L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌及其構建方法與應用的製作方法
2023-05-27 09:39:46 1
專利名稱：L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌及其構建方法與應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於基因工程技術領域，具體的說涉及L-乳酸脫氫酶基因缺失突變株及 其構建方法用於生產高光學純度的D-乳酸。
背景技術：
乳酸作為三大有機酸之一，根據其旋光性可分為D-乳酸、L-乳酸和D，L乳酸。目 前，國際上主要由微生物發酵生產乳酸，其中，L-乳酸因具有廣泛的生物兼容性，因而，得到 了較早的開發和生產，其生產技術和產品已趨向於成熟。隨著，D-乳酸新功能的發掘，其生 產和應用的研究得到了人們越來越廣泛的關注。D-乳酸在食品、醫藥、化工、農業等方面應用極其廣泛，尤其是乳酸的聚合物-聚 乳酸(PLA)，因具有良好的生物相容性而易被生物降解，用其取代現今大量使用的聚乙烯塑 料，成為解決當今日益嚴重的白色汙染一種重要方法。乳酸根據其旋光性，其聚合後得到 的聚乳酸分為聚L-乳酸(PLLA)、聚D-乳酸(PDLA)及聚D，L-乳酸(PDLLA)。PLLA最早得 到了開發和生產，但由於其熔點低和降解速度慢等缺點，使得聚乳酸的應用遇到了阻礙。隨 著，PDLA和PLLA共混合物能夠增加聚乳酸熱穩定性和其生物降解速度的發現，聚乳酸的研 究和應用得到了快速的發展。作為合成PDLA的原料，高純度的D-乳酸的生產研究成為目 前研究的熱點。D-乳酸的生產方法主要有⑴化學合成法；(2)酶法；(3)微生物發酵法。微生物 發酵生產乳酸是以澱粉、葡萄糖等原料經微生物發酵而得，與其它兩種方法相比較，微生物 發酵法可以通過菌種的選育、代謝的調控而生產專一性的D-乳酸，而且原料的來源廣泛， 生產成本低，產品純度高，安全性好，因此，發酵法生產D-乳酸是目前生產乳酸的最重要方 法。目前，D-乳酸的生產菌株主要包括乳酸菌、大腸桿菌以及釀酒酵母。乳酸菌作為最早 應用於乳酸工業化生產的菌株，其具有發酵效率高、產量高的優勢，但其原料成本和後續分 離成本偏高，制約了 D-乳酸工業的發展；大腸桿菌所需原料簡單，並且可以以戊糖為唯一 碳源生產乳酸，但其生產效率過於低下，無法滿足工業化生產的需求；釀酒酵母具有良好的 耐酸性，免去了中和劑的加入，降低了乳酸生產的後續分離成本，但其同樣存在生產效率低 下的問題。因而，目前D-乳酸工業化生產中所存在的關鍵性的問題在於如何在低原料成本 下實現高效率、高光學純度的D-乳酸生產。2005年Okino等人通過對厭氧條件下穀氨酸 棒桿菌中有機酸代謝的研究，發現在厭氧條件下穀氨酸棒桿菌能夠在相對簡單的原料成本 下實現有機酸的高效生產，其中乳酸為主要的有機酸產物。這一研究為解決D-乳酸工業化 生產中的問題提供了 一種新的解決方式。本實驗室通過對穀氨酸棒桿菌厭氧條件下代謝 途徑的初步分析發現，在厭氧條件下穀氨酸棒桿菌中生成的乳酸為L-乳酸和D-乳酸的混 合酸，因而，本實驗根據這一特性，設計了相應的實驗方案，敲除了穀氨酸棒桿菌ATCC13032 中的L-乳酸脫氫酶基因，在穀氨酸棒桿菌中實現了高光學純度D-乳酸的生產。(Calabia BP,Tokiwa Y (2007)Productionof D-Iactic acid from sugarcane molasses，sugarcane juice and sugar beet juice by Lactobacillusdelbrueckii. Biotechnology Letters29 :1329-1332 ；Zhou S，Causey TBiHasona A，Shanmugam KT,Ingram LO (2003)Production of optically pure D-Iactic acid in mineral salts medium bymetabolicalIy engineered Escherichia coli W3110. Applied and Environmental Microbiοlogy69 399-407 ；Ishida N，Suzuki T，Tokuhiro K，Nagamori E，Onishi T，Saitoh S，Kitamoto K， Takahashi H(2006)D-Lactic acid production by metabolically engineered Saccharomycescerevisiae. Journal ofBioscience and Bioengineering 101:172-177)目前，國內對D-乳酸產生菌的基因工程改造鮮有報導，更未見通過基因敲除阻斷 菌株中L-乳酸代謝途徑的相關報導。因而，開發具有自主智慧財產權的L-乳酸脫氫酶基因 缺失的工程菌，實現高光學純度的D-乳酸生產，打破國外在這一領域的壟斷地位，具有迫 切的現實意義和應用價值。
發明內容
本發明的目的是針對目前國內缺乏基因工程菌產D-乳酸，開發一株L-乳酸脫氫 酶基因缺失的工程菌用於產高光學純度的D-乳酸，並提供一種L-乳酸脫氫酶基因缺失的 構建方法。從穀氨酸棒桿菌ATCC13032中分離克隆出L-乳酸脫氫酶基因的上遊序列Idhl和 下遊序列ldh2，利用重疊PCR技術將其拼接成ldhl-ldh2，其作為Idh基因敲除的同源片 段，與基因敲除載體pKlSmobsacB連接，構建了穀氨酸棒桿菌中Idh基因的敲除載體，將其 轉化入宿主菌株，通過卡那抗性和蔗糖培養基的的雙向篩選，建立了 L-乳酸生物合成途徑 被阻斷的基因敲除工程菌株C. glutamicum Resl67Aldh。然後，通過基因敲除菌株的固體 平板培養基生長實驗，顯示基因敲除菌株在以L-乳酸為唯一碳源的基本培養基上不能生 長，證明了 L-乳酸脫氫酶基因的缺失阻斷了菌體中L-乳酸的代謝，提供了一株能夠進行高 光學純度D-乳酸生產的基因工程菌。因此，製備L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌方法，主要包括以下步驟(1)根據穀氨酸棒桿菌ATCC13032基因組Idh編碼基因的上下遊DNA序列，設計 PCR引物；(2)以穀氨酸棒桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，擴增Idh基因上下遊片段Idhl 和ldh2，利用重疊PCR進行拼接，構建基因敲除同源片段ldhl-ldh2 ；(3)建立連入ldhl-ldh2的Idh編碼基因的基因敲除載體pK18mobsacB-ldh ；(4)電轉化製備穀氨酸棒桿菌ATCC13032的感受態細胞；(5)利用卡那抗性的正向篩選和10%蔗糖培養基的反向篩選，篩選出陽性菌株， PCR驗證得到L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌C. glutamicum Resl67 Δ Idh0本發明的穀氨酸棒桿菌達，為 Resl67 Δ Idh (Corynebacterium glutamicum Resl67 Δ ldh)，已經於2010年7月2日，在北京市朝陽區北辰西路1號院3號的保藏於中 國微生物菌種保藏管理中心進行了保藏，保藏編號分別為CGMCC No. 3973。
對基因敲除菌株進行厭氧條件下的發酵試驗，檢測L-乳酸脫氫酶基因缺失的穀氨酸 棒桿菌產乳酸的代謝情況。本發明利用同源重組的方法使穀氨酸棒桿菌中L-乳酸脫氫酶基因沉默，從而得 到產純D-乳酸的基因工程菌。用本發明的工程菌進行乳酸發酵生產，其D-乳酸產量量達到20g/L以上，純度為99%以上。本發明將在D-乳酸的工業化生產中發揮重要作用，具有 廣闊的應用前景。
圖1 重疊PCR拼接Idh基因上下遊同源片段示意圖；圖2 重組載體pEASY-Tl-ldh構建示意圖；圖3 :ldh基因敲除載體pK18mobsacB_ldh構建示意圖。
具體實施例方式材料1. Taq Plus DNA聚合酶(天根生化科技有限公司，中國北京)。2. T4連接酶以及EcoR I、HindIII等限制性內切酶(Fermentas公司產品，中國上 海)。3.質粒抽提試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。4. DNA凝膠回收試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。5.基因組提取試劑盒(天根生化科技有限公司，中國北京)。6.質粒載體pEASY-Tl、pK18mobsacB (北京全式金生物技術有限公司， ATCC87097)。7.穀氨酸棒桿菌ATCC13032、DH5 α (北京全式金生物技術有限公司)。8.卡那黴素、氨苄青黴素(Sigma公司)。9. BHIS培養基(g/L)牛腦心浸粉18. 5、山梨醇91分別滅菌後混合。10. LB液體培養基(g/L)酵母浸粉5，蛋白腖10，氯化鈉10高壓滅菌。ll.Gene Pulser Xcell 型電穿孔儀(BI0-RAD 公司產品，美國)。實施例1 基因敲除載體的構建一、L-乳酸脫氫酶基因上下遊序列的拼接(1)根據穀氨酸棒桿菌中Idh基因(NCBI-GI =58036263)上下遊DNA序列，設計引 物PCR擴增其上下遊序列，引物序列如下uldhl 5' -CCAAGGTGCCGACACTAAT-3『dldhl 5' -CGGTGATTTCGCAACTCCAACATCTCCTG-3『uldh2 5' -TTGGAGTTGCGAAATCACCGACCACGAGA-3『dldh2 5' -GCTTCCAGACGGTTTCATC-3『以穀氨酸棒桿菌ATCC13032的基因組DNA為模板，在引物uldhl、dldhl和uldh2、 dldh2的引導下，PCR克隆Idh基因的上下遊同源臂序列，PCR的擴增條件和體系如下反應體系擴增條件成分體積 溫度 時間uldhl(lOpM) 1 μ 195 °C 2mindNTP (200 μΜ) 4 μ
dldhl (IOpM)1 μ
94 °C
53 °C
30 cycles緩衝液5μ172 °C模板Ιμ 72 °C去離子水37·5μ14 °C聚合酶0· 5 μ 1
30min
IOmin總體積50 μ 1所得的PCR產物經1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，得到大小為700bp SOObp之間的 電泳條帶，將PCR產物切膠、純化，以純化後的PCR產物為模板，利用重疊PCR對上下遊片段 進行拼接(圖1)，將其與T載體pEASY-Tl連接後，轉化DH5 α大腸桿菌感受態細胞，在氨苄 青黴素的抗性平板上篩選陽性轉化子，提質粒，用限制性內切酶EcoRI和HindIII進行雙酶 切驗證，經酶切獲得1500bp大小的酶切片段，表明獲得了插入序列正確的重組質粒，命名 為pEASY-Tl-ldh (圖幻，為了保證重組片段的正確性，對PCR產物進行測序，測序後產物基 因序列如下AAGGTGCCGACACTAATGCCCGCGATCGTCTCCTTCGGTCCAAAATTCTTCTGCCCAATCAGCCGGATT TGGGTGCGATGCCTGATCAATCCCACAACCGTGGTGGTCAACGTGATGGCACCAGTTGCGATGTGGGTGGCGTTGTA AATTTTCCTGGATACCCGCCGGTTGGTTCTGGGGAGGATCGAGTGGATTCCCGTCGCTGCCGCATGCCCCACCGCTT GTAAAACAGCCAGGTTAGCAGCCGTAACCCACCACGGTTTCGGCAACAATGACGGCGAGAGAGCCCACCACATTGCG ATTTCCGCTCCGATAAAGCCAGCGCCCATATTTGCAGGGAGGATTCGCCTGCGGTTTGGCGACATTCGGATCCCCGG AACTAGCTCTGCAATGACCTGCGCGCCGAGGGAGGCGAGGTGGGTGGCAGGTTTTAGTGCGGGTTTAAGCGTTGCCA GGCGAGTGGTGAGCAGAGACGCTAGTCTGGGGAGCGAAACCATATTGAGTCATCTTGGCAGAGCATGCACAATTCTG CAGGGCATAGGTTGGTTTTGCTCGATTTACAATGTGATTTTTTCAACAAAAATAACACTT GGTCTGACCACATTTT CGGACATAATCGGGCATAATTAAAGGTGTAACAAAGGAATCCGGGCACAAGCTCTTGCTGATTTTCTGAGCTGCTTT GTGGGTTGTCCGGTTAGGGAAATCAGGAAGTGGGATCGAAAATGAAAGAAACCGTCGGTAACAAGATTGTCCTCATT GGCGCAGGAGATGTTGGAGTTGCGAAATCACCGACCACGAGATGGAACGCTTCAAGCATTCCGCAAATACCCTGCGC GAAATTCAGAAGGAGTTCTTCTAAATCTTTGGCGCCTAGTTGGCGACGCAAGTGTTTCATTGGAACACTTGCGCTGC CAACTTTTTGGTTTACGGGCACAATGAAACTGTTGGATGGAATTTAGAGTGTTTGTAGCTTAAGGAGCTCAAATGAA TGAGTTTGACCAGGACATTCTCCAGGAGATCAAGACTGAACTCGACGAGTTAATTCTAGAACTTGATGAGGTGACAC AAACTCACAGCGAGGCCATCGGGCAGGTCTCCCCAACCCATTACGTTGGTGCCCGCAACCTCATGCATTACGCGCAT CTTCGCACCAAAGACCTCCGTGGCCTGCAGCAACGCCTCTCCTCTGTGGGAGCTACCCGCTTGACTACCACCGAACC AGCAGTGCAGGCCCGCCTCAAGGCCGCCCGCAATGTTATCGGAGCTTTCGCAGGTGAAGGCCCACTTTATCCACCCT CAGATGTCGTCGATGCCTTCGAAGATGCCGATGAGATTCTCGACGAGCACGCCGAAATTCTCCTTGGCGAACCCCTA CCGGATACTCCATCCTGCATCATGGTCACCCTGCCCACCGAAGCCGCCACCGACATTGAACTTGTCCGTGGCTTCGC CAAAAGCGGCATGAATCTAGCTCGCATCAACTGTGCACACGACGATGAAACCG測序結果與原有序列相比相似率為99%，僅發生兩個鹼基的突變，說明構建的同 源片段ldhl-ldh2可用於穀氨酸棒桿菌中Idh基因敲除實驗。二、基因敲除載體構建用EcoRI和HindIII對重組載體pEASY-Tl_ldh進行雙酶切，回收酶切產物，將其與用同樣的內切酶雙酶切處理過的pKlSmobsacB載體進行連接，22°C連接兩小時後轉化 DH5 α大腸桿菌感受態細胞，在卡納黴素的抗性平板上篩選陽性轉化子，提質粒，用限制性 內切酶EcoRI和HindIII進行雙酶切驗證，經酶切獲得1500bp大小的酶切片段，表明獲得 了插入序列正確的重組質粒，命名為pK18mobsacB-ldh(圖3)。實施例2 同源重組後單交換菌株的篩選將構建好的L-乳酸脫氫酶基因敲除型載體pK18mobSaCB-ldh電轉化入穀氨酸棒 桿菌ATCC13032的感受態細胞，其轉化條件為25yF，600Q，2. 5kV電擊，脈衝時間10 12ms,將菌液塗布在25 μ g/ml的卡那黴素的BHIS平板上培養M 48小時，挑選陽性菌 落，並用含25 μ g/ml卡那黴素的10%蔗糖平板對初篩的轉化菌落進行復篩確認，挑取能夠 在卡那黴素抗性平板上生長而不能在含10%蔗糖的卡那黴素抗性平板上生長的菌落，提取 復篩後陽性菌落的基因組DNA，用擴增ldhl-ldh2的上下遊引物dldhl和uldh2進行PCR 擴增。另外用擴增sacB基因部分片段的引物si和s2進行PCR擴增，其擴增結果均與預期 值相符，表明所挑取的陽性菌落為已發生單交換的菌株，即基因敲除載體pKlSmobsacB-ldh 已經整合到C. glutamicum ATCC13032的基因組中，命名整合後的菌株為C. glutamicum Res 167L。實施例3 =Idh基因敲除菌株的篩選將發生單交換的菌株C. glutamicum Resl67L接入到不含有抗生素的液體LB培 養基中過夜培養，然後收集菌液，離心濃縮後塗布在含有10%蔗糖的LB培養基上，挑取 長出的陽性菌株，分別點在含有卡那黴素和不含有卡那黴素的固體LB平板上，挑取在不 含抗生素平板上能夠生長，而在含有抗生素的平板上不能生長的菌落搖菌，進一步用擴 增ldhl-ldh2的上下遊引物dldhl和uldh2進行菌落PCR。另外用擴增Idh的引物和 ldhl-ldh-ldh2片段的內部擴增引物upl和downl進行PCR擴增。三對PCR引物的擴增結 果均與預期值相符，表明篩選的菌株為雙交換菌株，即為Idh基因敲除菌株C. glutamicum Resl67A Idh0實施例4 =Idh基因敲除菌株的應用(1)種子培養基配方(g/L)葡萄糖40，尿素2，酪蛋白胺基酸7，酵母抽提物2，磷 酸氫二鉀0. 5，磷酸二氫鉀0. 5，七水硫酸亞鐵6mg，七水合硫酸鎂0. 5，四水合硫酸錳0. 25， 維生素 BIO. 2mg,生物素 0. 2mg,7jC IOOOmL0 調節 ρΗ7· 5。(2)發酵培養基(g/L)葡萄糖40，磷酸氫二鉀0. 5，磷酸二氫鉀0. 5，七水硫酸亞 鐵6mg，七水合硫酸鎂0. 5，四水合硫酸錳0. 25，維生素B1O. 2mg,生物素0. 2mg,水1000mL。 調節pH7. 5。一、種子的製得配種子培養基，每個IL的錐形瓶中裝300mL培養基，包好以後滅菌。將保存在冰 箱裡的長有菌種的斜面取出，每個試管加ImL無菌水，用接種針將斜面上的菌體刮下製得 菌懸液。在每瓶種子培養基中加5mL菌懸液。30°C，220rpm培養10h，獲得較高菌體濃度的 種子。二、發酵將步驟一培養的種子液5000rpm離心lOmin，收集菌體沉澱，用發酵培養基洗滌一 次，然後重懸在發酵培養基中，倒入裝有1.5L發酵培養基的NBS公司3L自動發酵罐中，使發酵液中菌體的終濃度達到10g/L，發酵過程中自動流加NH4OH來保持pH穩定在7. 5左右。 轉速為50rpm。N2流率為2. 5L/min,以便獲得厭氧環境。通過手動添加0. lmL30%的消泡 劑水溶液來控制泡沫。發酵4 他後取樣，測定發酵產物中D-乳酸的產量最高為20g/L， 純度達到99%以上。
權利要求
1.L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌，其特徵在於所述基因工程菌為穀氨酸棒桿菌 Resl67 Δ Idh (Corynebacterium glutamicum Resl67 Δ ldh)，保藏於中國微生物菌種保藏 管理委員會普通微生物中心，保藏編號CGMCC No. 3973。
2.L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌的構建方法，其特徵是基因工程菌是利用PCR擴增 L-乳酸脫氫酶基因(Idh)上下遊序列ldhl、ldh2，並將克隆片段連接到基因敲除載體上，將 構建好的敲除載體導入到穀氨酸棒桿菌中，利用同源重組的方法將菌株中的L-乳酸脫氫 酶基因(Idh)沉默後篩選獲得基因工程菌。
3.如權利要求2所述的方法，其特徵是步驟如下(1)根據穀氨酸棒桿菌ATCC13032基因組Idh編碼基因的上下遊DNA序列，設計PCR引物；(2)以穀氨酸棒桿菌ATCC13032基因組DNA為模板，擴增Idh基因上下遊片段Idhl和 ldh2，利用重疊PCR進行拼接，構建基因敲除同源片段ldhl-ldh2 ；(3)建立連入ldhl-ldh2的Idh編碼基因的基因敲除載體pK18mobsacB-ldh；(4)電轉化製備穀氨酸棒桿菌ATCC13032的感受態細胞；(5)利用卡那抗性的正向篩選和10%蔗糖培養基的反向篩選，篩選出陽性菌株，PCR驗 證得到L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌C. glutamicum Resl67 Δ ldh。
4.根據權利要求3所述的方法製備方法，其特徵在於所述的PCR的引物序列為 uldhl 5' -CCAAGGTGCCGACACTAAT-3『dldhl 5' -CGGTGATTTCGCAACTCCAACATCTCCTG-3'uldh2 5' -TTGGAGTTGCGAAATCACCGACCACGAGA-3'dldh2 5' -GCTTCCAGACGGTTTCATC-3『si 5' -TTGTGCGTAACTAACTTGC-3『s2 5' -AGATGTTTTCTTGCCTTTG-3『upl 5' -GCTTGTAAAACAGCCAGG-3『downl 5' -GTGGTAGTCAAGCGGGTAG-3『。
5.L-乳酸脫氫酶基因缺失的穀氨酸棒桿菌應用，其特徵在於應用於發酵生產D-乳酸。
全文摘要
本發明涉及L-乳酸脫氫酶基因缺失的工程菌及其構建方法與應用。利用PCR擴增L-乳酸脫氫酶基因(ldh)上下遊序列ldh1、ldh2，並將克隆片段連接到基因敲除載體上，將構建好的敲除載體導入到穀氨酸棒桿菌中，利用同源重組的方法將菌株中的L-乳酸脫氫酶基因(ldh)沉默後篩選獲得基因工程菌C.glutamicum Res167Δldh。本發明利用同源重組的方法使穀氨酸棒桿菌中L-乳酸脫氫酶基因沉默，從而得到產純D-乳酸的基因工程菌。用本發明的工程菌進行乳酸發酵生產，其D-乳酸產量量達到20g/L以上，純度為99％以上。本發明將在D-乳酸的工業化生產中發揮重要作用，具有廣闊的應用前景。
文檔編號C12R1/15GK102102086SQ20101023551
公開日2011年6月22日 申請日期2010年7月22日 優先權日2010年7月22日
發明者李爽, 賈曉強, 聞建平 申請人:天津大學