一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法與流程

2023-05-27 14:58:11 1

本發明屬於動物源性成分檢測技術領域，具體涉及一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，利用特異性引物採用實時螢光定量PCR(聚合酶鏈式反應)法檢測鼠源性成分。

背景技術：
：

PCR(聚合酶鏈式反應)是利用DNA在體外95℃的高溫時變性成單鏈，在60℃左右的低溫時，引物與單鏈按鹼基互補配對的原則結合，再調溫度至DNA聚合酶最適宜的72℃反應溫度，DNA聚合酶沿著磷酸到五碳糖(5'-3')的方向合成互補鏈，基於聚合酶製造的PCR儀實際就是一個溫控設備，能在變性溫度、復性溫度和延伸溫度之間很好地進行控制；聚合酶鏈式反應是一種用於放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術，能夠看作是生物體外的特殊DNA複製，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加，所以，無論是化石中的古生物或歷史人物的殘骸，還是幾十年前兇殺案中兇手所遺留的毛髮、皮膚或血液，只要能分離出一丁點的DNA，就能用PCR加以放大，進行比對；老鼠肉冒充價格昂貴的牛羊肉是一些利慾薰心的商家經常採用的惡劣手段，老鼠肉直接冒充牛羊肉或摻雜在牛羊肉製品中流入老百姓的餐桌，帶來了極大的社會影響，對使用者造成巨大的人身傷害，這是因為老鼠自身攜帶多種病菌，本身就是多種傳染病病原的儲存宿主和主要傳染源，同時，老鼠肉所含的鉛和砷等有毒有害物質的含量也遠高於其他肉類，直接食用會給人們帶來極大的身體危害和疫病傳染風險，輕則中毒，重則死亡；目前，尚沒有鼠源性成分檢測的國家標準或者行業標準，普通消費者乃至食藥質監部門通過肉眼難以鑑別，且傳統檢測方法繁瑣，耗時長。本發明旨在通過實時螢光定量PCR核酸檢測技術，開發一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，為鼠源性成分的檢測提供技術支持，為標準方法的建立提供實驗支撐，為打擊肉類摻假提供有力的科學依據，具有良好的社會和應用前景。

技術實現要素：
：

本發明的目的在於克服現有技術的不足，設計一種特異性引物檢測鼠源性成分的方法，為鼠源性成分的檢測提供技術支持，為標準檢測方法的建立提供實驗支撐，為打擊肉類摻假行政執法提供有力的科學依據。

為了實現上述目的，本發明涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物設計合成、DNA提取、反應體系建立、PCR擴增、鼠源性成分分析結果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設計合成：根據Genba nk中鼠的線粒體細胞色素b(Cyt b)基因序列設計併合成特異性引物，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉組織1g研磨成糜狀，然後按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free(去RNA酶與DNA酶)H2O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上遊引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下遊引物R以及體積為5μL的2×Master mixture(2×反應混合物)，剩餘部分用RNase/DNase-free H2O補足，實現反應體系的建立，並設置平行試驗；

(4)、PCR擴增：將步驟(3)建立的反應體系置於實時螢光定量PCR儀上，設置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環，在72℃時採集螢光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環；

(5)、鼠源性成分分析結果評價：測定並加權計算實時螢光定量PCR產物平均Cp值，Cp值小於33，熔解曲線顯示有明顯的單一主峰，無非特異性PCR產物，表明利用該特異性引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性和重複性良好。

本發明涉及的特異性引物根據Genbank(DNA序列資料庫)中鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成的，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』。

本發明涉及的特異性引物的特異性表現在溶解曲線圖中只有明顯的單一主峰，沒有其他峰，對鼠源性成分有針對性，引物具有純真性，主峰具有單一性，只能合成單一物質。

本發明涉及的特異性引物的鹼基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；實時螢光定量PCR儀為Roche(羅氏)生物科技公司生產的Light Cycler 480式實時螢光定量PCR；核酸蛋白分析儀為Biochrom(柏諾)有限公司生產的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機是湖南湘儀實驗設備有限公司生產的臺式高速冷凍離心機；2×Master mixture為Roche(羅氏)生物科技公司生產的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司生產的組織基因組DNA提取試劑盒。

本發明與現有技術相比，基於鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成了利用實時螢光定量PCR法檢測鼠源性成分的特異性引物，能夠實現對鼠源性成分定性檢測的功效。

本發明的有益效果是提供利用實時螢光定量PCR檢測鼠源性成分的引物，該引物具有良好的特異性和重複性，使得利用該引物進行的實時螢光定量PCR法檢測鼠源性成分時的操作簡便、耗時少、特異性高，避免了傳統檢測方法中取出擴增產物進行電泳鑑定時擴增產物造成的二次汙染，為鼠源性成分的檢測提供了新的途徑。

附圖說明：

圖1為本發明實施例1涉及的溶解曲線圖。

圖2為本發明實施例2涉及的溶解曲線圖。

具體實施方式：

下面通過實施例並結合附圖對本發明做進一步描述。

實施例1：

本實施例涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物合成、DNA提取、反應體系建立、PCR擴增、鼠源性成分分析結果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設計合成：根據Genbank中鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成特異性引物，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉組織1g研磨成糜狀，然後按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free H2O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上遊引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下遊引物R以及體積為5μL的2×Master mixture，剩餘部分用RNase/DNase-free H2O補足，實現反應體系的建立；同時，設置三組平行實驗；

(4)、PCR擴增：將步驟(3)建立的反應體系置於實時螢光定量PCR儀上，設置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環，在72℃時採集螢光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環。

(5)、鼠源性成分分析結果評價：經測定得到三組平行實驗的Cp值分別為16.35、16.94和16.10，經加權平均計算得到Cp值為16.47，Cp值的標準差為0.430，熔解曲線如圖1所示，有明顯的單一主峰，且重合度良好，表明利用該引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性好。

本實施例涉及的特異性引物根據Genbank中鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成的，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』。

本實施例涉及的特異性引物的特異性表現在溶解曲線圖中只有明顯的單一主峰，沒有其他峰，對鼠源性成分有針對性，引物具有純真性，主峰具有單一性，只能合成單一物質。

本實施例涉及的特異性引物的鹼基序列是由上海捷瑞生物工程有限公司合成的；實時螢光定量PCR儀為Roche(羅氏)生物科技公司生產的Light Cycler 480式實時螢光定量PCR；核酸蛋白分析儀為Biochrom(柏諾)有限公司生產的BioDrop-μLite式核酸蛋白分析儀；高速冷凍離心機是湖南湘儀實驗設備有限公司生產的臺式高速冷凍離心機；2×Master mixture為Roche(羅氏)生物科技公司生產的LightCycler480SYBR Green I Master；DNA提取試劑盒為天根生化科技有限公司生產的組織基因組DNA提取試劑盒。

實施例2：

本實施例涉及的特異性引物檢測鼠源性成分的方法的工藝過程分為特異性引物合成、DNA提取、反應體系建立、PCR擴增、鼠源性成分分析結果評價五個步驟：

(1)、特異性引物設計合成：根據Genbank中鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成特異性引物，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』；

(2)、DNA提取：取鼠肌肉組織(與實施例1的鼠源不同)1g研磨成糜狀，然後按照組織基因組DNA提取試劑盒使用說明操作，提取DNA，經核酸蛋白分析儀測定提取的DNA的濃度為220ng/μL，純度為1.85，用RNase/DNase-free H2O將提取的DNA濃度稀釋為5ng/μL，備用；

(3)、反應體系建立：以步驟(2)提取的DNA為模板，用特異性引物建立10μL的PCR反應體系，取體積為2μL和濃度為5ng/μL的DNA模板、體積為1μL和濃度為5μM的上遊引物F、體積為1μL和濃度為5μM的下遊引物R以及體積為5μL的2×Master mixture，剩餘部分用RNase/DNase-free H2O補足，實現反應體系的建立；同時，設置三組平行實驗；

(4)、PCR擴增：將步驟(3)建立的反應體系置於實時螢光定量PCR儀上，設置以下條件：①、模板變性：95℃-5min；②、QPCR擴增：95℃-20s，60℃-10s，72℃-10s，40個循環，在72℃時採集螢光信號；③、熔解曲線：95℃-5s，65℃to 97℃的速率為0.5℃/5s，1個循環。

(5)、鼠源性成分分析結果評價：經測定得到三組平行實驗的Cp值分別為16.33、16.94和16.28，經加權平均計算得到Cp值為16.52，Cp值的標準差為0.366，熔解曲線如圖2所示，有明顯的單一主峰，且重合度良好，表明利用該引物能夠檢測到鼠源性成分，且特異性好。

本實施例涉及的特異性引物根據Genbank中鼠的線粒體細胞色素b基因序列設計併合成的，特異性引物的上遊引物F的鹼基序列為5』-GCCTTATAATTAATTGGAGGTA-3』，特異性引物的下遊引物R的鹼基序列為5』-AGCTATATTATGTGCTTGAT-3』。

上遊引物F：GCCTTATAATTAATTGGAGGTA

下遊引物R：AGCTATATTATGTGCTTGAT