所述的心臟疾病選自心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰中的一種或多種。
還一方面，本發明還提供一種用於預防或治療心臟疾病的藥物組合物，其中，所述藥物包含上述本發明所述的miRNA-874反義核苷酸序列和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
優選地，所述載體選自膽固醇、納米顆粒和脂質體中的一種或多種。
優選地，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射和肌肉注射。
另一方面，本發明還提供一種miRNA-874核苷酸在製備用於診斷或預後心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，其中，所述miRNA-874的序列為下述SEQ ID N0:1的核苷酸序列
5，-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3，。
優選地，所述的心臟疾病選自心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰中的一種或多種。
本發明還提供一種用於診斷或預後心臟疾病的藥物組合物或試劑盒，其中，所述藥物組合物或試劑盒包含上述本發明所述的miRNA-874核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
優選地，所述載體選自膽固醇、納米顆粒和脂質體中的一種或多種。
本發明人通過實驗發現miRNA-874在肥大的心肌細胞和心臟肥厚中表達顯著上調。通過構建miRNA-874過表達腺病毒或miRNA-874轉基因小鼠加強miRNA-874的表達發現，miRNA-874過表達在細胞水平能誘導心肌細胞肥大的發生，miRNA-874的轉基因小鼠的心臟在用肥大刺激因子處理後與對照組相比有了明顯的肥大表型及纖維化程度，同時一些肥大基因的表達也與對照組相比有了明顯的增加。
具體的，本發明人發現miRNA-874在肥大的心肌細胞中與對照組相比有了明顯的提高，對其進行肥大指標的檢測發現，心肌肥大的指標如細胞表面積，蛋白/DAN的比值及肌小節的重組也與對照組相比都有了明顯的增加。miRNA-874的轉基因小鼠在用肥大刺激因子(苯腎上腺素)後的心臟表型，心臟體重比，邊緣區的心肌細胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)與野生型相比都有了明顯的增加。以上實驗說明miRNA-874能夠誘導心肌肥大的發生，這意味著miRNA-874可作為一種早期診斷預防心肌肥大，心肌纖維化等心臟疾病的生物標誌物。
另外，本發明人通過大量的試驗證明miRNA-874的反義核苷酸對心肌肥厚，心肌纖維化具有保護作用。具體的，本發明人在細胞水平通過轉染miRNA-874的反義核苷酸發現，它能夠抑制肥大刺激因子所誘導的心肌細胞肥大，包括肥大指標如細胞表面積，蛋白/ DAN的比值及肌小節的重組也與刺激組相比都有了明顯的降低。在動物水平通過注射外源 miRNA-874的反義核苷酸也能夠抑制肥大模型的肥大效應包括心臟表型，心臟體重比，邊緣區的心肌細胞橫截面積(WGA染色)及心肌纖維化(Masson染色)都有了明顯的降低，同時心功能也有了明顯的改善。
以上實驗說明miRNA-874的反義核苷酸通過抑制心肌細胞肥大對心臟具有保護作用，它對許多心臟疾病具有潛在的預防和治療價值，可成為一種治療心肌肥大，預防心肌纖維化的藥物。具體的，可以合成反義miRNA-874的反義核苷酸並與適當載體如膽固醇，納米顆粒，脂質體等連接形成藥物，通過口服，靜脈或肌肉注射的方式，心肌肥大和心肌纖維化等心臟疾病進行治療。


以下，結合附圖來詳細說明本發明的實施方案，其中
圖I示出了 miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟體重比及心臟功能的比較，其中，A為miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟體重比的比較；B為miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能的比較；
圖2示出了 miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠在PE刺激下心臟體重比及心臟功能的比較，其中，A為在PE刺激下，miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟體重比的比較；B為miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能的比較；
圖3示出了經心臟肥大刺激因子PE (苯腎上腺素)和ET-I (內皮素)誘導的心肌細胞肥大過程中miRNA-874表達水平的變化。其中，A為大鼠乳鼠原代心肌細胞經PE處理後miRNA-874隨時間的表達水平；B為大鼠乳鼠原代心肌細胞ET-I處理後miRNA-874隨時間的表達水平，縱坐標表示以未處理的大鼠原代心肌細胞中miRNA-874的表達水平為基準，在PE或ET-I處理過程中大鼠原代心肌細胞中miRNA-874的表達水平；
圖4示出了對經miRNA-874反義核苷酸轉染的原代細胞進行PE處理，在細胞水平上對PE所誘導的肥大的抑制情況，其中，A為心肌細胞的表面積的比較；B為蛋白/DNA比率的比較；
圖5示出了對小鼠進行靜脈注射miRNA-874反義核苷酸(antagomir)能抑制PE所誘導的肥大模型，其中，檢測指標包括A心肌細胞橫截面積(WGA染色)和B心臟體重比。
具體實施方式
下面結合具體實施例來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。
除非特別指明，以下實施例中所用到的小鼠的品系均為C57/BL6，其中，miRNA-874 轉基因小鼠購自瀋陽醫學院，野生型小鼠購自北京醫科大學。
除非特別指明，以下實施例中涉及的各種實驗方法和操作，包括大鼠乳鼠原代心肌細胞的製備和培養，腺病毒的構建及感染心肌細胞的劑量，細胞表面積測量，蛋白/DNA比值計算，肌小節結構的染色，心臟石蠟切片，HE染色及WGA染色， 心臟體重比的檢測方法，心臟功能指標的詳細敘述，載體的構建、擴增及轉染，細胞染色等等，均可參見以下文獻W. -Q. Tan, et al, Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy throughTransactivating Catalase J Biol Chem. 2008 October 31;283(44):29730-29739 ；ffang K, et al,miR-9 and NFATc3 regulate myocardin in cardiachypertrophy, J Biol Chem. 2010 Apr 16;285(16): 11903-12 ;Lin Z, et al, miR-23afunctions downstream of NFATc3 to regulate cardiac hypertrophy, PNAS, 2009，106(29) : 12103-12108)。上述文獻在此全文引入作為參考。
實施例I miRNA-874轉基因小鼠的心臟體重比及心功能與野生型相比沒有明顯的醚
對miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠心臟進行心臟體重比分析，其中，兩組小鼠各自的取樣數量均為26隻。實驗結果如圖IA顯示miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠相比心臟體重比沒有顯著的提高，說明miRNA-874轉基因小鼠本身並沒有明顯的肥大表型改變。
同時檢測的心功能的指標包括左心室後壁厚度(LVPWd)，短軸縮短率(FS)。如圖I 中的B所示，，實驗結果顯示miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟功能沒有明顯的區別。
實驗例2 miRNA-874轉基因小鼠在PE (苯腎上腺素)刺激下與野牛型小鼠相比心臟體重比及心功能有了明顯的改變
對miRNA-874轉基因小鼠與野生型小鼠的心臟用肥大刺激因子PE進行腹腔埋泵注射處理，其中，取用miRNA-874轉基因小鼠6隻，野生型小鼠6隻，PE用量為75mg/kg/ 天。對照組分別為使用生理鹽水代替PE進行處理的miRNA-874轉基因小鼠和野生型小鼠。 二周後進行心臟體重比分析，見圖2中的A。實驗結果如圖2A所顯示的，miRNA-874轉基因小鼠經過PE處理後的心臟體重比與對照組相比有了顯著的提高，說明經過PE處理後的 miRNA-874轉基因小鼠有了明顯的肥大表型改變。
心功能的檢測包括LVPWd (左心室後壁厚度)，FS (短軸縮短率)以及LVSd(室間隔厚度)，如圖2中的B所示，結果表明，以上指標與野生型小鼠相比有了明顯的肥大改變(見圖2中的B)。
實驗例3在PE和內皮素(ET-1)刺激下miRNA-874表汰水平的變化
對於心肌細胞肥大模型，採用本實驗室已建立的方法培養大鼠乳鼠原代心肌細胞，對心肌細胞用PE和ET-I (PE的用量為50μΜ;ΕΤ-1的用量為IOOnM)進行處理，在培養的不同時間，提取細胞的總RNA，利用實時螢光定量PCR技術檢測(可參見以下文獻 ff. -Q. Tan, Kun Wang, et al. , Foxo3a Inhibits Cardiomyocyte Hypertrophy through Transactivating Catalase. J Biol Chem. 2008 October 31;283 (44):29730-29739)
具體為，PCR擴增miRNA-874的基因序列
(TTAGCCCTGCGGCCCCACGCACCAGGGTAAGAGAGACTCGCTTCCTGCCCTGGCCCGAGG, SEQ ID NO:3)及其上下遊兩端各將近200個bp的序列，擴增片段約476bp，具體為
( 'KHilX Y X X ( ( IXiA 77 ( 7'I CTCTTTGGGTTTTGCCTTCATGCTTTCTGGTT GTTGGATGTGTGCCCCAACCCCCCCTGCCCCAGTTGTTTCTGAATATTGCCATCAGTTCCTGTCAGGGGCAC CTGTTGCTTAAGAGCCTGCGTGGGCCAGTCTTCTACTCTACTGGACACACTTCCATTGGATGAATTTTTCTG G T G TTAGCCCTGCGGCCCCACGCACCAGGGTAAGAGAGACTCG CTTCCTGCCCTGGCCCGAGG GACCGACTGGCTGGGCCTGCTTTCTGCCCAGCTTACCTGTCA CGGAAGAGAGTCTGGACACACACGACTACTCTTGCCCCACGGAGAAAGTGTGCACAGCCTGGGCTGTCCCCTCTGA CCTGAGTGGACGTCTCCTGTGGCCAGGGTTAGAGTCTCCATCCACACGTGTTTACCAGTGTTTACCATCTGCTCTG TC \A ( ΧιΤαη Λ IZI ll 'Acaac (； (SEQID NOW)，其中帶下劃線加黑的為 miRNA-874 的基因序列；其餘的為它的上下遊序列，帶下劃線斜體的為上遊引物序列和下遊引物的反向互補序列，
(PCR 體系 50ul，PCR 條件如下95。C 3min 一個循環；95。C 30sec，56。C30sec，72。C Imin 共 28 個循環；最後 72。C 延伸 5min)，PCR 引物設計如下，
上遊引物5』-CATGGTCCCCACTCTGATTCT-3』(SEQID NO:5)，
下遊引物5』-GGCCGTGAGAATCAACACGTG-3』(SEQID NO:6)
miRNA-874的表達水平。實驗結果如圖3所顯示的，miRNA-874表達水平在PE和 ET-I處理6小時之內有了顯著的上升(見圖3中A和B)。
實驗例4 miRNA-874反義核苷酸能夠在細胞水平上抑制PE所誘導的fl巴大
對大鼠乳鼠原代心肌細胞進行miRNA-874反義核苷酸的轉染，轉染的具體步驟可參見以下文獻Kun Wang, Bo Long, et al. , miR-484 regulatesmitochondrial network through targeting Fisi. Nature Communications. 2012April 17; 781 (3) 同時使用 PE 對心肌細胞進行處理，PE的用量為50 μ Μ，經過24小時之後，對心肌細胞進行心肌肥大指標的檢測，例如細胞表面積(見圖4中的Α)和蛋白/DNA (見圖4中的B)的檢測。實驗結果如圖4所顯示的，經miRNA-874反義核苷酸(anta_874)轉染的細胞表面積和蛋白質/DNA比率明顯低於miRNA-874反義核苷酸的陰性對照組(anta_NC)(見圖4中的A和圖4中的B)， 這證明miRNA-874反義核苷酸能夠有效地抑制PE所誘導的心肌細胞肥大。
實驗{列5小鼠靜脈注身寸miRNA-874反義核 ΡΙΙ (antagomir)倉ΜΦ擊!I PE所誘導的肥大模型
此實驗所用的miRNA-874的反義核苷酸均為經過修飾的miRNA-874反義核苷酸，修飾方式為對miRNA-874反義核苷酸的每個鹼基都進行了 2』 -甲氧基修飾用以增加 miRNA-874反義核苷酸在體內的穩定性。miRNA-874反義核苷酸的修飾及合成都是由上海吉瑪公司完成的。7
取小鼠24隻，平均分成4組。對小鼠用PE埋泵處理二周後(同實施例2的操作)， 小鼠的心臟有明顯的肥大改變。對經PE處理的小鼠進行靜脈注射miRNA-874反義核苷酸 anta-874或miRNA-874反義核苷酸的陰性對照(anta_NC),注射量為每隻小鼠30mg/kg/天 (anta-NC 的序列為 5』 -CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3』 (SEQ ID NO: 7)，修飾方式與 miRNA-874 反義核苷酸的修飾方式相同，也是由上海吉瑪公司合成)。對上述小鼠進行細胞的橫截面積大小(通過WGA染色法)(見圖5中的A)及心臟體重比(見圖5中的B)的檢測。實驗結果如圖5所顯示的，加入miRNA-874反義核苷酸(anta-874)可以明顯減弱PE所誘導的肥大效應 (見實施例5);但是，同時向小鼠注射miRNA-874反義核苷酸的陰性對照(anta-NC)和PE， 並不能減弱PE所誘導的肥大效應(見圖5中的A和B)。以上的實驗結果證實miRNA-874反義核苷酸能夠在整體水平抑制PE所誘導的心臟肥大的發生。
權利要求
1.一種miRNA-874的反義核苷酸在製備用於預防或治療心臟疾病的藥物中的用途，其中，所述miRNA-874反義核苷酸的序列為下述SEQ IDNO:2的核苷酸序列5，-UCGGUCCCUCGGGCCAGGGCAG-3，。
2.根據權利要求I所述的用途，其特徵在於，所述miRNA-874反義核苷酸的核苷酸序列在每個鹼基均進行了 2』 -甲氧基修飾。
3.根據權利要求I或2所述的用途，其特徵在於，所述的心臟疾病選自心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰中的一種或多種。
4.一種用於預防或治療心臟疾病的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物包含權利要求I至3中任一項中所述的miRNA-874反義核苷酸序列和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
5.根據權利要求4所述的藥物組合物，其特徵在於，所述載體選自膽固醇、納米顆粒和脂質體中的一種或多種。
6.根據權利要求4或5所述的藥物組合物，其特徵在於，所述藥物組合物的給藥方式選自口服、靜脈注射和肌肉注射。
7.—種miRNA-874核苷酸在製備用於診斷或預後心臟疾病的藥物或試劑盒中的用途，其中，所述miRNA-874的序列為下述SEQ ID NO: I的核苷酸序列5，-CUGCCCUGGCCCGAGGGACCGA-3，。
8.根據權利要求7所述的用途，其特徵在於，所述的心臟疾病選自心肌肥厚、心肌纖維化、冠心病及心衰中的一種或多種。
9.一種用於診斷或預後心臟疾病的藥物組合物或試劑盒，其特徵在於，所述藥物組合物或試劑盒包含權利要求7或8中所述的miRNA-874核苷酸和藥學上可接受的載體、病毒或輔料。
10.根據權利要求9所述的藥物組合物或試劑盒，其特徵在於，所述載體選自膽固醇、納米顆粒和脂質體中的一種或多種。
全文摘要
本發明公開了一種miRNA-874及其反義核苷酸的用途，具體為miRNA-874反義核苷酸在製備用於治療和預防重大心臟疾病(心肌肥大，心肌纖維化)的藥物組合物中的作用，以及miRNA-874核苷酸在製備用於診斷或預後上述心臟疾病的藥物組合物或試劑盒中的作用。miRNA-874的反義核苷酸能夠抑制心臟肥厚及心肌細胞肥大，同時也具有改善心功能、抑制心臟結構重塑及心臟纖維化的功能。miRNA-874的反義核苷酸可以作為一種新型的藥物作用靶點，對心肌肥大起到防治作用，對於由心肌肥大引起的心肌纖維化、冠心病及心衰等心臟疾病的預防及治療在臨床上具有重要意義。
文檔編號A61K31/7105GK102973953SQ20121051309
公開日2013年3月20日 申請日期2012年12月4日 優先權日2012年12月4日
發明者李培峰, 王昆 申請人:中國科學院動物研究所