新型酶標記物穩定劑的製作方法
2023-05-27 16:59:56
專利名稱：新型酶標記物穩定劑的製作方法
技術領域：
本發明是一種可用於以酶標記物作為示蹤劑的免疫檢測產品中，以延長酶標記物溶液保存期的新型酶標記物穩定劑。
背景技術：
免疫檢測分析技術在當今生物醫學領域內得到了廣泛的應用，並已經在臨床診斷、科學研究、環境及衛生檢測、法醫鑑定等諸多部門中成為必備的常規技術手段，發揮著不可替代的作用，因此有關的檢測產品也就具有巨大的市場。目前的檢測技術大多均以酶標記物作為示蹤劑，而其中又以過氧化物酶的聯結物最為常見。由於該酶的主要生化活性是將反應體系中的過氧化物轉變為超氧自由基，因此該酶標記物也會將其溶液中已經存在，或者在貯存、運輸中逐漸產生的少量氧化性物質轉化為超氧自由基，而後者則可強烈地攻擊酶分子本身以及與其相聯結的生物活性分子，從而導致其失活。由於這種「自殺」現象常常導致酶標記物率先失效，因此酶標記物的穩定性也就成了提高該類檢測試劑產品可靠性和有效期的瓶頸。因此不少產品被迫使用凍幹或濃縮冷藏的酶標記物，但這需要用戶通過復溶或稀釋的辦法自行製備工作液，這不僅增加了用戶的工作量，而且肯定也會造成新的操作誤差，同時也不適合於自動化檢測儀器的配套試劑。
近年來，由於人們發現了一些可以在酶標記物溶液中消耗超氧自由基或者穩定聯結物分子，同時又不影響免疫反應和酶—底物反應的物質，如某些具備抗氧化特性的維生素、某些多酚類或多羥基類物質、某些多聚胺基酸等，從而大大延長了酶標記物溶液的保存期，為該類檢測產品直接採用室溫保存的酶標記物工作液奠定了基礎，這些物質被稱為標記物穩定劑(Conjugator Stabilizer)。事實上，能否直接提供含穩定劑的酶標記物工作液，以實現產品的室溫保存並保證該檢測試劑的高可靠性和長有效期，目前已經成了衡量該類產品的技術含量以及生產廠家研發能力和水平的重要標誌。
發明內容
但以往人們的注意力主要集中在如何發現和使用具有抗自由基或穩定聯結物分子特性的特殊物質上，而忽略了通過其它途徑消除酶標記物「自殺」現象的可能性。我們經過多年的研究和實踐發現，有兩種常見的試劑，即蛋白(如BSA)和血紅蛋白(HB)在某些特定的濃度條件下可以有效地延緩酶標記物的失活現象。
其中由於高濃度BSA可以大大降低非特異免疫反應，因此是目前最常用的封閉劑，被廣泛添加於各類免疫檢測試劑中，其使用濃度均在1％以上，而且為了進一步降低非特異反應，往往使用更高濃度的BSA，例如在3％至5％左右。而我們發現BSA對於自由基的產生和消耗具有雙相性，即它既可以代替酶標記物承受自由基的攻擊，從而作為一種自由基清除劑保護酶標記物；同時又可以在自身降解的過程中釋放出過氧化物質乃至自由基，從而加速酶標記物的失活，因此選擇適當的BSA濃度對於保護酶標記物活性非常重要。我們通過大量實驗證實BSA濃度在1％以下時酶標記物活性下降速度相對穩定在一個較低水平上；而在該濃度以上時活性下降速度陡增，如到3％時活性下降速度增加一倍，到10％時活性下降速度增加十倍以上。同時，使用各類其它蛋白代替BSA進行的實驗均顯示出類似的結果，說明該效應與蛋白種類無關，而僅與其濃度密切相關。綜合考慮抑制非特異反應及保護酶標記物活性的要求，實驗證實各類蛋白在酶標記物溶液中的最佳濃度均在0.1％至1％之間。
而由於HB常常存在於商品化的粗製BSA中，同時被認為是可導致非特異信號的幹擾物質，因此長期以來一直力求將其從相關免疫檢測試劑中去除。眾所周知，由於HB具有含鐵卟啉，因此具有較強的自由基催化活性，即通過Fanton氏反應和Haberweiss氏反應導致超氧自由基和羥基自由基之間的轉換，所以我們認為它在抗自由基過程中具有一定的作用。具體講，就是通過上述反應將較長壽命的超氧自由基轉換為較短壽命的羥基自由基，而後者通過攻擊HB自身或附近的分子很快被消耗，在HB和酶標記物濃度均較低的情況下，酶標記物分子在HB分子附近的機率非常小，因此遭受攻擊的可能性也小；同時由於上述反應降低了較長壽命的超氧自由基濃度，從而進一步減少了其攻擊酶標記物分子的可能性。我們通過實驗證實HB濃度在50μg/ml至200μg/ml時酶標記物活性下降速度比不加HB降低50％左右，同時其非特異反應也較弱；而在200μg/ml以上或50μg/ml以下時效果不明顯，且隨著HB濃度增加非特異反應迅速增強。綜合考慮抑制非特異反應及保護酶標記物活性的要求，我們認為HB在酶標記物溶液中的最佳濃度應當在50μg/ml至200μg/ml之間。
綜上所述，我們認為上述兩類物質在特定濃度下，對於提高標記物穩定性效果明顯，且具有成本低、易於配製的特點，可廣泛應用於以酶標記物作為示蹤劑的免疫檢測產品中，從而大大延長了酶標記物溶液的保存期。因此可廣泛應用於臨床診斷、科學研究、環境及衛生檢測、法醫鑑定等諸多部門。
具體實施例方式
以下是該發明的一個實施例，該實施例僅用於說明本發明，但本發明的內容不限於以下在pH7.2的磷酸等滲緩衝液(PBS)中加入5mMol/L維生素C作為抗氧化劑，同時分別加入3％或0.5％的BSA，以及50μg/ml的HB作為酶標記物穩定劑。在加入1∶1000稀釋的辣根過氧化物酶(HRP)與抗前列腺特異性抗原(PSA)抗體聯結物後，將整個溶液置於37℃水浴中進行熱加速實驗，以驗證其效果。四周後測定上述溶液中的酶標記物活性，其結果按加速實驗前的活性為100％計，分別算出各組剩餘活性如下穩定劑種類 剩餘活性(100％)(1)3％BSA26.7(2)0.5％BSA 51.2(3)0.5％BSA+50μg/ml HB 97.權利要求
1.新型酶標記物穩定劑，由蛋白、血紅蛋白、抗自由基物質以及緩衝液組成；其特徵在於該穩定劑使用了特定濃度的蛋白和特定濃度的血紅蛋白。
2.根據權利要求1，特定濃度的蛋白是指在酶標記物溶液中蛋白濃度在0.1％至1％之間。
3.根據權利要求1，特定濃度的血紅蛋白是指在酶標記物溶液中血紅蛋白濃度在50μg/ml至200μg/ml之間。
全文摘要
一種可用於以酶標記物作為示蹤劑的免疫檢測產品中，以延長酶標記物溶液保存期的新型酶標記物穩定劑，由蛋白、血紅蛋白、抗自由基物質以及緩衝液組成。可廣泛應用於臨床診斷、科學研究、環境及衛生檢測、法醫鑑定等諸多部門。
文檔編號G01N33/532GK1743846SQ200410057389
公開日2006年3月8日 申請日期2004年8月30日 優先權日2004年8月30日
發明者楊曉林, 孫旭東 申請人:北京源德生物醫學工程有限公司