一種篩選蛋白激酶a抑制劑高通量篩選方法
2023-10-05 23:32:59 2
一種篩選蛋白激酶a抑制劑高通量篩選方法
【專利摘要】本發明發現了一種篩選蛋白激酶A抑制劑高通量篩選方法，包括以下步驟：(1)蛋白激酶A抑制劑篩選模型的建立與優化：進行激酶濃度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗；(2)陽性藥驗證模型可靠性：選用合適濃度的激酶，ATP Km，底物Km，激酶和底物每孔分別加入2μl，再按濃度梯度每孔加入4μl陽性藥，加入2ul ATP開始反應，按優化時間室溫孵育；每孔加入10μl終止液終止反應，室溫孵育1小時後檢測，分析數據得陽性藥IC50；(3)高通量篩選模型驗證：按照上述步驟操作，使用Biomek NXP自動化加樣儀器和Multidrop自動分液器進行加樣，計算Z因子。本發明的優點主要有：1)簡便快捷；2)靈敏度高；3)結果穩定可靠，重現性好，可用於高通量篩選。
【專利說明】一種篩選蛋白激酶A抑制劑高通量篩選方法
【技術領域】
[0001] 本發明屬於藥理學領域，利用均相時間分辨螢光檢測技術，構建了蛋白激酶 A(PKA)抑制劑的高通量篩選模型，用於待測樣品對PKA激酶抑制活性的高通量檢測。
【背景技術】
[0002] 蛋白激酶A是細胞內第二信使的直接靶酶，可以通過磷酸化或脫磷酸化控制信號 轉導途徑中其他酶或蛋白質的活性，介導cAMP的信號轉導。PKA是一種別構酶，由兩個催 化亞基C和兩個調節亞基R所構成。每個調節亞基上有2個cAMP結合位點，催化亞基催化 底物蛋白質某些特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化。調節亞基與催化亞基結合時PKA處於抑制狀 態；cAMP與調節亞基結合後改變調節亞基構型，使其與催化亞基解聚，PKA成為激活態。根 據調節亞基的不同，PKA可以分為RI型、RII型兩種，RI型、RII型又可以根據組織特異性 的不同分為無組織特異性的a型和有組織特異性的0型。研究表明RI促進細胞生長、繁 殖，RII型則與抑制細胞生長和促進細胞分化成熟有關。兩者的正負調節平衡了細胞的生理 功能。除調節代謝外，PKA還參與cAMP介導的轉錄水平調控。當PKA的催化亞基進入細胞 核後，可催化反式作用因子-cAMP效應元件結合蛋白（cAMPresponseelementbinding protein，CREB)中特定絲/蘇氨酸殘基磷酸化。磷酸化的CREB形成同源二聚體，與DNA上 的cAMP應答元件（cAMPresponseelement,CRE)結合，從而激活CRE調控的基因轉錄。另 一方面，活化的PKA可以通過磷酸化Raf-1抑制其活化，封阻MAPK信號通路。因此，研究 PKA激酶抑制劑具有重大意義。
[0003] 時間分辨突光技術（time-resolvedfluorescence,TRF)是基於鑭系元素如銪 (Eu)、釤（Sm)、鏑（Dy)等具有較長螢光壽命的特點發展而來的。當銪螯合物供體與受體之 間距離小於l〇nm，且供體發射光譜與受體激發光譜有重疊時，則發生螢光共振能量轉移，均 相時間分辨突光（homogeneoustime-resolvedfluorescence，HTRF)技術是法國Cisbio 公司利用這一原理進行深入開發的產品。大多數螢光物質的螢光壽命非常短（一般為幾毫 秒），為了避免短暫的螢光幹擾，Cisbio公司利用較長螢光壽命的鑭系螯合物作為螢光能 量供體，受體經過別藻藍蛋白（allophycocyanin)或突光素修飾，供體在能量轉移時就可 以使受體也具有較長的螢光壽命。因此，能量轉移時受體發射光消失時間與供體發射光消 失時間成正比，而與供受體間的距離成反比，這種方法延長了螢光檢測時間，降低了短暫熒 光引起的背景幹擾。
[0004] 目前，已有多種PKA激酶抑制劑的篩選方法，多利用ELISA法來篩選PKA激酶抑制 齊[J，但是此方法費時費力，難以做到高通量篩選。因此，建立方便快捷準確的檢測方法，特別 是體外的功能性檢測在藥物篩選中越來越受到重視。
【發明內容】
[0005] 本發明的目的在於建立一種基於均相時間分辨螢光的PKA激酶抑制劑高通量篩 選模型，具有信噪比高，使用安全，樣品消耗量小的特點。
[0006] 本發明的技術方案：採用均相時間分辨螢光方法建立體外PKA激酶抑制劑高通量 篩選模型，初篩，復篩發現一類具有抑制PKA激酶活性的候選化合物。具體步驟如下：
[0007] 本發明利用均相時間分辨螢光的方法建立了一種PKA激酶抑制劑高通量篩選模 型。
[0008] 步驟一 ：PKA激酶抑制劑篩選模型的建立與優化。
[0009]步驟二：陽性藥驗證模型可靠性。
[0010] 步驟三：高通量篩選模型驗證。
【專利附圖】
【附圖說明】：
[0011] 圖1:PKA激酶濃度梯度優化實驗結果。（n=3,[土W
[0012] 圖2 :PKA激酶溫孵時間優化實驗結果。（n=3,;土
[0013] 圖3 :PKA激酶底物濃度優化實驗結果。（n=J,I土S)
[0014] 圖4 :PKA激酶ATP濃度優化實驗結果。（n=又^土S；
[0015] 圖5:陽性藥十字孢鹼對PKA激酶的抑制曲線圖。（n=3,;土S;
[0016] 圖6 :PKA激酶抑制劑高通量篩選模型信號檢測窗口。
[0017] 圖7:高通量篩選Z'值分布。
【具體實施方式】
[0018] 以下結合【專利附圖】
【附圖說明】本發明的【具體實施方式】：
[0019] 1.PKA激酶抑制劑篩選方法建立
[0020] (1)實驗材料
[0021]PKA激酶檢測試劑盒（Cisbio,法國）、PKA激酶（Invitrogen，美國）、ATP(生興， 中國）、十字孢鹼（碧雲天，中國）、384低體積白板（Coming,美國）、槍頭（Axygen，美國）。
[0022] (2)實驗步驟
[0023] 1)進行PKA激酶濃度梯度、溫孵時間、底物濃度、ATP濃度實驗，見圖1-4。
[0024] 2)待測化合物精確稱量，加入DMS0溶劑成母液，然後使用檢測緩衝液配製待測化 合物溶液至所需濃度，初篩濃度約為1Xl(T3m〇l/L。
[0025] 3)在反應容器中每孔加入PKA激酶溶液2ill，底物溶液2ill，緩衝液或待篩化合 物4iil，ATP2ill。室溫反應1小時。
[0026] 4)每孔加入Estradiol_XL6655U1，Anti-Estradiol_cryptate5U1，室溫孵育 1 小時。
[0027] 5)利用美國貝克曼庫爾特（BeckmanCoulter)公司檢測平臺HTRF模塊分別檢測 665nm和610nm處的突光強度。
[0028] 6)繪製陽性藥十字孢鹼量效曲線並測定其IC5Q值，見圖5。
[0029] 7)採集檢測信號並繪圖，通過信號窗和Z'值確定高通量篩選模型的可靠性，見圖 6,7。
[0030] 2?數據處理
[0031] (1)根據公式計算各孔665nm和610nm處突光強度的比值（Ratio665/610);
[0032] (2)根據公式計算各孔的相對抑制率
[0033]
【權利要求】
1. 一種蛋白激酶A抑制劑高通量篩選模型，其特徵在於，包括步驟： (1) 激酶抑制劑篩選模型的建立與優化； (2) 陽性藥驗證模型可靠性； (3) 高通量篩選模型驗證。
2. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，所述的激酶為蛋白激酶A。
3. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟（1)中進行蛋白激酶A濃度梯度、溫孵 時間、底物濃度、ATP濃度實驗。
4. 如權利要求3所述的方法，其特徵在於，由步驟（1)可得到蛋白激酶A最佳反應所 需的濃度為〇. lng/yl，最佳溫孵時間為30min，最佳底物濃度為151nM，最佳ATP濃度為 0.1359u M〇
5. 如權利要求1所述的方法，其特徵在於，步驟⑵選用步驟⑴所到的合適濃度的激 酶，ATP Km，底物Km;將激酶和底物按1 :2體積混合，每孔加入4iU，再按濃度梯度每孔加入 4 yl陽性藥，最後每孔加入2 iUl ATP開始反應，按優化時間室溫孵育；配製SA-XL665和 TK-Ab，將SA-XL665和TK Ab按體積比1 :1混合，每孔加入10ul終止反應，室溫孵育1小時 後檢測，分析數據得陽性藥半數抑制率IC5(I為16. 3nM。
6. 權利要求1-5中所述任一方法在篩選蛋白激酶A抑制劑的應用。
【文檔編號】G01N21/64GK104458669SQ201310421024
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2013年9月12日 優先權日:2013年9月12日
【發明者】嚴明, 張陸勇, 胡潔, 高鵬 申請人:中國藥科大學