一種柯薩奇病毒A16型(CA16)IgM抗體檢測試紙條的製作方法
2023-05-27 00:40:31
專利名稱：一種柯薩奇病毒A16型(CA16)IgM抗體檢測試紙條的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物檢測領域，具體涉及一種柯薩奇病毒A16型(CA16)IgM抗體檢測試紙條及其應用。
背景技術：
柯薩奇病毒(Coxsackievirus)是一種人類疾病嚴重的致病病原，其感染可以導致許多疾病，從較輕的呼吸道感染疾病，到比較嚴重的心肌炎、心包炎及神經系統的一些疾病，甚至可以引起嬰幼兒死亡。CoxV可分A、B兩組A組病毒有M個血清型，B組有6個血清型。B組所有型別和A組第9型有共同組特異性抗原；B組各型病毒血清型之間有交叉反應，而A組沒有。感染人體的CoxV以A組居多，引起手足口病的CoxV多以A16型、A4型、 A5型、A7型、AlO型、B2型、B5型、B13型為主。CoxV為單股正鏈RNA病毒，分子量為、2 2. 8) X 106，呈球形，直徑20-30nm，無包膜，含有由32個殼微粒形成的二十面體立體對稱的衣殼；耐低溫，對乙醚、乙醇、來蘇爾等消毒液敏感，對熱、乾燥、紫外線等也較敏感。柯薩奇病毒是單股正鏈RNA病毒，病毒顆粒呈球形，為二十面體立體對稱，無包膜。基因組全長為7389 7402個核苷酸，不包括3』端的多聚腺苷酸尾。在柯薩奇病毒基因組的5』端，以共價鍵結合了一個小的蛋白質，稱為毒粒蛋白，叉稱VPg ；而在3』末端有一個多聚腺苷酸尾，其由幾十個到近百個腺苷酸連結而成。柯薩奇病毒RNA基因組的順序依次為5』端非編碼區，Pl區、P2區、P3區和一段3』端非編碼區(圖1)。病毒外殼由結構蛋白VPl、VP2、VP3和VP4構成，其中VPl、VP2、VP3裸露於病毒外殼表面，VP4隱藏於病毒外殼內面。Cox A16的基因組長約7400bp，包括5'及3'端的非編碼區和中間一個大的開放讀碼框(ORF)，依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D 11個基因組成，主要編碼產生病毒結構蛋白和病毒複製所需要的酶類。其中VPl區長891bp，編碼含297個胺基酸的 VPl蛋白。VPl是病毒主要的中和抗原決定簇所在的部位，是腸道病毒血清型的分型依據。 VPl區的核苷酸序列也是腸道病毒基因分型的依據。通過基因工程獲得該抗原的表達蛋白，並用其作為抗原檢測CA16的特異性IgM抗體。目前，手足口病的診斷，除了依據臨床症狀外，實驗室診斷是不可缺如的環節。實驗室的診斷標準如下1)血液檢查的細胞總數一般正常或偏高，分類時淋巴細胞較高，中性粒細胞較低。 2)有中樞神經系統併發症時，腦脊液細胞數可增多，蛋白升高。幻發病後從糞便、咽喉漱口液分離或檢測到相關病毒。4)從腦脊液或皰疹液分離或檢測到相關病毒。幻從早期血清中檢測出相關病毒IgM抗體。6)恢復期血清中和抗體比急性期有>4倍的增長。然而到目前為止，還沒有一種能夠方便、快捷檢測CA16特異性IgM抗體的試紙條的報導。
發明內容
(一 )、要解決的技術問題發明的目的是提供一種使用方便、快捷，用於檢測CA16特異性IgM抗體的試紙條， 檢測感染患者標本中CA16特異性IgM抗體，用於人CA16感染的輔助診斷。(二)、技術方案本發明提供了一種檢測試紙條，它包含以下成分(1)包被CA16病毒抗原VPl和二抗IgG兩個條帶的反應膜；(2)含有膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體的結合物釋放墊。上述二抗可以是抗鼠IgG 二抗，所述反應膜可以是硝酸纖維素膜，所述結合物釋放墊可以是玻璃纖維膜。本發明還提供製備上述試紙條的方法，其包括如下步驟1)將CA16病毒抗原VPl以及二抗IgG在反應膜上分別形成檢測帶和質控帶，備用；2)用膠體金標記抗人IgM單克隆抗體，包被到結合物釋放墊中；3)將製備好的反應膜以及結合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反應支持物組裝成試紙條。本發明還公開了所述試紙條在檢測CA16特異性IgM抗體的應用。本發明通過採用高純度的純化的CA16基因工程抗原VPl和抗鼠IgG分別固相於硝酸纖維膜上(NC膜)，結合膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體，應用膜層析捕獲法的原理檢測人標本中的CA16特異性IgM抗體。(三)、有益效果本發明的試紙條利用膠體金標記技術和膜層析技術，用於快速定性檢測樣本中可能存在的CA16特異性IgM抗體，達到快速篩檢病人，及時診斷治療的目的。可節省大量人力物力，方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和早期診斷，對CA16的感染診斷起到輔助作用。
圖1 :A本發明試紙條的正面示意圖；B本發明試紙條的側面示意圖。其中，1 吸水墊；2 硝酸纖維膜(T :CA16基因工程抗原VPl ；C 包被抗鼠IgG的質控條帶)；3 含有膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體的玻璃纖維膜；4 金標抗體保護膜；5 反應支持物。圖2 檢測結果示意圖。其中，從左至右依次為T、C兩條線陽性；C 一條線陰性； Τ、C兩條線陰性或僅有T線陽性，無效。
具體實施例方式以下實施例進一步說明本發明的內容，但不應理解為對本發明的限制。在不背離本發明精神和實質的情況下，對本發明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬於本發明的範圍。若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規手段。實施例1 :CA16特異性IgM抗體檢測試紙條(膠體金法)(參見圖1)
柯薩奇病毒A16型VPl抗原購於北京安波特基因技術有限公司反應支持物為6. 5cmX0. 4cm PCV板；吸水墊為2cmX0. 4cm的濾油紙； 2. OcmXO. 4cm的硝酸纖維膜依次包被抗鼠IgG(2mg/ml)，CA16抗原VPl (2. 3mg/ml)，含有 0. 4cmX0. 4cm膠體金標記的抗人IgM(標記量25 μ g/ml)的單克隆抗體聚酯膜；樣品墊 2. 7cmX0. 4cm的玻璃纖維；即組成了柯薩奇病毒A16型(CA16) IgM抗體檢測試紙條(膠體金法)。實施例2檢測方法(參見圖2)將患者全血、血漿或血清標本100-150 μ 1直接滴加入實施例1試紙條「4」處，樣品液沿膜上行，10-15分鐘判讀結果。結果如檢測樣本中含有CA16的IgM抗體，則與試紙條上膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體形成相應的複合物，上行與包被在硝酸纖維膜上的CA16特異性抗原VPl結合，形成紅色線條，即在T處形成紅色條帶。無論標本中是否含有相應的抗體，膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體繼續向上爬行與包被在膜上的抗鼠IgG形成紅色沉澱線，即在「C」處形成紅色條帶。此線是質控線，如膠體金失效，此線就不會出現，說明試紙條失效。取150例血清樣本，其中，100例為柯薩奇病毒Α16型臨床陽性血清樣本，50例為正常血清樣本，按上述的檢測方法用實施例1的的試紙條對樣本進行檢測。結果表明，100 例臨床陽性樣本中檢測出99例，正確率為99%，50例正常血清樣本均為陰性，正確率為 100%。
權利要求
1.一種檢測試紙條，其特徵在於，它包含(1)包被CA16病毒抗原VPl和二抗IgG兩個條帶的反應膜；(2)含有膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體的結合物釋放墊。
2.如權利要求1所述的檢測試紙條，其特徵在於，所述反應膜為硝酸纖維素膜。
3.如權利要求1所述的檢測試紙條，其特徵在於，所述結合物釋放墊為玻璃纖維膜。
4.如權利要求1或2所述試紙條，其特徵在於，所述的二抗IgG為抗鼠IgG。
5.一種製備權利要求1 4任一項所述試紙條的方法，其包括如下步驟1)將CA16病毒抗原VPl以及二抗IgG在反應膜上分別形成檢測帶和質控帶，備用；2)用膠體金標記抗人IgM單克隆抗體，包被到結合物釋放墊中；3)將製備好的反應膜以及結合物釋放墊與樣本墊、吸水墊和反應支持物組裝成試紙
6.CA16病毒抗原VPl在膠體金檢測試劑中的應用
7.權利要求1-4之任一所述試紙條在檢測CA16特異性IgM抗體中的應用。
全文摘要
本發明提供了一種用於檢測柯薩奇病毒A16型(CA16)IgM抗體的檢測試紙條。它是在硝酸纖維膜(NC膜)上包被CA16基因抗原(VP1)和抗鼠IgG，結合膠體金標記的抗人IgM單克隆抗體，應用膜層析捕獲法，檢測感染人標本中CA16特異性IgM抗體。應用本發明試紙條檢測，操作簡單、方便、快速、簡捷，不需特殊儀器設備，不需專業培訓，結果清晰易辨，操作簡單，易於推廣，適合基層，適合於現場檢測和早期診斷，對CA16感染診斷起到輔助作用。
文檔編號G01N33/569GK102262156SQ20111015106
公開日2011年11月30日 申請日期2011年6月7日 優先權日2010年6月4日
發明者劉明 申請人:北京莊笛浩禾生物醫學科技有限公司